Name: minimum volume vitrification of immature feline oocytes
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00
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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 und von der Université degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Wir danken auch Dr. MariaGiorgia Morselli für ihren Beitrag zu den hierdargestellten Experimenten und zur Bildaufnahme.

Die hiermit dargestellten Verfahren wurden nicht ethisch zugelassen, da Katzeneierstöcke in Tierkliniken als Nebenprodukte aus der vom Eigentümer angeforderten Routine-Ovariektomie oder Ovariohysterektomie gesammelt wurden.
1. Oozyten-Sammlung
<ol><li>Vor Beginn der Experimente, bereiten Sie Lösungen für Dieeier- und Eizellsammlung vor. Bereiten Sie Diestöcke-Sammlungslösung mit Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) mit einer Mischung aus Antibiotika und Antimykotika (100 I.E./ml Penici...

<ol>
	<li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+social+implications+of+embryo+cryopreservation.">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li><li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification.">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li><li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat.">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li><li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids.">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li><li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+and+mammalian+gametes.">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li><li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence.">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li><li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose.">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li><li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen.">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes.">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li><li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes.">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).</li><li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes.">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li><li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos:+The+Cryotop+method.">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).</li><li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification,+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer.">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li><li>Galiguis, J., G&#243;mez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes.">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li><li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique.">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions.">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329 (2019).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture:+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes.">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li><li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature,+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro.">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li><li>Cobo, A., Kuwayama, M., P&#233;rez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remoh&#237;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method.">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li><li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cryobiology.">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li><li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation+by+vitrification.">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li><li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification.">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li><li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation.">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li><li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos:+current+problems+and+future+perspectives.">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li><li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes.">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li><li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+(Felis+catus)+in+reproductive+season.">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li><li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viability+of+Serval+(Leptailurus+serval)+and+Pallas+Cat+(Felis+manul)+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method.">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li></ol>

Oocyte Kryokonservierung ist eine entscheidende Keimplasma-Konservierungstechnik, vor allem in Taxa, wo viele Arten gefährdet sind, wie Felidae Familie. In diesem Manuskript wurde ein einfaches und feldfreundliches Protokoll zur Verglasung unreifer Katzenoozyten vorgestellt. Labormittel, minimale Volumenverglasungsstützen und geschultes Personal sind die Schlüsselfaktoren für den Erfolg dieser Methode, die es ermöglicht, lebensfähige Eizellen konsequent und wiederholt zu erhalten, wie die repräsentativen Ergebniss...

