Name: minimum volume vitrification of immature feline oocytes
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 og af Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Vi vil også gerne takke Dr. MariaGiorgia Morselli for hendes bidrag til de hermed afbildede eksperimenter og til billederhvervelse.

De procedurer, der herved er afbildet, blev ikke godkendt af etisk materiale, da katteovgestokkene blev indsamlet på dyrlægeklinikker som biprodukter fra ejerbesøgte rutinemæssige ovariektomomi eller ovariohysterektomi.
1. Oocyte samling
<ol><li>Før du starter forsøgene, skal du forberede løsninger til æggestok- og oocytkollektion. Ovgesegenopsamlingsopløsningen til klargør med fosfatbufferet saltvand (PBS) med en blanding af antibiotika og antimykotika (100 IE/ml penicillin G natr...

<ol>
	<li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+social+implications+of+embryo+cryopreservation.">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li><li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification.">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li><li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat.">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li><li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids.">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li><li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+and+mammalian+gametes.">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li><li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence.">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li><li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose.">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li><li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen.">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes.">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li><li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes.">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).</li><li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes.">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li><li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos:+The+Cryotop+method.">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).</li><li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification,+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer.">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li><li>Galiguis, J., G&#243;mez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes.">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li><li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique.">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions.">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329 (2019).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture:+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes.">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li><li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature,+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro.">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li><li>Cobo, A., Kuwayama, M., P&#233;rez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remoh&#237;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method.">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li><li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cryobiology.">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li><li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation+by+vitrification.">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li><li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification.">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li><li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation.">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li><li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos:+current+problems+and+future+perspectives.">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li><li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes.">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li><li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+(Felis+catus)+in+reproductive+season.">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li><li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viability+of+Serval+(Leptailurus+serval)+and+Pallas+Cat+(Felis+manul)+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method.">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li></ol>

Oocyt kryopræservering er en afgørende germplasme bevarelse teknik, især i taxa, hvor mange arter er truede, såsom Felidae familie. I dette manuskript blev der fremlagt en enkel og feltvenlig protokol for vitrificering af umodne katteoocytter. Laboratoriemedier, understrætning af mindstevolumen og uddannet personale er nøglefaktorerne for denne metodes succes, som gør det muligt at opnå levedygtige oocytter konsekvent og gentagne gange, som det fremgår af de repræsentative resultater, der hermed rapporteres.</p...

