Name: minimum volume vitrification of immature feline oocytes
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes at JoVE.com

Dit werk werd mede ondersteund door EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 en door Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). We willen ook dr. MariaGiorgia Morselli bedanken voor haar bijdrage aan de experimenten die hierbij worden afgebeeld en aan de beeldaanwinst.

De afgebeelde procedures hebben geen ethische goedkeuring ondergaan, aangezien kattenstokken bij veterinaire klinieken werden verzameld als bijproducten van door de eigenaar gevraagde routineovariectomie of ovariohysterectomie.
1. Oocytencollectie
<ol><li>Bereid voor aanvang van de experimenten oplossingen voor eierstok- en eicelcollectie. Bereid eierstokverzameloplossing met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een mengsel van antibiotica en antimycotica (100 IU/mL penicilline G natriu...

<ol>
	<li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+social+implications+of+embryo+cryopreservation.">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li><li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification.">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li><li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat.">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li><li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids.">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li><li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+and+mammalian+gametes.">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li><li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence.">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li><li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose.">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li><li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen.">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes.">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li><li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes.">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).</li><li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes.">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li><li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos:+The+Cryotop+method.">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).</li><li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification,+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer.">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li><li>Galiguis, J., G&#243;mez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes.">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li><li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique.">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions.">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329 (2019).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture:+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes.">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li><li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature,+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro.">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li><li>Cobo, A., Kuwayama, M., P&#233;rez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remoh&#237;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method.">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li><li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cryobiology.">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li><li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation+by+vitrification.">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li><li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification.">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li><li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation.">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li><li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos:+current+problems+and+future+perspectives.">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li><li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes.">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li><li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+(Felis+catus)+in+reproductive+season.">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li><li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viability+of+Serval+(Leptailurus+serval)+and+Pallas+Cat+(Felis+manul)+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method.">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li></ol>

Oocyte cryopreservatie is een cruciale kiemplasma behoud techniek, vooral in taxa waar veel soorten worden bedreigd, zoals Felidae familie. In dit manuscript werd een eenvoudig en veldvriendelijk protocol voor de vitrificatie van onrijpe katoocyten gepresenteerd. Laboratoriummedia, ondersteuning van het minimale volume vitrification en opgeleid personeel zijn de belangrijkste factoren voor het succes van deze methode, die het mogelijk maakt om consequent en herhaaldelijk levensvatbare eicellen te verkrijgen, zoals blijkt...

