Name: inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration
Uploaded: 2020-06-24T14:30:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

Författaren tackar Doug för hans ständiga uppmuntran och orubbliga stöd, liksom medlemmarna i Melton-labbet för deras hjälpsamma feedback och kommentarer om manuskriptet. Författaren vill också tacka Harvard Office of Animal Resources (OAR) för deras dedikerade djurvård.

Alla djurförsök utfördes i enlighet med IACUC (protokoll #: 11-32) och AAALAC riktlinjer vid Harvard University.
1. Förbereda lösningar och installation för anestesi och återhämtning
<ol><li>Förbered färsk 0,1% trikainlösning för anestesi och 0,5% sulfamerazine natriumsaltlösning för återhämtning. Gör lösningarna med vatten lämpliga för axolotlhållning37 enligt godkända IACUC-protokoll vid relevant forskningsinstitution (modifierad Holtfreters lösning, till exempel). Se till att lösningarna är väl blandade och att tillräckligt med volym bereds för att sänka hela axolotl.<ol>
<li>För att förbereda 0,1% trikainlösning, blanda 1 g trikain och 1 g natriumbikarbonat med 1 L vatten. Lösningen kan skalas upp enligt detta recept.</li>
		<li>För att förbereda 0,5% sulfamerazine natriumsaltlösning, blanda 5 g sulfamerazine natriumsalt med 1 L vatten. Lösningen kan skalas upp enligt detta recept. Sulfamerazine lösning är en anti-biotic som kommer att förhindra bakteriell infektion under kirurgisk återhämtning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sanera det kirurgiska området genom att spruta ner det med Clidox-S eller 70% etanol. Sterilisera kirurgiska verktyg (tång, dissekeringssax, vårsax) genom autoklavering. Om du utför flera operationer, se till att sterilisera de kirurgiska verktygen med en varm pärlasteriliserare mellan djur.</li>
	<li>För att ställa in återhämtningsområdet, placera en 15 cm Petri-skål eller någon behållare som passar axolotlen ovanpå en hink fylld med våt is. Fyll Petri-skålen med en låg nivå av 0,5% sulfamerazine natriumsaltlösning, tillräckligt så att axolotl inte skulle vara helt nedsänkt. Återhämtningen på is efter operationen kommer att bromsa djurets rörelse medan den vaknar från anestesi, vilket gör att det suturerade området kan läka relativt ostört. OBS: Den här inställningen kan anpassas av forskare beroende på vilket material de har tillgängligt.</li>
</ol>2. Utföra hela hudklaff kirurgiskt ingrepp
<ol><li>Bedöva axolotlen genom att dränka den i en behållare med 0,1% trikainlösning. Detta tar cirka 15-20 minuter. Se till att axolotl verkligen är helt sövd genom att utföra en svansnypa. Om det inte finns något svar från axolotl, fortsätt med operationen. OBS: Använd äldre, större axolotls för denna operation (minst 15 cm i storlek). Se till att axolotl förblir välhydrerad under hela operationen genom att väta huden regelbundet med axolotlsystemvatten med hjälp av en plastpipett. Se till att aseptiskt förbereda operationsstället genom att bevattna området med steril PBS före operationen. Djuret ska också placeras på ett sterilt kirurgiskt draperi för proceduren.</li>
	<li>Utför en lemamputation i den distala änden av zeugopodial skelettelementen med hjälp av den dissekerande saxen (figur 1.1).</li>
	<li>Använd vårsaxen och gör ett litet snitt (ca 2 mm) på hudens ventrala del (figur 1.2).</li>
	<li>Använd tången och skala försiktigt tillbaka huden till ungefär mittlinjen i zeugopodial skelettelementen och exponera de underliggande vävnaderna (muskler, ben, etc.) (Figur 1.3). Se till att inte skada huden. Se anmärkning efter steg 2.8.</li>
	<li>Amputera de exponerade underliggande extremitetsvävnaderna i mitten av zeugopoden med hjälp av kirurgisk sax (figur 1.4).</li>
	<li>Tryck tillbaka muskelvävnaden med den kirurgiska saxen och trimma det exponerade benet. OBS: Detta är nödvändigt för att säkerställa förbättrad läkning och även för att öka framgången för operationen som utskjutande ben kan vara ojämn mot den sutured fliken och störa integriteten hos en intakt hudklaff senare.</li>
	<li>Använd tången och dra försiktigt ut den extra fulltjockleken över amputationsplanet för att täcka de exponerade underliggande vävnaderna och suturen på plats genom att ansluta till huden med ventrala full tjocklek (figur 1.5).</li>
	<li>Suturera de återstående högra och vänstra sidorna av hudklaffen i de underliggande ventrala delarna av intakt hud. Detta kan göras genom att antingen sutsäkra sidorna av klaffen på ett "criss-cross" sätt (rekommenderas) (figur 1.6-1.9), eller helt enkelt suturing rakt in i ventrala huden. Använd tången och den böjda fjädersaxen för suturering. Se till att inga exponerade underliggande vävnader kan ses och att suturer är bundna tätt (knutna minst tre gånger). OBS: Det är viktigt att den intakta huden inte skadas i steg 2.4, 2.7-2.8. Vi har funnit att skador på huden med full tjocklek har korrelerats med misslyckade operationer, eftersom skadeområdena fortfarande kan bilda ett litet sår epidermis. Försök om möjligt att använda ett mattare par tångar när du ger hela tjockleken hudklaff.</li>
	<li>Utför en amputation på kontralateral lem (valfri intern djurkontroll) genom att amputera den på mid-zeugopod nivå med kirurgisk sax. Tryck tillbaka muskelvävnaden med kirurgisk sax och trimma det exponerade benet. OBS: En intern kontralateral lem kontroll kan göras för att bättre bedöma framgången för operationen under steg 4 i samma djur. Amputation av samma lem i ett separat djur kan dock också användas för att fungera som en kontroll.</li>
</ol>3. Postoperativ återhämtning och vård