Kryopræservering er blevet et vigtigt trin i assisteret reproduktion teknikker (ARTs). Hos mennesker, det giver mulighed for bevarelse af frugtbarhed eller udsættelse af forældreskab af medicinske eller personlige årsager. Hos dyr er det nødvendigt at overvinde afstand og tid i planlagte parringer, især i husdyr og kæledyr, eller at bevare genetisk materiale af værdifulde emner i bevaringsprogrammer, især i vilde truede arter. Gamete kryopræservering er det bedste valg, når de personer, der skal opdrættes ikke er blevet valgt endnu, eller for at undgå etiske spørgsmål i forbindelse med embryo frysning, især i humanmedicin1. Spermatozoer er relativt nemme at bevare og give tilfredsstillende resultater efter optøning, men oocytter, på grund af deres strukturelle funktioner, kan være mere komplekse at opbevare. Faktisk, den lave overflade / volumen forholdet, samt tilstedeværelsen af zona pellucida omkring ooplasma, begrænser flytning af kryoprotektanter og vand på tværs afcellen 2. Desuden, i husdyr, herunder felids, de er kendetegnet ved en lipid-rige cytoplasma, som menes at gøre dem mere følsomme over for kryopræservering3.
De fleste felids er truet, og den indenlandske kat bruges som en model til at udvikle protokoller for germplasm bevarelse takket være tilgængeligheden af gonader fra rutinemæssig ovariektomi. Hos vilde dyr kan gonader fås efter elektive operationer eller (hyppigere) post mortem, og umodne (germinale vesikel) gameter kan hentes. Hormonel stimulation har til formål at opnå modne (metafase II) oocytter er ikke så almindeligt som i menneskelige ARTs på grund af de etiske spørgsmål og art- og individuel-specifikke svar på behandlinger4.
Derfor har udviklingen af kryopræserveringsstrategier fokuseret på umodne gametter, som normalt kan hentes efter sjældne individers uventede eller pludselige død. Fra et biologisk synspunkt, er der nogle forskelle i kryopræservering af umodne eller modne gameter, hver har sine fordele. For det første er DNA mere beskyttet i umodne oocytter, hvis germinale vesikel indeholder kromosomer omgivet af en nuklear membran, mens den meiotiske spindel af metafase II oocytter kunne være mere sårbar over for kryoinjuries5. For det andet, kold-induceret cytoskeleton skader kan påvirke spindel rotation, polære krop ekstrudering, pronuclear migration og cytokinese, som kan have forskellige virkninger i henhold til oocyt udviklingsmæssige fase, påvirker meiose progression eller post-befrugtning begivenheder. Endelig, og måske vigtigst af alt, mens modne oocytter er klar til at blive befrugtet, er umodne gameter afhængige af støtte fra de omkringliggende cumulus celler til at gå gennem nukleare og cytoplasmatisk modning6, og det er grunden til, at hele cumulus-oocyte komplekser (COCs) er cryopreserved. Men tabet af cumulus celler og / eller tab af funktionelle forbindelse mellem gamet og de omkringliggende somatiske celler er sandsynligvis den mest skadelige virkning af kryopræservering af umodne cocs.
Blandt kryopræservering teknikker, vitrification er en, der kan anvendes lettere i marken betingelser. Sammenlignet med langsom (eller kontrolleret hastighed) frysning, vitrification er hurtigere og kræver ikke specifikt udstyr, såsom en programmerbar fryser. For at opfylde de tre grundlæggende principper for vitrifikation (dvs. høj viskositet, forbundet med høj kryobeskyttende koncentration, små mængder og ultra-hurtig temperatur fald), flere medier og støtter især er blevet udviklet og anvendes i katte til både umodne og modne oocytter. Begyndende med simple sugerør7, enheder blev derefter udviklet til at nå "Minimum volumen" mål. Cryoloop8, åbne trukket sugerør (OPS)9, plast tagrender (modificeret halm)10 og cryotubes11 er blevet brugt, indtil en mere effektiv enhed (dvs. Cryotop) blevansat 11, forbedre overlevelse og meiose genoptagelse. Cryotop (Supplerende figur 1) er en kommercielt tilgængelig støtte, som er blevet det valgfrie åbne system til vitrifikation. Udviklet til vitrifikation af menneskelige oocytter og embryoner, den består af en lille filmstrimmel fastgjort til en hård plast holder, beskyttet af en plastrør hætte under opbevaring12. Takket være dens anvendelighed og den ekstreme reduktion i vitrifikation volumen (så lidt som 0,1 μL), hvilket også fører til ekstremt hurtig køling og opvarmning satser, denne vitrification støtte er i stigende grad blevet anvendt i flere arter, herunder den indenlandske kat, hvor det har været anvendt med en række medier13,14,15,16,17.
Formålet med dette manuskript er at beskrive en samling-vitrification-warming protokol, med mindre ændringer fra den oprindeligt udviklet til menneskelige oocytter, som beskæftiger laboratorie-made medier og kommercielle støtter for minimum volumen vitrification og kan let anvendes i marken betingelser for kryopræservering af umodne feline COCs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipettes &#38; tips</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpels</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Size 10 is usually ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beak</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.CR</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9129</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Advised lenght 230 mm (100+130)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gobelets</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>According to the canisters of the storage tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating stage</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All heating stages are ok, as long as they can keep 38&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repro plate</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.K-2</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage tank</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Any regularly filled tank is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam/nitrogen resistant box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called &#34;Cooling Rack&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timers</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All timers which can be set on times until 9 minutes are ok</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimum volume vitrification of immature feline oocytes