Die Kryokonservierung ist zu einem wichtigen Schritt der assistierten Reproduktionstechniken (ARTs) geworden. Beim Menschen, Es ermöglicht die Erhaltung der Fruchtbarkeit oder Verschiebung der Elternschaft aus medizinischen oder persönlichen Gründen. Bei Tieren ist es notwendig, Distanz und Zeit in geplanten Paarungen zu überwinden, insbesondere bei Nutztieren und Haustieren, oder genetisches Material wertvoller Subjekte in Naturschutzprogrammen, insbesondere in wildgefährdeten Arten, zu konservieren. Gamete Kryokonservierung ist die beste Wahl, wenn die Individuen gezüchtet wurden noch nicht ausgewählt oder um ethische Fragen im Zusammenhang mit embryo nieren, vor allem in der Humanmedizin zu vermeiden1. Spermatozoen sind relativ einfach zu erhalten und geben zufriedenstellende Ergebnisse nach dem Auftauen, aber Eizellen, aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften, könnte komplexer zu speichern. Tatsächlich begrenzt das niedrige Oberflächen-Volumen-Verhältnis sowie das Vorhandensein der Zona-Pellucida, die das Ooplasma umgibt, die Bewegung von Kryoprotektoren und Wasser über die Zelle2. Darüber hinaus sind sie bei Haustieren einschließlich Feliden durch ein lipidreiches Zytoplasma gekennzeichnet, das3sie empfindlicher gegenüber Kryokonservierung 3 machen soll.
Die meisten Felide sind bedroht, und die Hauskatze wird als Modell verwendet, um Protokolle zur Erhaltung von Keimplasma zu entwickeln, dank der Verfügbarkeit von Gonaden aus der routinemäßigen Ovariektomie. Bei Wildtieren können Gonaden nach Wahloperationen oder (häufiger) post-mortemgewonnen werden, und unreife (keimförmige Vesikel) Gameten können geborgen werden. Hormonelle Stimulation, die darauf abzielt, reife (Metaphase II) Eizellen zu erhalten, ist aufgrund der ethischen Fragen und der art- und individualspezifischen Reaktion auf Behandlungen4nicht so häufig wie in menschlichen ARTs.
Daher hat sich die Entwicklung von Kryokonservierungsstrategien auf unreife Gameten konzentriert, die in der Regel nach dem unerwarteten oder plötzlichen Tod seltener Personen abgerufen werden können. Aus biologischer Sicht gibt es einige Unterschiede in der Kryokonservierung von unreifen oder reifen Gameten, von denen jeder seine Vorteile hat. Erstens ist die DNA in unreifen Eizellen geschützt, deren Keimbläschen Chromosomen enthält, die von einer Kernmembran umgeben sind, während die meiotische Spindel der Metaphase II Oozyten anfälliger für Kryoverletzungen sein könnte5. Zweitens können kaltinduzierte Zytoskelettschäden die Spindelrotation, die Polarkörperextrusion, die pronukleare Migration und die Zytokinese beeinflussen, die je nach Oozytenentwicklungsphase unterschiedliche Auswirkungen haben und die Meioseprogression oder Ereignisse nach der Befruchtung beeinflussen. Schließlich, und vielleicht am wichtigsten, während reife Oozyten zur Befruchtung bereit sind, verlassen sich unreife Gameten auf die Unterstützung der umgebenden Cumuluszellen, um durch die kernnukleare und zytoplasmatische Reifung6zu gehen, und dies ist der Grund, warum ganze Cumulus-Oozytenkomplexe (COCs) kryokonserviert sind. Der Verlust von Cumuluszellen und/oder der Verlust der funktionellen Verbindung zwischen der Gamete und den umgebenden somatischen Zellen sind jedoch wahrscheinlich die schädlichste Wirkung der Kryokonservierung unreifer COCs.
Unter den Kryokonservierungstechniken ist die Verglasung eine, die leichter unter Feldbedingungen angewendet werden kann. Im Vergleich zum langsamen (oder kontrollierten) Einfrieren ist die Verglasung schneller und erfordert keine spezifischen Geräte, wie z. B. einen programmierbaren Gefrierschrank. Um die drei Grundprinzipien der Vitrifizierung (d.h. hohe Viskosität, verbunden mit hoher Kryoprotektorkonzentration, geringen Volumina und ultraschnellem Temperaturabfall) zu erfüllen, wurden mehrere Medien und Stützen entwickelt und insbesondere bei Katzen für unreife und reife Oozyten verwendet. Ausgehend von einfachen Strohhalmen7wurden dann Geräte entwickelt, um das Ziel "Minimum Volume" zu erreichen. Cryoloop8, offen gezogene Strohhalme (OPS)9, Kunststoffrinnen (modifiziertes Stroh)10 und Kryotubes11 wurden verwendet, bis ein effizienteres Gerät (d.h. Cryotop) eingesetzt wurde11, verbesserungder Überleben und Meiose Wiederaufnahme. Cryotop (Supplemental Figure 1) ist eine kommerziell erhältliche Unterstützung, die das wahloffene System für die Vitrifizierung geworden ist. Entwickelt für die Verglasung von menschlichen Eizellen und Embryonen, besteht es aus einem kleinen Folienstreifen, der an einem Hartplastikhalter befestigt ist, geschützt durch eine Kunststoffrohrkappe während der Lagerung12. Dank ihrer Verwendbarkeit und der extremen Reduzierung des Verglasungsvolumens (nur 0,1 l), die auch zu extrem schnellen Abkühlungs- und Erwärmungsraten führt, wurde diese Verglasungsunterstützung zunehmend bei mehreren Arten angewendet, einschließlich der Hauskatze, bei der sie mit einer Vielzahl von Medien13,14,15,16,17verwendet wurde.
Der Zweck dieses Manuskripts ist es, ein Sammlungs-Vitrifizierungs-Erwärmungsprotokoll zu beschreiben, mit geringfügigen Änderungen von dem ursprünglich für menschliche Eizellen entwickelten Protokoll, das im Labor hergestellte Medien und kommerzielle Stützen für minimale Volumenverglasung verwendet und leicht unter Feldbedingungen für die Kryokonservierung unreifer feliner COCs angewendet werden kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipettes &#38; tips</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpels</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Size 10 is usually ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beak</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.CR</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9129</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Advised lenght 230 mm (100+130)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gobelets</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>According to the canisters of the storage tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating stage</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All heating stages are ok, as long as they can keep 38&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repro plate</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.K-2</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage tank</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Any regularly filled tank is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam/nitrogen resistant box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called &#34;Cooling Rack&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timers</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All timers which can be set on times until 9 minutes are ok</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimum volume vitrification of immature feline oocytes

In den Erhaltungsprogrammen für Wildtiere ist Das Gamete Banking von entscheidender Bedeutung, um die genetischen Ressourcen wertvoller Individuen und seltener Arten zu schützen und die Erhaltung der biologischen Vielfalt zu fördern. Bei Feliden sind die meisten Arten vom Aussterben bedroht, und heimische Rassen werden als Modell verwendet, um die Effizienz von Protokollen für das Keimplasma-Banking zu erhöhen. Unter den Eizellen-Kryokonservierungstechniken ist die Verglasung in der humanen und tierärztlichen assistierten Reproduktion immer beliebter. Die Cryotop-Verglasung, die zunächst für menschliche Eizellen und Embryonen entwickelt wurde, hat sich als gut für Katzenoozyten geeignet erwiesen. Diese Methode bietet mehrere Vorteile, wie die Machbarkeit unter Feldbedingungen und die Geschwindigkeit des Verfahrens, die hilfreich sein können, wenn mehrere Proben verarbeitet werden müssen. Die Effizienz hängt jedoch stark von den Fähigkeiten des Bedieners ab, und es sind eine labor- und laborübergreifende Standardisierung sowie eine Personalschulung erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt minimale Volumen verglasung von unreifen Katzenoozyten auf einer kommerziellen Unterstützung in einem Schritt für Schritt feldfreundliches Protokoll, von der Oozytensammlung bis zur Erwärmung. Nach dem Protokoll, