Name: minimum volume vitrification of immature feline oocytes
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00
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Ce travail a été en partie soutenu par EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 et par Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Nous tenons également à remercier la Dre MariaGiorgia Morselli pour sa contribution aux expériences décrites par les présentes et à l’acquisition d’images.

Les procédures décrites par les présentes n’ont pas fait l’objet d’une approbation éthique puisque les ovaires de chat ont été recueillis dans les cliniques vétérinaires comme sous-produits de l’ovariectomie de routine ou de l’ovariohystérectomie demandée par le propriétaire.
1. Collection d’ovocytes
<ol><li>Avant de commencer les expériences, préparer des solutions pour la collecte des ovaires et des ovocytes. Préparer une solution de collecte d’ovaires avec de l...

<ol>
	<li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+social+implications+of+embryo+cryopreservation.">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li><li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification.">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li><li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat.">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li><li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids.">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li><li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+and+mammalian+gametes.">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li><li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence.">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li><li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose.">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li><li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen.">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes.">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li><li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes.">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).</li><li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes.">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li><li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos:+The+Cryotop+method.">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).</li><li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification,+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer.">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li><li>Galiguis, J., G&#243;mez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes.">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li><li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique.">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions.">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329 (2019).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture:+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes.">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li><li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature,+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro.">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li><li>Cobo, A., Kuwayama, M., P&#233;rez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remoh&#237;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method.">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li><li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cryobiology.">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li><li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation+by+vitrification.">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li><li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification.">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li><li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation.">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li><li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos:+current+problems+and+future+perspectives.">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li><li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes.">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li><li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+(Felis+catus)+in+reproductive+season.">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li><li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viability+of+Serval+(Leptailurus+serval)+and+Pallas+Cat+(Felis+manul)+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method.">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li></ol>

La cryoconservation des ovocytes est une technique cruciale de conservation du germplasme, en particulier dans les taxons où de nombreuses espèces sont en voie de disparition, comme la famille des Felidae. Dans ce manuscrit, un protocole simple et respectueux du terrain pour la vitrification des ovocytes immatures de chat a été présenté. Les médias fabriqués en laboratoire, les soutiens à la vitrification minimale en volume et le personnel formé sont les facteurs clés du succès de cette méthode, qui permet d...