I vilde dyr 'bevarelse programmer, er gamet bankvirksomhed afgørende for at beskytte genetiske ressourcer af værdifulde individer og sjældne arter og for at fremme bevarelse af biodiversiteten. I felids, er de fleste arter truet af udryddelse, og indenlandske racer bruges som en model for at øge effektiviteten af protokoller for kimplasma bank. Blandt oocyt kryopræservering teknikker, vitrification er mere og mere populær i menneskers og veterinære assisteret reproduktion. Cryotop vitrifikation, som i første omgang blev udviklet til menneskelige oocytter og embryoner, har vist sig at være velegnet til kat oocytter. Denne metode giver flere fordele, såsom gennemførligheden i marken betingelser og hastigheden af proceduren, som kan være nyttige, når flere prøver skal behandles. Effektiviteten afhænger imidlertid i høj grad af operatørens færdigheder, og der er behov for standardisering inden for og på laboratoriet samt personaleuddannelse. Denne protokol beskriver minimum volumen vitrifikation af umodne katteoocytter på en kommerciel støtte i en trin for trin felt-venlige protokol, fra oocyt indsamling til opvarmning. Efter protokollen, bevarelse af oocyt integritet og levedygtighed ved opvarmning (så højt som 90%) kan forventes, selv om der stadig er plads til forbedringer i efteropvarmning modning og embryonale udvikling resultater.

Efter kat oocyt vitrifikation og opvarmning i henhold til denne protokol (Figur 1 og Supplerende Figur 1), langt de fleste gameter overleve. Efter vitrifikation kan rentabiliteten blandt andre teknikker vurderes ved det optiske mikroskop som morfologiskintegritet 22 eller ved hjælp af vitale pletter. En af sidstnævnte er fluoresceindiacetat /propidium iodid (FDA/PI), som gør det muligt at identificere levedygtige (lysegrøn fluorescens) og døde ce...

Watch this Scientific Journal Video about Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes at JoVE.com

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Dette manuskript beskriver en protokol for den mindste volumen vitrifikation af umodne kat oocytter med laboratorie-made medier på kommercielle støtter. Det dækker hvert skridt fra oocyt isolation fra ex vivo gonader til vitrifikation og opvarmning.