Cryopreservatie is uitgegroeid tot een belangrijke stap van geassisteerde reproductietechnieken (ART's). Bij mensen, het maakt het behoud van de vruchtbaarheid of uitstel van het ouderschap om medische of persoonlijke redenen. Bij dieren is het noodzakelijk om afstand en tijd in geplande paringen te overwinnen, vooral bij boerderijdieren en huisdieren, of om genetisch materiaal van waardevolle onderwerpen in instandhoudingsprogramma's te behouden, met name bij bedreigde diersoorten. Gamete cryopreservatie is de beste keuze wanneer de te fokken personen nog niet zijn gekozen of om ethische problemen in verband met het invriezen van embryo's te voorkomen, vooral in de menselijke geneeskunde1. Spermatozoa zijn relatief eenvoudig te bewaren en geven bevredigende resultaten na ontdooien, maar eicellen, vanwege hun structurele kenmerken, misschien complexer op te slaan. Inderdaad, de lage oppervlakte /volume verhouding, evenals de aanwezigheid van de zona pellucida rond de ooplasma, beperkt de beweging van cryoprotectiva en water over de cel2. Bovendien worden ze bij huisdieren, waaronder feliden, gekenmerkt door een lipiderijk cytoplasma, waarvan wordt gedacht dat ze gevoeliger zijn voor cryopreservatie3.
De meeste feliden worden bedreigd, en de binnenlandse kat wordt gebruikt als een model om protocollen te ontwikkelen voor het behoud van kiemplasma dankzij de beschikbaarheid van gonaden van routine ovariectomie. Bij wilde dieren kunnen geslachtsklieren worden verkregen na electieve operaties of (vaker) postmortem,en onrijpe (kiemvellen) kunnen worden opgehaald. Hormonale stimulatie gericht op het verkrijgen van volwassen (metafase II) eicellen is niet zo gebruikelijk als in de menselijke ARTs vanwege de ethische kwesties en de soort- en individueel-specifieke reactie op behandelingen4.
Daarom is de ontwikkeling van cryopreservatie strategieën is gericht op onvolwassen gameten, die meestal kan worden opgehaald na de onverwachte of plotselinge dood van zeldzame individuen. Vanuit biologisch oogpunt zijn er enkele verschillen in de cryopreservatie van onrijpe of volwassen gameten, elk met zijn voordelen. Ten eerste is DNA beter beschermd in onrijpe eicellen, waarvan de kiemvezel chromosomen bevat die zijn omgeven door een nucleair membraan, terwijl de meiotische as van metafase II-eicellen kwetsbaarder zou kunnen zijn voor cryoinjuries5. Ten tweede kunnen koud-geïnduceerde cytoskeletschade de rotatie van de as, de extrusie van het polaire lichaam, de pronucleaire migratie en cytokinese beïnvloeden, wat verschillende effecten kan hebben volgens de ontwikkelingsfase van oocyten, die meioseprogressie of post-fersiegebeurtenissen beïnvloedt. Tot slot, en misschien wel het belangrijkste, terwijl volwassen eicellen klaar zijn om bevrucht te worden, vertrouwen onrijpe gameten op de steun van de omliggende cumuluscellen om door nucleaire en cytoplasmamische rijping te gaan6, en dit is de reden waarom hele cumulus-eicellencomplexen (COC's) worden gehuild. Echter, het verlies van cumulus cellen en / of het verlies van functionele verbinding tussen de gamete en de omliggende somatische cellen zijn waarschijnlijk het meest nadelige effect van cryopreservatie van onrijpe COCs.
Onder cryopreservatie technieken, vitrification is er een die gemakkelijker kan worden toegepast in het veld voorwaarden. In vergelijking met langzame (of gecontroleerde snelheid) bevriezing, vitrification is sneller en vereist geen specifieke apparatuur, zoals een programmeerbare vriezer. Om te voldoen aan de drie fundamentele principes van vitrificatie (d.w.z. hoge viscositeit, verbonden met hoge cryoprotectantconcentratie, kleine volumes en ultrasnelle temperatuurdaling), zijn verschillende media en steunen speciaal ontwikkeld en gebruikt bij katten voor zowel onrijpe als volwassen eicellen. Beginnend met eenvoudige rietjes7,werden de apparaten toen ontwikkeld om het doel "Minimum volume" te bereiken. Cryoloop8, open pulled straws (OPS)9, plastic goten (gemodificeerd stro)10 en cryotubes11 zijn gebruikt, totdat een efficiënter apparaat (dat wil zeggen, Cryotop) werd gebruikt11, verbetering van de overleving en meiose hervatting. Cryotop (Supplemental Figuur 1) is een commercieel beschikbare ondersteuning die is uitgegroeid tot de keuze open systeem voor vitrification. Ontwikkeld voor de vitrificatie van menselijke eicellen en embryo's, het bestaat uit een kleine film strip bevestigd aan een harde plastic houder, beschermd door een plastic buis dop tijdens opslag12. Dankzij de bruikbaarheid en de extreme vermindering van het vitrificatievolume (zo weinig als 0,1 μL), wat ook leidt tot extreem snelle koel- en opwarmingspercentages, is deze vitrificatiesteun steeds vaker toegepast in verschillende soorten, waaronder de huiskat, waarbij deze is gebruikt met een verscheidenheid aan media13,14,15,16,17.
Het doel van dit manuscript is om een collectie-vitrification-warming protocol te beschrijven, met kleine wijzigingen van de oorspronkelijk ontwikkeld voor menselijke eicellen, die laboratorium-en-klare media en commerciële ondersteuning voor een minimum volume vitrification gebruikt en kan gemakkelijk worden toegepast in het veld omstandigheden voor de cryopreservatie van onrijpe katachtige COC's.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipettes &#38; tips</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpels</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Size 10 is usually ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beak</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.CR</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9129</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Advised lenght 230 mm (100+130)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gobelets</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>According to the canisters of the storage tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating stage</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All heating stages are ok, as long as they can keep 38&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repro plate</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.K-2</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage tank</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Any regularly filled tank is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam/nitrogen resistant box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called &#34;Cooling Rack&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timers</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All timers which can be set on times until 9 minutes are ok</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimum volume vitrification of immature feline oocytes

In de instandhoudingsprogramma's van wilde dieren is gamete banking cruciaal om genetische hulpbronnen van waardevolle individuen en zeldzame soorten te beschermen en het behoud van de biodiversiteit te bevorderen. In felids, de meeste soorten worden bedreigd met uitsterven, en binnenlandse rassen worden gebruikt als een model om de efficiëntie van protocollen voor kiemplasma bankieren te verhogen. Onder oocyte cryopreservatie technieken, vitrification is meer en meer populair in de menselijke en veterinaire ondersteunde voortplanting. Cryotop vitrification, dat in eerste instantie werd ontwikkeld voor menselijke eicellen en embryo's, heeft aangetoond zeer geschikt te zijn voor kattenoraad. Deze methode biedt verschillende voordelen, zoals de haalbaarheid in het veld omstandigheden en de snelheid van de procedure, die nuttig kunnen zijn wanneer meerdere monsters moeten worden verwerkt. De efficiëntie is echter sterk afhankelijk van de vaardigheden van de operator en intra- en interlaboratoriumstandaardisatie zijn nodig, evenals personeelstraining. Dit protocol beschrijft minimale volume vitrificatie van onrijpe katachtige eicellen op een commerciële ondersteuning in een stap voor stap veld-vriendelijk protocol, van eicel collectie tot opwarming. Volgens het protocol, behoud van eicelintegriteit en levensvatbaarheid bij opwarming (tot 90%) kan worden verwacht, hoewel er nog ruimte is voor verbetering in de post-opwarming van de rijping en de embryonale ontwikkelingsresultaten.

Na cat oocyte vitrification en opwarming volgens het huidige protocol (Figuur 1 en Supplemental Figuur 1), de overgrote meerderheid van de gameten overleven. Na vitrificatie, onder andere technieken, kan de levensvatbaarheid worden geëvalueerd op de optische microscoop als morfologische integriteit22 of met het gebruik van vitale vlekken. Een van de laatste is fluoresceïne diacetaat / propidium jodide (FDA / PI), die het mogelijk maakt de identifica...

Watch this Scientific Journal Video about Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes at JoVE.com

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Dit manuscript beschrijft een protocol voor de minimale volume vitrification van onrijpe katoocyten met laboratorium-gemaakte media op commerciële steunen. Het dekt elke stap van eicelisolatie van ex vivo gonaden tot vitrificatie en opwarming.