La cryoconservation est devenue une étape clé des techniques de procréation assistée (ART). Chez l’homme, il permet la préservation de la fertilité ou le report de la parentalité pour des raisons médicales ou personnelles. Chez les animaux, il est nécessaire de surmonter la distance et le temps dans les accouplements planifiés, en particulier chez les animaux de ferme et les animaux de compagnie, ou de préserver le matériel génétique de sujets précieux dans les programmes de conservation, en particulier chez les espèces sauvages menacées. La cryoconservation des ormons est le meilleur choix lorsque les individus à élever n’ont pas encore été choisis ou afin d’éviter les problèmes éthiques associés à la congélation d’embryons, en particulier en médecine humaine1. Les spermatozoïdes sont relativement faciles à préserver et donnent des résultats satisfaisants après la décongélation, mais les ovocytes, en raison de leurs caractéristiques structurelles, pourraient être plus complexes à stocker. En effet, le faible rapport surface/volume, ainsi que la présence de la zona pellucida entourant l’ooplasma, limite le mouvement des cryoprotectants et de l’eau à travers la cellule2. En outre, chez les animaux domestiques, y compris les félidés, ils sont caractérisés par un cytoplasme riche en lipides, qui est pensé pour les rendre plus sensibles à la cryoconservation3.
La plupart des félidés sont menacés, et le chat domestique est utilisé comme un modèle pour développer des protocoles pour la préservation du germplasme grâce à la disponibilité des gonades de l’ovariectomie de routine. Chez les animaux sauvages, les gonades peuvent être obtenues après des chirurgies électives ou (plus fréquemment) post-mortem,et les gamètes immatures (vésicule germinale) peuvent être récupérés. La stimulation hormonale visant à obtenir des ovocytes matures (métaphase II) n’est pas aussi commune que dans les ARTs humains en raison des questions éthiques et de la réponse spécifique à l’espèce et à l’individu aux traitements4.
Par conséquent, le développement de stratégies de cryoconservation s’est concentré sur les gamètes immatures, qui peuvent généralement être récupérés après la mort inattendue ou soudaine d’individus rares. D’un point de vue biologique, il existe certaines différences dans la cryoconservation des gamètes immatures ou matures, chacun ayant ses avantages. Tout d’abord, l’ADN est plus protégé dans les ovocytes immatures, dont la vésicule germinale contient des chromosomes entourés d’une membrane nucléaire, tandis que le fuseau meiotique des ovocytes métaphasé II pourrait être plus vulnérable aux cryoin jurys5. Deuxièmement, les dommages causés par le cytosquelette induits par le froid pourraient affecter la rotation des fuseaux, l’extrusion du corps polaire, la migration pronucléaire et la cytokinesis, qui pourraient avoir des impacts différents selon la phase développementale des ovocytes, influençant la progression de la méiose ou les événements post-fertilisation. Enfin, et peut-être le plus important, alors que les ovocytes matures sont prêts à être fécondés, les gamètes immatures s’appuient sur le soutien des cellules cumulus environnantes pour passer par la maturation nucléaire et cytoplasmique6, et c’est la raison pour laquelle des complexes cumulus-ovocytes entiers (COC) sont cryopréservés. Cependant, la perte de cellules cumulus et/ou la perte de connexion fonctionnelle entre le ormiste et les cellules somatiques environnantes sont probablement l’effet le plus néfaste de la cryoconservation des COC immatures.
Parmi les techniques de cryoconservation, la vitrification est une que l’on peut appliquer plus facilement dans des conditions de terrain. Comparativement à la congélation lente (ou à taux contrôlé), la vitrification est plus rapide et ne nécessite pas d’équipement spécifique, comme un congélateur programmable. Afin de satisfaire les trois principes fondamentaux de la vitrification (c.-à-d. une viscosité élevée, liée à une forte concentration cryoprotecteur, de petits volumes et une diminution de température ultra-rapide), plusieurs milieux et supports ont été développés et utilisés spécialement chez les chats pour les ovocytes immatures et matures. En commençant par de simples pailles7, des dispositifs ont ensuite été développés pour atteindre l’objectif « volume minimum ». Cryoloop8, pailles à tiré ouvertes (OPS)9, gouttières en plastique (paille modifiée)10 et cryotubes11 ont été utilisés, jusqu’à ce qu’un dispositif plus efficace (c.-à-d. Cryotop) a été utilisé11, améliorant la survie et la reprise de la méiose. Cryotop (Figure supplémentaire 1) est un support disponible dans le commerce qui est devenu le système ouvert électif pour la vitrification. Développé pour la vitrification des ovocytes humains et des embryons, il se compose d’une petite bande de film attachée à un support en plastique dur, protégé par un bouchon de tube en plastique pendant le stockage12. Grâce à sa facilité d’utilisation et à la réduction extrême du volume de vitrification (aussi peu que 0,1 μL), ce qui conduit également à des taux de refroidissement et de réchauffement extrêmement rapides, ce soutien à la vitrification a été de plus en plus appliqué chez plusieurs espèces, y compris le chat domestique, dans lequel il a été utilisé avec une variété de médias13,14,15,16,17.
Le but de ce manuscrit est de décrire un protocole de réchauffement de la vitrification-vitrification de collection, avec des modifications mineures de celui initialement développé pour les ovocytes humains, qui emploie des supports de laboratoire et commerciaux pour la vitrification minimale de volume et peut être facilement appliqué dans des conditions de champ pour la cryoconservation des COC félins immatures.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipettes &#38; tips</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpels</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Size 10 is usually ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beak</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.CR</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9129</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Advised lenght 230 mm (100+130)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gobelets</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>According to the canisters of the storage tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating stage</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All heating stages are ok, as long as they can keep 38&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repro plate</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.K-2</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage tank</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Any regularly filled tank is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam/nitrogen resistant box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called &#34;Cooling Rack&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timers</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All timers which can be set on times until 9 minutes are ok</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimum volume vitrification of immature feline oocytes