Minimum volumen vitrifikation af umodne Feline Oocytter

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Denne protokol er nyttig til langsigtet bevarelse af feline oocytter gennem en kryopræservering teknik kendt som med vitrificering, som er afgørende for frugtbarhed og bevarelse af biodiversiteten i dyrearter. De største fordele ved vitrificering er dens hastighed, da den kan fuldføres på mindre end 17 minutter og dens gennemførlighed under feltbetingelser, hvis flydende nitrogen er til rådighed. Den hjemlige kat er en levedygtig model for vilde truede katte.Udvikling og optimering af kryopræservering protokoller ville gøre det muligt at etablere gamete biobanker for feline bevarelse programmer. Begynd med at forberede en Repro vitrification plade med tre koniske brønde i en række. Der tilsættes 20 mikroliter ækvilibreringsopløsning til den første brønd og 300 mikroliter vitrificeringsopløsning til den anden og tredje brønd.For at ekvilibrere cumulus oocyt komplekser, eller p-piller, skal du bruge en lille-boring pipette til at overføre en eller flere komplekser til bunden af den første brønd. Tilsæt langsomt 20 mikroliter af ækvilibreringsopløsning til dråbens kant og vent i tre minutter, og tilsæt derefter yderligere 240 mikroliter af ækvilibreringsopløsning, og vent i ni minutter. Mens du venter, forberede en kasse med flydende nitrogen og mærke en vitrification støtte med eksperimentet eller kat identifikationskode.Sæt kassen og støtte i nærheden af stereomikroskop. Efter ækvivalenser af p-piller udføres vitrificering på mindre end 90 sekunder. For at vitrify p-pc'erne skal du fylde pipetten med den lille borepipette med vitrificeringsopløsningen fra den anden brønd.Tag de p-piller fra bunden af den første brønd og flytte dem til overfladen af den anden brønd. Vask pipetten med vitrificeringsopløsningen, og flyt derefter p-pillerne til et andet område af brønden og bland den omgivende opløsning. Fyld pipetten med opløsning fra et andet område af brønden.Flyt de p-piller og bland mediet omkring dem med pipetten. Gentag denne proces en gang til. Dernæst vaskes pipetten med vitrificeringsopløsningen fra den tredje brønd, og brug den til at flytte p-pillerne til bunden af den tredje brønd.Igen blandes den omgivende opløsning. Efter at have fyldt pipetten med opløsning fra et andet område af brønden, skal du flytte p-pillerne og blande opløsningen. Gentag denne proces.Fyld pipettespidsen med vitrificeringsopløsningen fra et andet område af brønden og brug den til at indlæse p-pillerne på vinstrimlen på vitrificeringsstøtten tæt på spidsen, og indsugning derefter det overskydende medium. Spring straks vitrificeringsstøtten i flydende nitrogen og brug klemmer til at lukke den, og sørg for, at den forbliver nedsænket. Opbevar de lastede vitrificeringsstøtter i et bæger og opbevar dem i en beholder med flydende nitrogentank indtil opvarmning.Placer varmestadiet tæt på stereomikroskopet og tænd det til 38 grader Celsius. Varm låget af en petriskål oven på scenen, og overfør derefter vitrificeringsstøtterne fra lagertanken til en kasse med flydende nitrogen. Forbered en række af en Repro plade for hver vitrificering støtte, der skal opvarmes.Der tilsættes 300 mikroliter fortyndingsopløsning til den første brønd og 300 mikroliter vaskeopløsning til den anden og tredje brønd. Tag optøningsopløsningen ud af inkubatoren og smid 100 mikroliter på låget af petriskålen. Brug klemmerne til at åbne vitrificeringsstøtten inde i det flydende kvælstof.Placer petriskålen under stereomikroskopet, hent derefter hurtigt vitrificeringsstøtten, og sænk strimmel i dråben, og flyttede det, indtil alle p-piller løsner sig. Fjern støtten fra dråben, så snart den er tom, men lad p-pillerne stå i optøningsopløsningen i et minut. Fyld en pipette med fortyndingsopløsning, og brug den til at flytte p-pillerne fra optøningsopløsningen til bunden af den første brønd med fortyndingsopløsning.Lad de amerikanske p-piller være der i tre minutter. Vask pipetten med vaskeopløsningen fra den anden brønd, og tag derefter p-pillerne og flyt dem til bunden af den anden brønd. Vent i fem minutter.Vask pipetten med en opløsning fra den tredje brønd og brug den til at flytte p-pillerne fra den anden brønd til overfladen af den tredje brønd. Vent på, at de to p-piller rører bunden af den tredje brønd. Gentag derefter processen med et andet brøndområde.Når du er færdig, vaske pipetten med kultur medium og flytte oocytter til en kultur parabol. Langt de fleste gameter overleve efter oocyt vitrification og opvarmning i henhold til denne protokol. Et repræsentativt billede af en levedygtig forglasset opvarmet kat cumulus oocyt kompleks farves med fluorescein diacetat og propidium joodid er vist her.Denne tabel viser overlevelsesprocenten efter vitrificering, som viser data efter opvarmning af oocytter beregnet til in vitromodning. Ud af 435 oocytter overlevede 395 og scorede en samlet 90,8 % efter opvarmning. Men, nogle morfologiske ændringer kan mærkes efter opvarmning.De hyppigste morfologiske abnormiteter er ændringer i ooplasma form og granulering, delvis eller undertiden total tab af cumulus celler, og zona pellucida frakturer. Når du forsøger denne procedure, skal du huske at forberede medier på forhånd, så de er den rigtige temperatur før brug, og for at følge protokoltemperaturer og -tidspunkter for at undgå celletoksicitet. Protokollen kan også anvendes på oocytter af andre arter.Hvis det lykkes, kan dette også bidrage til kim plasm bank for bevarelse af biodiversiteten i truede katte.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Ekspression af fluorescerende proteiner i<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Af mRNA Injektion i befrugtede oocytter

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolering og karakterisering af muse Antral Oocyter Baseret på nucleolar chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Modificeret MicroSecure Vitrifikation: En sikker, enkel og meget effektiv Kryopræservering Procedure for Menneskerettigheder Blastocyster

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Analyse af kromosomsegregation, histonacetylering og spindelmorfologi i hesteococytter

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Generering af genetisk modificerede mus gennem mikroinjektion af oocytter

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

En neurale netværk-baseret identifikation af udviklingshæmmede kompetente eller inkompetente mus fuldt udvokset oocyter

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalt invasivt Embryo Transfer og embryo Vitrificering på det optimale embryo stadie i kanin model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

Human blastocyst biopsi og Forvitrifikation

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

In Vitro Kultur strategi for Oocytter fra Early Antral Follikel hos Kvæg

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Adskillelse af follikulære celler og oocytter i æggestokkene Follikler af zebrafisk

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...