<ol><li>När operationen är klar, placera en Kimwipe eller steril pappershandduk längst ner i behållaren eller Petri-skålen för att blöta den. Placera djuret i behållaren på våt is och linda försiktigt de exponerade ändarna av Kimwipe eller pappershandduken runt djurets topp för att hålla det välhydrerat med sulfamerazinlösning. Lämna på våt is i 30 minuter till 1 timme för att säkerställa minimal rörelse under återhämtning från anestesi.</li>
	<li>Placera djuret i en statisk höljesbehållare med 0,5% sulfamerazinlösning. Axolotls måste finnas kvar i denna lösning under de första 24 timmarna för att förhindra infektion.</li>
	<li>Placera axolotl i normalt systemvatten och övervaka hälsan dagligen. Se till att inga suturer faller ut varje dag eftersom detta kan resultera i att ett litet sår epidermis bildas som kommer att förvirra resultaten. OBS: Se till att höljet har gott om utrymme för axolotl att röra sig och minimera risken för att den suturerade delen på axolotl kan komma i kontakt med behållarens sidor. Detta kommer att bidra till att säkerställa att suturerna förblir på plats, särskilt under den första veckan efter operationen.</li>
</ol>4. Bedömning av operationens framgång under ett stereomikroskop
OBS: Vi rekommenderar att du kontrollerar djur under ett stereomikroskop minst en gång i veckan för att bedöma integriteten hos hela hudluckan och operationens framgång.
<ol><li>Bedöva axolotl i 0,1% trikain som i steg 2.1. Se till att det finns gott om plats i behållaren för axolotl att flytta runt.</li>
	<li>Vid inspektion under de första två veckorna efter operationen, inspektera den suturerade delen med hjälp av ett stereomikroskop för att se till att inga suturer har poppat ut och att ett klart tunt sår epidermis inte är synligt någonstans. Om du inspekterar den tredje veckan efter operationen eller senare, se till att ett blästerem inte har bildats och jämför med hur den normala kontroll amputerade delen (antingen från samma djur eller ett annat djur) har utvecklats under regenerering (dvs. om ett blastema har bildats).</li>
	<li>När du är klar, återför axolotl till normala systemvatten- och djurhållningsförhållanden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li><li>Leigh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+of+the+blastema+niche+in+regenerating+adult+axolotl+limbs+at+single-cell+resolution.">Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 9 (1), 5153 (2018).</li><li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+limb+blastema:+cellular+and+molecular+mechanisms+driving+blastema+formation+and+limb+regeneration+in+tetrapods.">The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods.</a> Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).</li><li>Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+system+for+limb+regeneration.">A stepwise model system for limb regeneration.</a> Developmental Biology. 270 (1), 135-145 (2004).</li><li>Tsai, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+interplay+between+progenitors+and+immune+cells+in+tissue+regeneration+and+homeostasis.">The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis.</a> Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024 (2020).</li><li>Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+adult+salamander+limb+regeneration.">Macrophages are required for adult salamander limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+choreography+of+appendage+regeneration.">The molecular and cellular choreography of appendage regeneration.</a> Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).</li><li>Campbell, L. J., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+epidermis+formation+and+function+in+urodele+amphibian+limb+regeneration.">Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li><li>Sandoval-Guzman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+differences+in+dedifferentiation+and+stem+cell+recruitment+during+skeletal+muscle+regeneration+in+two+salamander+species.">Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).</li><li>Tassava, R. A., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+injury,+nerves,+and+the+wound+epidermis+during+the+initiation+of+amphibian+limb+regeneration.">The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration.</a> Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).</li><li>Hay, E. D., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+blastema+in+regenerating+limbs+of+the+newt+Triturus+viridescens.+An+autoradiographic+study+using+tritiated+thymidine+to+follow+cell+proliferation+and+migration.">Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration.</a> Developmental Biology. 3, 26-59 (1961).</li><li>Christensen, R. N., Tassava, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+epithelial+cap+morphology+and+fibronectin+gene+expression+in+regenerating+axolotl+limbs.">Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs.</a> Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).</li><li>Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+epidermal+cell+migration+in+wound+healing+during+limb+regeneration+in+the+adult+newt,+Notophthalmus+viridescens.">Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens.</a> American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).</li><li>Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+role+of+the+basement+membrane+and+dermal+fibers+during+newt+limb+regeneration.">Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration.</a> Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).</li><li>Singer, M., Saltpeter, M. M., Zarrow, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growth in Living Systems. , (1961).