Dans les programmes de conservation des animaux sauvages, la banque de mentières est cruciale pour protéger les ressources génétiques d’individus précieux et d’espèces rares et pour promouvoir la préservation de la biodiversité. Chez les félidés, la plupart des espèces sont menacées d’extinction, et les races domestiques sont utilisées comme modèle pour accroître l’efficacité des protocoles pour les services bancaires de germplasme. Parmi les techniques de cryoconservation des ovocytes, la vitrification est de plus en plus populaire dans la procréation assistée humaine et vétérinaire. La vitrification cryotop, qui a d’abord été développée pour les ovocytes humains et les embryons, s’est avérée bien adaptée aux ovocytes de chat. Cette méthode offre plusieurs avantages, tels que la faisabilité dans les conditions de terrain et la vitesse de la procédure, qui peut être utile lorsque plusieurs échantillons doivent être traités. Toutefois, l’efficacité dépend fortement des compétences de l’opérateur, et une normalisation intra- et inter-laboratoires est nécessaire, ainsi que de la formation du personnel. Ce protocole décrit la vitrification minimale du volume des ovocytes félins immatures sur un support commercial dans un protocole étape par étape respectueux du terrain, de la collecte des ovocytes au réchauffement. Conformément au protocole, la préservation de l’intégrité des ovocytes et la viabilité au réchauffement (jusqu’à 90 %) bien qu’il y ait encore place à l’amélioration des résultats de maturation après le réchauffement et de développement embryonnaire.

Après la vitrification et le réchauffement des ovocytes de chat selon le protocole actuel (figure 1 et figure supplémentaire 1),la grande majorité des gamètes survivent. Après la vitrification, entre autres techniques, la viabilité peut être évaluée au microscope optique comme l’intégrité morphologique22 ou avec l’utilisation de taches vitales. L’un de ces derniers est le diacétate/propidium de fluorescéine/ipodure de propidium (FD...

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Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Ce manuscrit décrit un protocole pour la vitrification minimale de volume des ovocytes immatures de chat avec des médias de laboratoire-faits sur des supports commerciaux. Il couvre chaque étape de l’isolement des ovocytes des gonades ex vivo à la vitrification et au réchauffement.

