Name: inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration
Uploaded: 2020-06-24T14:30:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

Forfatteren takker Doug for hans konstante oppmuntring og urokkelige støtte, samt medlemmene av Melton-laboratoriet for deres nyttige tilbakemeldinger og kommentarer til manuskriptet. Forfatteren vil også takke Harvard Office of Animal Resources (OAR) for deres dedikerte dyrepleie.

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med IACUC (Protokoll #: 11-32) og AAALAC retningslinjer ved Harvard University.
1. Utarbeide løsninger og oppsett for anestesi og gjenoppretting
<ol><li>Forbered fersk 0,1% trikainoppløsning for anestesi og 0,5% sulfamerazin natriumsaltoppløsning for utvinning. Gjør løsningene ved hjelp av vann egnet for axolotl husbandry37 i henhold til godkjente IACUC-protokoller ved den aktuelle forskningsinstitusjonen (modifisert Holtfreters løsning, for eksempel). Forsikre deg om at løsningene er godt blandet og at nok volum er forberedt for å nedsenke hele axolotl.<ol>
<li>For å forberede 0,1% trikainoppløsning, bland 1 g trikain og 1 g natriumbikarbonat med 1 liter vann. Løsningen kan skaleres opp i henhold til denne oppskriften.</li>
		<li>For å tilberede 0,5% sulfamerazin natriumsaltoppløsning, bland 5 g sulfamerazinnatriumsalt med 1 liter vann. Løsningen kan skaleres opp i henhold til denne oppskriften. Sulfamerazinoppløsning er en antibiotisk som forhindrer bakteriell infeksjon under kirurgisk gjenoppretting.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desinfiser det kirurgiske området ved å sprøyte det ned med Clidox-S eller 70% etanol. Steriliser kirurgiske verktøy (tang, disseker saks, vårsaks) ved autoklavering. Hvis du utfører flere operasjoner, må du sterilisere de kirurgiske verktøyene med en varm perlesterilisator mellom dyr.</li>
	<li>For å sette opp utvinningsområdet, plasser en 15 cm Petri-tallerken eller en beholder som passer til axolotlen på toppen av en bøtte fylt med våt is. Fyll Petri-parabolen med et lavt nivå på 0,5% sulfamerazin natriumsaltoppløsning, nok slik at axolotlen ikke ville bli helt nedsenket. Utvinningen på is etter operasjonen vil bremse dyrets bevegelse mens den våkner fra anestesi, slik at det suturerte området kan helbrede relativt uforstyrret. MERK: Dette oppsettet kan tilpasses av forskere avhengig av hvilke materialer de har tilgjengelig.</li>
</ol>2. Utføre hele hudklaff kirurgisk prosedyre
<ol><li>Bedøv axolotlen ved å senke den ned i en beholder med 0,1% trikainoppløsning. Dette vil ta omtrent 15-20 minutter. Forsikre deg om at axolotlen faktisk er fullstendig bedøvet ved å utføre en haleklemme. Hvis det ikke er noe svar fra axolotl, fortsett med operasjonen. MERK: Bruk eldre, større axolotler til denne operasjonen (minst 15 cm). Pass på at axolotlen forblir godt hydrert gjennom hele operasjonen ved å fukte huden regelmessig med axolotlsystemvann ved hjelp av en plastpipette. Sørg for å aseptisk forberede operasjonsstedet ved å vanne området med steril PBS før operasjonen. Dyret bør også plasseres på en steril kirurgisk gardin for prosedyren.</li>
	<li>Utfør en lemamputasjon i den distale enden av de zeugopodiale skjelettelementene ved hjelp av dissekeringssaksen (figur 1.1).</li>
	<li>Bruk vårsaksen til å lage et lite snitt (ca. 2 mm) på den ventrale delen av huden (figur 1.2).</li>