</li><li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+adult+newt+limb+regeneration+of+partial+and+complete+skin+flaps+over+the+amputation+surface.">Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).</li><li>Tassava, R. A., Garling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+responses+in+larval+axolotl+limbs+with+skin+grafts+over+the+amputation+surface.">Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).</li><li>Tornier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Kampf+der+Gewebe+im+Regeneratbei+Begunsiigung+der+Hautregeneralion.">Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion.</a> Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).</li><li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+inhibition+following+limb+amputation+and+immediate+insertion+into+the+body+cavity.">Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity.</a> Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+apical+cap+removal+on+limb+regeneration+in+Amblystoma+larvae.">The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+limb+regeneration+in+urodele+larvae+by+localized+irradiation+with+ultraviolet+light.">The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).</li><li>Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+is+a+dual+regulator+of+wound+epidermis+development+and+inflammation+during+the+initiation+of+limb+regeneration.">Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Elewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+and+editing+the+Pleurodeles+waltl+genome+reveals+novel+features+of+tetrapod+regeneration.">Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration.</a> Nature Communications. 8 (1), 2286 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Looso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+de+novo+assembly+of+the+newt+transcriptome+combined+with+proteomic+validation+identifies+new+protein+families+expressed+during+tissue+regeneration.">A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration.</a> Genome Biology. 14 (2), 16 (2013).</li><li>Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reference+transcriptome+and+inferred+proteome+for+the+salamander+Notophthalmus+viridescens.">A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens.</a> Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).</li><li>Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+illuminates+the+nature+of+the+intracellular+interaction+in+a+vertebrate-algal+symbiosis.">Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+for+the+study+of+early+processes+of+retinal+regeneration+in+the+adult+newt,+Cynops+pyrrhogaster.">A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> PLoS One. 9 (10), 109831 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).</li><li>Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptomics+to+enable+a+plethodontid+salamander+(Bolitoglossa+ramosi)+for+limb+regeneration+research.">Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research.</a> BMC Genomics. 19 (704), (2018).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR-Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Joven, A., Elewa, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+salamanders.">Model systems for regeneration: salamanders.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl.">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Denna artikel beskriver ett protokoll för att utföra full huden lock operationer i axolotl lemmar att hämma sår epidermis bildas. Medan denna kirurgi är relativt enkel och tekniskt reproducerbar jämfört med andra metoder för att hämma sår epidermis bildas, det finns flera kritiska steg som kan påverka framgången för operationen. För det första, när man drar den intakta fulla hudklaffen över de exponerade underliggande vävnaderna, är det av största vikt att hela tjocklekshuden inte skadas på något sätt. Skador på hudklaffen kan fortfarande leda till bildandet av ett litet sår epidermis, vilket kan resultera i en liten blastema-liknande utväxt. För det andra, se till att suturer inte faller ut under postoperativ vård eftersom detta också kan leda till bildandet av ett litet sår epidermis. Till denna punkt är det viktigt att minimera den potentiella kontakten mellan den suturerade delen och eventuella ytor, särskilt under den första veckan efter operationen. Flera sätt att förhindra detta innebär att man inhyser och bedövar axolotl i en tillräckligt stor behållare så att axolotl har gott om utrymme att röra sig efter operationen.
Denna operation har också flera begränsningar. Kanske det mest anmärkningsvärda är att framgången för operationer endast kan bedömas på två sätt: använda dissekeringsområdet under de första två veckorna av operationen för att söka efter frånvaro av ett sår epidermis och / eller kontrollera om en blastema bildas inom 3 veckor. Även om dessa metoder är effektiva är de relativt låga data flöde. Utvecklingen av framtida transgenic reporter axolotls för sår epidermis-specifika markörer kan bidra till snabbare screening för framgångsrika kontra misslyckade operationer. Dessutom är denna operation svårare att utföra på yngre djur eftersom den intakta huden är mer ömtålig. Användning av axolotls för vuxna eller vuxna rekommenderas därför.
Medan denna kirurgi ursprungligen utvecklades i N. viridiscens19, har den lätt anpassats för axolotls25,39 och kan sannolikt tillämpas på andra salamanderarter samt. Sammanfattningsvis, tillämpa denna teknik på framtida lem regenerativa studier kommer att ge forskare möjlighet att både utveckla fler verktyg för att ta itu med sår epidermis biologi och identifiera de underliggande mekanismerna som driver dess funktion i att initiera blastema bildas.

Sedan Lazzaro Spallanzani rapporterade det 17681 har salamander lem regenerering varit en av de mest väl studerade naturliga regenerativa fenomen som har enamored biologer i århundraden. Framgångsrika lem regenerering beror på bildandet, utväxt och efterföljande mönstring av en odifferentierad cellulär struktur som kallas blastema. Forskare har gjort betydande framsteg i förståelsen av blastemas cellulära sammansättning samt vilka stödjande vävnader och celltyper som är nödvändiga för dess bildande2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Ändå är de samordnade signalmekanismerna mellan olika vävnader och celltyper som leder till initiering av blastemabildning fortfarande dåligt förstådda.
Ett viktigt krav för framgångsrik blastema bildandet och regenerering är såret epidermis, en transient och specialiserad epitel som täcker amputation planet inom 12 timmar efter amputation10. Efter amputation migrerar epitelceller från intakt hud proximal till skadan snabbt över amputationsplanet för att bilda ett tunt sår epitelium14. Som blastema bildas under de följande veckorna, utvecklas det tidiga sår epidermis till en tjockare epitelial signalering struktur kallas den apikala epitelial cap (AEC)15. Medan normal full tjocklek hud innehåller både ett epitelial och dermal lager åtskilda av en basal lamina, såret epidermis/AEC består endast av ett epitelial lager och saknar en basal lamina16,17. Frånvaron av basal lamina och dermis möjliggör direkt kontakt mellan sår epitelcellerna och de underliggande vävnaderna, vilket underlättar dubbelriktad signalering mellan de två facken som är avgörande för både blastemabildning och underhåll17,18.
Klassiska experimentella studier utformade olika innovativa kirurgiska metoder för att undersöka sår epidermis/AEC funktion och nödvändighet genom att hämma dess bildandet. Dessa metoder inkluderade suturering19 eller ympning av full tjocklek huden20,21 över amputation planet, omedelbart suturing den amputerade delen i kroppen hålighet22 och kontinuerlig daglig borttagning eller bestrålning av det tidiga såret epidermis och AEC23,24. Sammantaget etablerade dessa experiment inte bara betydelsen av såret epidermis/AEC, men också ytterligare fastställt dess roller i tidig vävnad histolys samt upprätthålla stamceller spridning och blastemal utväxt13 under hela regenerering.
Dessa tidigare studier var dock till stor del begränsade till histologiska färgning samt tritiated tymidin pulser för att spåra cell spridning. Faktum är att återbesöka dessa klassiska experiment med modern sekvenseringsteknik och funktionella tekniker i salamandrar har nyligen gjorts och har lett till upptäckten av ytterligare roller för sår epidermis i modulering inflammation och ECM nedbrytning /deposition under tidiga stadier av regenerering25. Med frigöraren av olika salamandergenom och transkriptomsekvenser26,27,28,29,30,31,32,33,34, liksom det spirande antalet funktionella metoder som finns tillgängliga hos salamanderarter11,35,36,37,38 är forskare nu väl positionerade för att börja nysta upp de molekylära mekanismer som driver sår epidermisbildning, funktion och AEC-utveckling.
Tyvärr är flera av dessa klassiska metoder som används för att hämma sår epidermis bildas tekniskt utmanande, vilket ger svårigheter för reproducerbarhet mellan biologiska replikat i samma experiment. Till exempel, upprätthålla huden ympkvistar kan vara utmanande som ympkvistar kan så småningom falla av värd lem och avlägsnande av såret epidermis/AEC dagligen är svårt utan att skada de underliggande vävnaderna. Dessutom är det utmanande att sutsäkra den amputerade delen i kroppshålan och kräver också ytterligare skada på insättningsplatsen. Å andra sidan är suturering av full tjocklek hud omedelbart över amputationsplanet relativt enkelt, tekniskt reproducerbart och introducerar minimal vävnadsskada. Denna full huden lock (FSF) kirurgiska metod utvecklades tidigare av Anthony Mescher 1976 i vuxna newts (Notophthalmus viridiscens). Han visade att FSF kirurgi hämmade sår epidermis bildas och funktion genom att förbjuda både epitelial cell migration över amputation plan och direkt kontakt mellan epitelial celler och de underliggande vävnaderna.
Här visas detta kirurgiska ingrepp steg för steg med hjälp av axolotl lem. Tillsammans med moderna molekylära och sekvensering teknik, denna teknik kan visa sig vara till stor hjälp för forskare att fördjupa vår förståelse av sår epidermis/AEC bildandet och funktion under lem regenerering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Curved spring scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>15009-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>886-86-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>Need two pairs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>SUT-1000-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfamerazine sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>127-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