Vitrification minimale en volume des ovocytes félins immatures

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Ce protocole est utile pour la conservation à long terme des ovocytes félins grâce à une technique de cryopréservation connue sous le nom de vitrification, qui est cruciale pour la fertilité et la préservation de la biodiversité chez les espèces animales. Les principaux avantages de la vitrification sont sa vitesse puisqu’elle peut être achevée en moins de 17 minutes et sa faisabilité sur le terrain si de l’azote liquide est disponible. Le chat domestique est un modèle viable pour les félins sauvages en voie de disparition.Le développement et l’optimisation de protocoles de cryopréservation permettraient d’établir des biobanques de gamete pour les programmes de conservation féline. Commencez par préparer une plaque de vitrification Repro avec trois puits coniques dans une rangée. Ajouter 20 microlitres de solution d’équilibrage au premier puits et 300 microlitres de solution de vitrification aux deuxième et troisième puits.Pour équilibrer les complexes d’ovocytes cumulus, ou COCs, utilisez une pipette à petit alésage pour transférer un ou plusieurs complexes au fond du premier puits. Ajouter lentement 20 microlitres de solution d’équilibrage à la limite de la goutte et attendre trois minutes, puis ajouter 240 microlitres supplémentaires de solution d’équilibrage et attendre neuf minutes. En attendant, préparez une boîte avec de l’azote liquide et étiquetez un support de vitrification avec l’expérience ou le code d’identification du chat.Placez la boîte et soutenez près du microscope stéréo. Après avoir équilibré les COC, effectuez la vitrification en moins de 90 secondes. Pour vitrifier les COC, remplissez la pipette à petit alésage de la solution de vitrification du deuxième puits.Prenez les COC du bas du premier puits et déplacez-les à la surface du deuxième puits. Lavez la pipette avec la solution de vitrification, puis déplacez les COC dans une autre zone du puits et mélangez la solution environnante. Remplissez la pipette d’une solution provenant d’une autre zone du puits.Déplacez les COC et mélangez le milieu qui les entoure avec la pipette. Répétez ce processus une fois de plus. Ensuite, lavez la pipette avec la solution de vitrification du troisième puits et utilisez-la pour déplacer les COC au bas du troisième puits.Encore une fois, mélanger la solution environnante. Après avoir rempli la pipette de solution à partir d’une autre zone du puits, déplacez les COC et mélangez la solution. Répétez ce processus.Remplissez la pointe pipette avec la solution de vitrification d’une autre zone du puits et utilisez-la pour charger les COC sur la bande du support de vitrification près de la pointe, puis aspirez l’excès de milieu. Plongez immédiatement le support de vitrification dans de l’azote liquide et utilisez des pinces pour le fermer, en vous assurant qu’il reste immergé. Conservez les supports de vitrification chargés dans un gobelet et gardez-les dans un réservoir d’azote liquide de stockage jusqu’à ce qu’ils se réchauffent.Placez l’étage chauffant près du microscope stéréo et allumez-le à 38 degrés Celsius. Réchauffer le couvercle d’une boîte de Pétri sur le dessus de la scène, puis transférer les supports de vitrification du réservoir de stockage à une boîte avec de l’azote liquide. Préparez une rangée d’une plaque Repro pour réchauffer chaque support de vitrification.Ajouter 300 microlitres de solution de dilution au premier puits et 300 microlitres de solution de lavage aux deuxième et troisième puits. Sortez la solution de décongélation de l’incubateur et déposez 100 microlitres sur le couvercle de la boîte de Pétri. Utilisez les pinces pour ouvrir le support de vitrification à l’intérieur de l’azote liquide.Placez le couvercle de la boîte de Petri sous le microscope stéréo, puis prenez rapidement le support de vitrification et plongez sa bande dans la goutte, en la déplaçant jusqu’à ce que tous les COC se détachent. Retirez le support de la goutte dès qu’il est vide, mais laissez les COC dans la solution de décongélation pendant une minute. Remplissez une pipette d’une solution de dilution et utilisez-la pour déplacer les COC de la solution de décongélation vers le fond du premier puits avec une solution de dilution.Laissez les COC là pendant trois minutes. Lavez la pipette avec la solution de lavage du deuxième puits, puis prenez les COC et déplacez-les au fond du deuxième puits. Attends cinq minutes.Lavez la pipette avec une solution à partir du troisième puits et utilisez-la pour déplacer les COC du deuxième puits à la surface du troisième puits. Attendez que les COC touchent le fond du troisième puits. Répétez ensuite le processus avec un autre puits.Une fois terminée, laver la pipette avec le milieu de culture et déplacer les ovocytes dans un plat de culture. La grande majorité des gamètes survivent après la vitrification des ovocytes et le réchauffement selon ce protocole. Une image représentative d’un complexe viable vitrifié d’oocytes chauds de chat souillés avec le diacétate de fluorescéine et l’iodure de propidium est montrée ici.Ce tableau montre le pourcentage de survie après vitrification, qui représente les données post-réchauffement des ovocytes destinés à la maturation in vitro. Sur 435 ovocytes, 395 ont survécu, avec une viabilité globale de 90,8 % après le réchauffement. Cependant, certains changements morphologiques peuvent être remarqués après le réchauffement.Les anomalies morphologiques les plus fréquentes sont les changements dans la forme et la granulation d’ooplasme, la perte partielle ou parfois totale des cellules de cumulus, et les ruptures de pellucida de zona. Lorsque vous essayez cette procédure, n’oubliez pas de préparer les médias à l’avance afin qu’ils soient la bonne température avant utilisation et de suivre les températures du protocole et les calendriers pour éviter la toxicité cellulaire. Le protocole pourrait également être appliqué aux ovocytes d’autres espèces.En cas de succès, cela pourrait également contribuer à la banque de plasmes germinales pour la préservation de la biodiversité chez les félins en voie de disparition.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

L&#39;expression de protéines fluorescentes en<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Par injection dans l&#39;ARNm non fécondés ovocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

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Biologie du développement

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