	<li>Bruk tangene til å skrelle huden forsiktig tilbake til omtrent midtlinjen av de zeugopodiale skjelettelementene, og eksponere det underliggende lemvevet (muskel, bein, etc.) (Figur 1.3). Pass på at du ikke skader huden. Se merknad etter trinn 2.8.</li>
	<li>Amputer det eksponerte underliggende lemvevet midt på zeugopoden ved hjelp av kirurgisk saks (figur 1.4).</li>
	<li>Skyv muskelvevet tilbake med den kirurgiske saksen og trim det eksponerte beinet. MERK: Dette er nødvendig for å sikre forbedret helbredelse og også for å øke suksessen til operasjonen, da fremspringende bein kan hakkes mot den suturerte klaffen og forstyrre integriteten til en intakt hudklaff senere.</li>
	<li>Bruk tangene til å trekke forsiktig den ekstra hud med full tykkelse over amputasjonsplanet for å dekke det eksponerte underliggende vevet og suturen på plass ved å koble til den ventrale huden med full tykkelse (figur 1.5).</li>
	<li>Suturer de resterende høyre og venstre sidene av hudklaffen inn i de underliggende ventrale delene av intakt hud. Dette kan gjøres enten ved å suturere sidene av klaffen på en "kryss-kryss" måte (anbefales) (Figur 1.6-1.9), eller bare suturere rett inn i ventral hud. Bruk tang og buet vårsaks til suturering. Pass på at ingen eksponert underliggende vev kan sees og at suturer er bundet tett (knutet minst tre ganger). MERK: Det er viktig at den intakte huden ikke skades i trinn 2.4, 2.7-2.8. Vi har funnet ut at skade på full tykkelse huden har blitt korrelert med mislykkede operasjoner, da skadeområdene fortsatt kan danne en liten sår epidermis. Hvis det er mulig, prøv å bruke et kjedeligere par tang når du gir full tykkelse hudklaff.</li>
	<li>Utfør en amputasjon på den kontralaterale lemmen (valgfri intern dyrekontroll) ved å amputere den på midten av zeugopod-nivået med kirurgisk saks. Skyv muskelvevet tilbake med kirurgisk saks og trim det eksponerte beinet. MERK: En intern kontralateral lemkontroll kan gjøres for bedre å vurdere suksessen til operasjonen under trinn 4 i samme dyr. Amputasjon av samme lem i et eget dyr kan imidlertid også brukes til å tjene som en kontroll.</li>
</ol>3. Postoperativ utvinning og pleie
<ol><li>Når operasjonen er fullført, plasser et Kimwipe eller sterilt papirhåndkle på bunnen av beholderen eller Petri-parabolen for å våte det. Plasser dyret i beholderen på våt is og vikle forsiktig de eksponerte endene av Kimwipe eller papirhåndkleet rundt toppen av dyret for å holde det godt hydrert med sulfamerazinoppløsning. La på våt is i 30 minutter til 1 time for å sikre minimal bevegelse under utvinning fra anestesi.</li>
	<li>Plasser dyret i en statisk beholder med 0,5% sulfamerazinoppløsning. Axolotler må forbli i denne løsningen de første 24 timene for å forhindre infeksjon.</li>
	<li>Plasser axolotlen i normalt systemvann og overvåk helsen daglig. Forsikre deg om at ingen suturer faller ut hver dag, da dette kan føre til en liten sår epidermis forming som vil forvirre resultatene. MERK: Pass på at husbeholderen har god plass til at axolotlen kan bevege seg rundt og minimere sjansene for at den suturerte lemmen på axolotlen kan komme i kontakt med sidene av beholderen. Dette vil bidra til å sikre at suturene holder seg på plass, spesielt i løpet av den første uken etter operasjonen.</li>
</ol>4. Vurdering av suksessen til operasjonen under et stereomikroskop
MERK: Vi anbefaler å sjekke dyr under et stereomikroskop minst en gang i uken for å vurdere integriteten til hele hudklaffen og suksessen til operasjonen.