Klassiska experiment i salamander regenerativ biologi under det senaste århundradet har länge fastställt att såret epidermis är en avgörande signalstruktur som bildas snabbt efter amputation och krävs för lem regenerering. Metoder för att studera dess exakta funktion på molekylär nivå under de senaste decennierna har dock begränsats på grund av en brist på exakta funktionella tekniker och genomisk information som finns tillgänglig i salamandermodellsystem. Spännande, den senaste tidens mängd sekvenseringsteknik i kombination med frisättningen av olika salamandergenom och tillkomsten av funktionella genetiska testmetoder, inklusive CRISPR, gör det möjligt att återbesöka dessa grundläggande experiment med oöverträffad molekylär upplösning. Här beskriver jag hur man utför den klassiskt utvecklade full hud lock (FSF) kirurgi i vuxna axolotls för att hämma sår epidermis bildas omedelbart efter amputation. Såret epidermis bildas normalt via distala migration av epitelceller i huden proximalt till amputation planet för att försegla såret från den yttre miljön. Kirurgi innebär omedelbart suturering full tjocklek huden (som inkluderar både epidermal och dermal lager) över amputation planet för att hindra epitelial cell migration och kontakt med underliggande skadade mesenchymal vävnader. Framgångsrika operationer resulterar i hämning av blastema bildandet och lem regenerering. Genom att kombinera denna kirurgimetod med samtida nedströms molekylära och funktionella analyser kan forskare börja upptäcka molekylära understöd av sår epidermis funktion och biologi under lem regenerering.