Minimale volume vitrificatie van onvolwassen feline oocyten

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Dit protocol is nuttig voor het behoud op lange termijn van de katachtige eicellen door middel van een cryopreservatie techniek bekend als met vitrification, die cruciaal is voor de vruchtbaarheid en de biodiversiteit behoud bij diersoorten. De belangrijkste voordelen van vitrificatie zijn de snelheid, omdat het kan worden voltooid in minder dan 17 minuten en de haalbaarheid ervan in het veld omstandigheden als vloeibare stikstof beschikbaar is. De huiskat is een levensvatbaar model voor wilde bedreigde katachtigen.De ontwikkeling en optimalisatie van cryopreservatie protocollen zou het mogelijk maken de oprichting van gamete biobanken voor katachtige instandhouding programma's. Begin met het bereiden van een Repro vitrification plaat met drie kegelvormige putten in één rij. Voeg 20 microliter van evenwichtsoplossing toe aan de eerste put en 300 microliter van vitrificatieoplossing aan de tweede en derde putten.Om de cumulus eicellen complexen, of COCs, gebruik maken van een kleine boring pipet om een of meer complexen over te brengen naar de bodem van de eerste put. Voeg langzaam 20 microliter van evenwichtsoplossing aan de grens van de daling toe en wacht drie minuten, voeg dan nog eens 240 microliters van equilibration oplossing toe en wacht negen minuten. Bereid tijdens het wachten een doos met vloeibare stikstof en label een vitrificatieondersteuning met de experiment- of kattenidentificatiecode.Zet de doos en ondersteuning in de buurt van de stereo microscoop. Na het equilibreren van de COC's voert u vitrificatie uit in minder dan 90 seconden. Om de COC's te verglazen, vul je de kleine pipet met de vitrificatieoplossing uit de tweede put.Neem de COC's van de onderkant van de eerste put en verplaats ze naar het oppervlak van de tweede put. Was de pipet met de vitrificatieoplossing, verplaats de COC's naar een ander gebied van de put en meng de omringende oplossing. Vul de pipet met oplossing uit een ander gebied van de put.Verplaats de COC's en meng het medium eromheen met de pipet. Herhaal dit proces nog een keer. Was vervolgens de pipet met de vitrificatieoplossing van de derde put en gebruik deze om de COC's naar de bodem van de derde put te verplaatsen.Nogmaals, meng de omringende oplossing. Na het vullen van de pipet met oplossing uit een ander gebied van de put, verplaats de COCs en meng de oplossing. Herhaal dit proces.Vul de pipetpunt met de vitrificatieoplossing uit een ander gebied van de put en gebruik deze om de COC's op de strook van de vitrification-ondersteuning dicht bij de punt te laden en vervolgens het overtollige medium aan tezuigen. Onmiddellijk dompelen de vitrification steun in vloeibare stikstof en gebruik klemmen om het te sluiten, ervoor te zorgen dat het blijft ondergedompeld. Bewaar de geladen vitrificatiesteunen in een beker en bewaar ze in een opslag vloeibare stikstoftank tot het opwarmen is.Plaats het verwarmingsstadium dicht bij de stereomicroscoop en zet deze op 38 graden Celsius. Verwarm het deksel van een petrischaal op de top van het podium en breng de vitrificatiesteunen van de opslagtank over naar een doos met vloeibare stikstof. Bereid een rij van een Repro plaat voor elke vitrification ondersteuning worden opgewarmd.Voeg 300 microliter verdunningsoplossing toe aan de eerste put en 300 microliter wasoplossing aan de tweede en derde put. Haal de ontdooioplossing uit de couveuse en laat 100 microliter op het deksel van de petrischaal vallen. Gebruik de klemmen om de vitrificatiesteun in de vloeibare stikstof te openen.Plaats het petrischaaldeksel onder de stereomicroscoop, pak dan snel de vitrificatiesteun op en dompel de strip onder in de druppel, en verplaats het tot alle COC's loskomen. Verwijder de steun uit de druppel zodra deze leeg is, maar laat de COC's gedurende één minuut in de ontdooioplossing. Vul een pipet met verdunningsoplossing en gebruik deze om de COC's van de ontdooioplossing naar de bodem van de eerste put te verplaatsen met verdunningsoplossing.Laat de COC's daar drie minuten staan. Was de pipet met de wasoplossing van de tweede put, neem vervolgens de COC's en verplaats ze naar de bodem van de tweede put. Wacht vijf minuten.Was de pipet met een oplossing van de derde put en gebruik deze om de COC's van de tweede put naar het oppervlak van de derde put te verplaatsen. Wacht tot de COC's de onderkant van de derde put raken. Herhaal het proces vervolgens met een ander goed gebied.Als je klaar bent, was je de pipet met cultuurmedium en verplaats je de eicellen naar een kweekgerecht. De overgrote meerderheid van gameten overleven na oocyte vitrification en opwarming volgens dit protocol. Een representatief beeld van een levensvatbare verglaasde opgewarmde kat cumulus oocyte complex gekleurd met fluoresceïne diacetaat en propidium jodide wordt hier getoond.Deze tabel toont het overlevingspercentage na vitrificatie, dat post-warming gegevens van eicellen voorgenomen voor in vitro rijping weergeeft. Van de 435 eicellen overleefden er 395, een totale levensvatbaarheid van 90,8%. Echter, sommige morfologische veranderingen kunnen worden opgemerkt na de opwarming.De meest voorkomende morfologische afwijkingen zijn veranderingen in ooplasma vorm en granulatie, gedeeltelijke of soms totale verlies van cumulus cellen, en zona pellucida fracturen. Wanneer u deze procedure probeert, vergeet dan niet om media van tevoren voor te bereiden, zodat ze de juiste temperatuur zijn voor gebruik en om protocoltemperaturen en -timings te volgen om celtoxiciteit te voorkomen. Het protocol kan ook worden toegepast op eicellen van andere soorten.Indien succesvol, kan dit ook bijdragen aan kiemplasm banking voor behoud van biodiversiteit in bedreigde katachtigen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expressie van fluorescerende eiwitten in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolatie en karakterisering van de Muis Antral Eicellen Gebaseerd op Hergroepering van nucleoli chromatine Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Gewijzigd MicroSecure Vitrificatie: Een veilige, eenvoudige en zeer effectieve cryopreservatie Procedure for Human Blastocysten

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Analyse van Chromosoom Segregatie, Histon Acetylatie, En Spindel Morfologie In Paard Oocyten

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Een neuraal netwerk-gebaseerde identificatie van ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente muis volgroeide eicellen

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

Menselijke blastocyst biopsie en vitrificatie

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

In Vitro Cultuur Strategie voor Eicellen uit early antral follikel bij runderen

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Scheiding van folliculaire cellen en oöcyten in ovariële follikels van zebravissen

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...