<ol><li>Bedøv axolotl i 0,1% trikain som i trinn 2.1. Pass på at det er god plass i beholderen til at axolotlen kan bevege seg rundt.</li>
	<li>Hvis du inspiserer i løpet av de to første ukene etter operasjonen, inspiser den suturerte lemmen ved hjelp av et stereomikroskop for å sikre at ingen suturer har dukket opp, og at en klar tynn såreplemmer ikke er synlig noe sted. Hvis inspeksjon på den tredje uken etter operasjonen eller senere, sørg for at en blastema ikke har dannet seg og sammenlign med hvordan den normale kontrollen amputert lem (enten fra samme dyr eller et annet dyr) har utviklet seg under regenerering (dvs. om en blastema har dannet seg).</li>
	<li>Når du er ferdig, returner axolotl til normale systemvann og husdyrholdsforhold.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li><li>Leigh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+of+the+blastema+niche+in+regenerating+adult+axolotl+limbs+at+single-cell+resolution.">Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 9 (1), 5153 (2018).</li><li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+limb+blastema:+cellular+and+molecular+mechanisms+driving+blastema+formation+and+limb+regeneration+in+tetrapods.">The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods.</a> Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).</li><li>Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+system+for+limb+regeneration.">A stepwise model system for limb regeneration.</a> Developmental Biology. 270 (1), 135-145 (2004).</li><li>Tsai, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+interplay+between+progenitors+and+immune+cells+in+tissue+regeneration+and+homeostasis.">The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis.</a> Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024 (2020).</li><li>Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+adult+salamander+limb+regeneration.">Macrophages are required for adult salamander limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+choreography+of+appendage+regeneration.">The molecular and cellular choreography of appendage regeneration.</a> Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).</li><li>Campbell, L. J., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+epidermis+formation+and+function+in+urodele+amphibian+limb+regeneration.">Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li><li>Sandoval-Guzman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+differences+in+dedifferentiation+and+stem+cell+recruitment+during+skeletal+muscle+regeneration+in+two+salamander+species.">Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).</li><li>Tassava, R. A., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+injury,+nerves,+and+the+wound+epidermis+during+the+initiation+of+amphibian+limb+regeneration.">The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration.</a> Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).</li><li>Hay, E. D., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+blastema+in+regenerating+limbs+of+the+newt+Triturus+viridescens.+An+autoradiographic+study+using+tritiated+thymidine+to+follow+cell+proliferation+and+migration.">Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration.</a> Developmental Biology. 3, 26-59 (1961).</li><li>Christensen, R. N., Tassava, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+epithelial+cap+morphology+and+fibronectin+gene+expression+in+regenerating+axolotl+limbs.">Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs.</a> Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).</li><li>Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+epidermal+cell+migration+in+wound+healing+during+limb+regeneration+in+the+adult+newt,+Notophthalmus+viridescens.">Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens.</a> American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).</li><li>Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+role+of+the+basement+membrane+and+dermal+fibers+during+newt+limb+regeneration.">Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration.</a> Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).</li><li>Singer, M., Saltpeter, M. M., Zarrow, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growth in Living Systems. , (1961).</li><li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+adult+newt+limb+regeneration+of+partial+and+complete+skin+flaps+over+the+amputation+surface.">Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).</li><li>Tassava, R. A., Garling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+responses+in+larval+axolotl+limbs+with+skin+grafts+over+the+amputation+surface.">Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).</li><li>Tornier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Kampf+der+Gewebe+im+Regeneratbei+Begunsiigung+der+Hautregeneralion.">Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion.</a> Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).</li><li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+inhibition+following+limb+amputation+and+immediate+insertion+into+the+body+cavity.">Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity.</a> Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+apical+cap+removal+on+limb+regeneration+in+Amblystoma+larvae.">The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+limb+regeneration+in+urodele+larvae+by+localized+irradiation+with+ultraviolet+light.">The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).</li><li>Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+is+a+dual+regulator+of+wound+epidermis+development+and+inflammation+during+the+initiation+of+limb+regeneration.">Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Elewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+and+editing+the+Pleurodeles+waltl+genome+reveals+novel+features+of+tetrapod+regeneration.">Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration.</a> Nature Communications. 8 (1), 2286 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Looso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+de+novo+assembly+of+the+newt+transcriptome+combined+with+proteomic+validation+identifies+new+protein+families+expressed+during+tissue+regeneration.">A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration.</a> Genome Biology. 14 (2), 16 (2013).</li><li>Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reference+transcriptome+and+inferred+proteome+for+the+salamander+Notophthalmus+viridescens.">A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens.</a> Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).</li><li>Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+illuminates+the+nature+of+the+intracellular+interaction+in+a+vertebrate-algal+symbiosis.">Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+for+the+study+of+early+processes+of+retinal+regeneration+in+the+adult+newt,+Cynops+pyrrhogaster.">A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> PLoS One. 9 (10), 109831 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).</li><li>Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptomics+to+enable+a+plethodontid+salamander+(Bolitoglossa+ramosi)+for+limb+regeneration+research.">Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research.</a> BMC Genomics. 19 (704), (2018).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR-Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Joven, A., Elewa, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+salamanders.">Model systems for regeneration: salamanders.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl.">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne artikkelen beskriver en protokoll for å utføre fulle hudklaffoperasjoner i axolotl lemmer for å hemme sår epidermis dannelse. Mens denne operasjonen er relativt enkel og teknisk reproduserbar sammenlignet med andre metoder for hemming av sår epidermis dannelse, er det flere kritiske trinn som kan påvirke suksessen til operasjonen. For det første, når du trekker den intakte fulle hudklaffen over det eksponerte underliggende vevet, er det viktig at hele tykkelseshuden ikke blir skadet på noen måte. Skader på hudklaffen kan fortsatt føre til dannelse av en liten sår epidermis, noe som kan resultere i en liten blastema-lignende utvekst. For det andre, sørg for at suturer ikke faller ut under postoperativ omsorg, da dette også kan føre til dannelse av en liten sår epidermis. Til dette punktet er det viktig å minimere den potensielle kontakten mellom den suturerte lemmen og eventuelle overflater, spesielt i løpet av den første uken etter operasjonen. Flere måter å forhindre dette innebærer boliger og bedøvelse av axolotl i en stor nok beholder slik at axolotl har god plass til å bevege seg rundt etter operasjonen.