Detta kirurgiska protokoll kommer att möjliggöra fullständig hämning av sår epidermis bildandet (figur 1) och i slutändan lem regenerering. En framgångsrik kirurgi resulterar i ingen blastema bildas i cirka 2-3 veckor beroende på djurets storlek, medan kontroll regenererande lemmar bör bilda en blastema normalt.
Forskare bör inspektera den suturerade lemmen med blotta ögat var 2-3 dag för att se till att suturerna inte har poppat ut och att ett blastema inte bildas. Om en eller flera av suturerna dyker upp kan en sår epidermis fortfarande bildas vilket resulterar i antingen ett litet eller stort blastema och en misslyckad operation (figur 2). Dessutom bör forskare inspektera den suturerade lemmen minst en gång i veckan under ett stereomikroskop för att se till att en tunn sår epidermis inte är uppenbar någonstans på amputationsytan. Som jämförelse bör forskare också undersöka den regenererande delen som ska ha ett sår epidermis över amputationsplanet och bilda ett blastema under 2-3 veckor. Såret epidermis kommer att se tunn och klar, medan den normala huden kommer att visas mer ogenomskinlig och blekrosa (nästan vit), ljusgul eller mörkgrön i leucistic, albino eller wildtype axolotls, respektive.
Om forskare vill samla vävnad före blastemabildningsstadierna vid 2-3 veckor, bör de inspektera de suturerade extremiteterna före provtagningen för att se till att suturerna förblev på plats och att ett litet sår epidermis inte bildas. Dessutom kan sektionering sagitally genom den suturerade lemvävnaden och utföra histologiska analyser när som helst också verifiera förekomsten av dermis från hela hudklaffen som omger hela amputationsplanet och frånvaron av en sår epidermis (figur 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Bild 1: Schematisk av stegen i den fullständiga hudklaffkirurgin. Protokollets steg numreras och diagram övergår här. De prickade linjerna betecknar amputationsplan vid steg 1 och 3 i protokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Figur 2: Exempel på lyckade och misslyckade full hudklaffoperationer. Representativ brightfield bild av en lem som har genomgått en framgångsrik kirurgi (vänster), en misslyckad kirurgi (höger) och en kontroll regenererande lem (ingen kirurgi) vid 25 dagar efter amputation (dpa). Den framgångsrika operationen har ett platt amputation plan där hela huden lock sutured över, medan den misslyckade kirurgi har en liten blastema utvecklas. Arrowheads betecknar amputation plan och vita prickade linjer är där för att underlätta visualisering av frånvaron av en blastema i framgångsrika kirurgi och närvaro av blastemas i misslyckade kirurgi och kontroll regenererande lemmar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Figur 3: Histologisk färgning av normala regenererande och FSF suturerade lemmar. (A-B') Representativa brightfield bilder av picro-mallory färgade sektioner från regenererande (A-A') och sutured axolotl lemmar (B-B') vid 7 dpa. Indrag i A och B visas i A' respektive B'. Det kollagentunga hudskiktet linjer och täcker hela amputationsplanet i suturerade lemmar. Amputationsplan betecknas med pilspetsar i A-B. Skalstänger representerar 500 μm. Denna siffra har anpassats från Tsai et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Denna artikel beskriver hur man utför en kirurgisk metod för att hämma sår epidermis bildas under axolotl lem regenerering genom att omedelbart suturera full tjocklek huden över amputation planet. Denna metod gör det möjligt för forskare att undersöka de funktionella rollerna för såret epidermis under de tidiga stadierna av lem regenerering.

Hämning av sår epidermisbildning via full hudklaffkirurgi under Axolotl Lem Regeneration

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

En omvänd Genetisk strategi till Test Funktionell Redundans under fosterutvecklingen

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Ödet Kartläggning av mänskliga embryonala stamcellslinjer som Teratom Bildning

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

Bedöma Signalering egenskaper Ectodermal epitel Under Kraniofaciala utveckling

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Hela montering Immunhistokemisk Analys för Embryonala Limb Skin kärlsystemet: ett modellsystem för studier Vascular Avgrening morfogenes i Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Långsiktigt hög upplösning Confocal Time lapse avbildning av<em&gt; Arabidopsis Hjärtblad</em&gt; Epidermis under groning

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Metoder för Skin såra och Analyser för Wound-svar i<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Kvantifiera leukocyt avstigning via lymfkärl från murina hud och tumörer

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...