Denne operasjonen har også flere begrensninger. Kanskje den mest bemerkelsesverdige er at suksessen til operasjoner bare kan vurderes på to måter: ved å bruke dissekeringsområdet i løpet av de to første ukene av operasjonen for å søke etter fravær av sårepær og / eller sjekke om en blastema dannes innen 3 uker. Selv om disse metodene er effektive, er de relativt lave gjennomstrømning. Utviklingen av fremtidige transgene reporter-axolotler for sår epidermis-spesifikke markører kan hjelpe til med raskere screening for vellykkede versus mislykkede operasjoner. Videre er denne operasjonen vanskeligere å utføre på yngre dyr, da den intakte huden er mer skjøre. Bruk av sub-voksen eller voksen axolotls anbefales dermed.
Mens denne operasjonen opprinnelig ble utviklet i N. viridiscens19, har den lett blitt tilpasset for axolotls25,39 og kan sannsynligvis brukes på andre salamanderarter også. I sum vil bruk av denne teknikken på fremtidige lemregenereringsstudier gi forskere mulighet til både å utvikle flere verktøy for å adressere sår epidermisbiologi og identifisere de underliggende mekanismene som driver funksjonen i å initiere blastemadannelse.

Siden Lazzaro Spallanzani rapporterte det i 17681, har salamander lemregenerering vært et av de mest studerte naturlige regenerative fenomenet som har begeistret biologer i århundrer. Vellykket lem regenerering hengsler på dannelsen, utvekst og etterfølgende mønster av en undifferentiated cellulær struktur kjent som blastema. Forskere har gjort betydelige fremskritt i å forstå den cellulære sammensetningen av blastema samt hvilke støttende vev og celletyper som er nødvendige for dannelsen2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Likevel forblir de koordinerte signalmekanismene mellom forskjellige vev og celletyper som fører til initiering av blastemadannelse dårlig forstått.
Et sentralt krav for vellykket blastemadannelse og regenerering er sårepidermis, et forbigående og spesialisert epitel som dekker amputasjonsplanet innen 12 timer etter amputasjon10. Etter amputasjon migrerer epitelceller fra den intakte huden proksimalt til skaden raskt over amputasjonsplanet for å danne et tynt sårepitelet14. Etter hvert som blastema dannes i de følgende ukene, utvikler de tidlige sårepidermis seg til en tykkere epitelsignalstruktur kalt den apikale epitelhetten (AEC)15. Mens normal hud med full tykkelse inneholder både et epitel- og dermalt lag atskilt med en basal lamina, består sårepidermis/AEC bare av et epitellag og mangler en basal lamina16,17. Fraværet av basal lamina og dermis gir direkte kontakt mellom sårepitelcellene og det underliggende vevet, noe som letter toveis signalering mellom de to rommene som er kritiske for både blastemadannelse og vedlikehold17,18.
Klassiske eksperimentelle studier utviklet ulike innovative kirurgiske metoder for å sondere sår epidermis / AEC-funksjon og nødvendighet ved å hemme dannelsen. Disse metodene inkluderte suturing19 eller podning full tykkelse hud20,21 over amputasjonsplanet, umiddelbart suturere amputert lem inn i kroppshulen22, og kontinuerlig daglig fjerning eller bestråling av tidlig sår epidermis og AEC23,24. Til sammen etablerte disse eksperimentene ikke bare betydningen av sårepæren / AEC, men bestemte også ytterligere sine roller i tidlig vevs histolyse, samt opprettholde stamcelleproliferasjon og blastemal utvekst13 gjennom regenerering.
Imidlertid var disse tidligere studiene i stor grad begrenset til histologisk farging samt tritierte tymidinpulser for å spore celleproliferasjon. Faktisk har det bare nylig blitt gjort å revidere disse klassiske eksperimentene med moderne sekvenseringsteknologier og funksjonelle teknikker i salamandere, og har ført til oppdagelsen av ytterligere roller for sårepermis i modulering av betennelse og ECM-nedbrytning / avsetning i tidlige stadier av regenerering25. Med utgivelsen av ulike salamandergenom- og transkripsjonssekvenser26,27,28,29,30,31,32,33,34, samt det voksende antallet funksjonelle metoder tilgjengelig i salamanderarter11,35,36,37,38 , forskere er nå godt posisjonert til å begynne å avdekke molekylære mekanismer som driver sår epidermis dannelse, funksjon og AEC utvikling.
Dessverre er flere av disse klassiske metodene som brukes til å hemme sår epidermisdannelse teknisk utfordrende, og presenterer vanskeligheter for reproduserbarhet mellom biologiske repliker i samme eksperiment. For eksempel kan det være utfordrende å opprettholde hudtransplantasjoner, da grafts til slutt kan falle av vertslemmen og fjerning av såreplemmen / AEC daglig er vanskelig uten å skade det underliggende vevet. Videre er det utfordrende å suturere amputert lem i kroppshulen og krever også ytterligere skade på innsettingsstedet. På den annen side er suturering full tykkelse hud umiddelbart over amputasjonsplanet relativt enkelt, teknisk reproduserbart, og introduserer minimal vevsskade. Denne fulle hudklaffen (FSF) kirurgisk metode ble tidligere utviklet av Anthony Mescher i 1976 i voksne newts (Notophthalmus viridiscens). Han viste at FSF-operasjonen hemmet sårepidermisdannelse og funksjon ved å forby både epitelcellemigrasjon over amputasjonsplanet og direkte kontakt mellom epitelceller og underliggende vev.
Her vises denne kirurgiske prosedyren trinn for trinn ved hjelp av axolotllemmen. Kombinert med moderne molekylære og sekvenserende teknologier, kan denne teknikken vise seg å være svært nyttig for forskere å utdype vår forståelse av sår epidermis / AEC formasjon og funksjon under lem regenerering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Curved spring scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Need two pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>SUT-1000-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamerazine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>127-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

Klassiske eksperimenter i salamander regenerativ biologi i løpet av forrige århundre har lenge fastslått at sår epidermis er en avgjørende signalstruktur som dannes raskt etter amputasjon og er nødvendig for lemregenerering. Imidlertid har metoder for å studere sin presise funksjon på molekylært nivå de siste tiårene vært begrenset på grunn av en paucity av presise funksjonelle teknikker og genomisk informasjon tilgjengelig i salamandermodellsystemer. Spennende, den nylige mengden sekvenseringsteknologier kombinert med utgivelsen av ulike salamandergenomer og fremveksten av funksjonelle genetiske testmetoder, inkludert CRISPR, gjør det mulig å besøke disse grunnleggende eksperimentene på nytt ved enestående molekylær oppløsning. Her beskriver jeg hvordan du utfører den klassisk utviklede full hudklaff (FSF) kirurgi i voksne axolotler for å hemme sår epidermis formasjon umiddelbart etter amputasjon. Sårepidermis dannes normalt via distal migrasjon av epitelceller i huden proksimalt til amputasjonsplanet for å forsegle såret fra ytre miljø. Operasjonen innebærer umiddelbart suturering full tykkelse hud (som inkluderer både epidermale og dermale lag) over amputasjonsplanet for å hindre epitelcellemigrasjon og kontakt med underliggende skadet mesenchymal vev. Vellykkede operasjoner resulterer i hemming av blastemadannelse og lemregenerering. Ved å kombinere denne kirurgimetoden med moderne nedstrøms molekylære og funksjonelle analyser, kan forskere begynne å avdekke molekylære underlag av sår epidermis funksjon og biologi under lem regenerering.

Denne kirurgiske protokollen vil tillate fullstendig inhibering av sår epidermis dannelse (figur 1) og til slutt, lem regenerering. En vellykket kirurgi resulterer i ingen blastemadannelse på ca 2-3 uker avhengig av dyrets størrelse, mens kontrollregenerering av lemmer bør danne et blastema normalt.
Forskere bør inspisere den suturerte lemmen med blotte øye hver 2-3 dager for å sikre at suturene ikke har spratt ut og at det ikke dannes et blastema. Hvis en eller flere av suturene spretter ut, kan det fortsatt dannes en sårepitemis som resulterer i enten et lite eller stort blastema og en mislykket operasjon (figur 2). I tillegg bør forskere inspisere den suturerte lemmen minst en gang i uken under et stereomikroskop for å sikre at en tynn såreplemmer ikke er tydelig hvor som helst på amputasjonsoverflaten. Til sammenligning bør forskere også undersøke kontrollen som regenererer lem som skal ha en sår epidermis over amputasjonsplanet og danne et blastema over 2-3 uker. Sårepitemis vil virke tynn og klar, mens den normale huden vil virke mer ugjennomsiktig og blekrosa (nesten hvit), lysegul eller mørkegrønn i henholdsvis leucistic, albino eller wildtype axolotls.
Hvis forskere ønsker å samle vev før blastemaformasjonsstadiene ved 2-3 uker, bør de inspisere de suturerte lemmer før prøvetaking for å sikre at suturene forblir på plass og at det ikke dannes en liten sårepitemis. I tillegg kan seksjonering sagitalt gjennom det suturerte lemvevet og utføre histologiske analyser når som helst også verifisere tilstedeværelsen av dermis fra hele hudklaffen som omkranser hele amputasjonsplanet og fraværet av en såreplemmer (figur 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk for trinnene i full hudklaffkirurgi. Trinnene i protokollen er nummerert og diagrammet her. De stiplede linjene angir amputasjonsplanene i trinn 1 og 3 i protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Figur 2: Eksempler på vellykkede og mislykkede fulle hudklaffoperasjoner. Representativt brightfield bilde av en lem som har gjennomgått en vellykket kirurgi (venstre), en mislykket kirurgi (høyre), og en kontroll regenererende lem (ingen kirurgi) ved 25 dager etter amputasjon (dpa). Den vellykkede operasjonen har et flatt amputasjonsplan der hele hudklaffen ble suturert over, mens den mislykkede operasjonen har et lite blastema som utvikler seg. Pilspisser betegner amputasjonsplanet og hvite stiplede linjer er der for å hjelpe visualisering av fraværet av et blastema i vellykket kirurgi og tilstedeværelse av blastemas i mislykket kirurgi og kontroll regenererende lemmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Figur 3: Histologisk farging av normale regenererende og FSF-suturerte lemmer. (A-B') Representative brightfield bilder av picro-mallory farget seksjoner fra regenerering (A-A') og suturert axolotl lemmer (B-B') på 7 dpa. Innsett i A og B vises i henholdsvis A og B. Det kollagentunge dermale laglinjene og dekker hele amputasjonsplanet i suturerte lemmer. Amputasjonsplan er betegnet med pilspisser i A-B. Skalastenger representerer 500 μm. Dette tallet ble tilpasset fra Tsai et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Denne artikkelen beskriver hvordan du utfører en kirurgisk metode for å hemme sår epidermis dannelse under axolotl lem regenerering ved umiddelbart suturering full tykkelse hud over amputasjonsplanet. Denne metoden gjør det mulig for forskere å undersøke såreptermis funksjonelle roller i de tidlige stadiene av lemregenerering.

Hemming av sår epidermis formasjon via full hudklaff kirurgi under axolotl lem regenerering

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Langsiktig, høy oppløsning Confocal Time Lapse Imaging av<em&gt; Arabidopsis cotyledon</em&gt; Epidermis under spiring

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder for Skin såre og Analyser for Wound Responses i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Kvantifisere leukocytter Egress via lymfekar fra Murine huden og svulster

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...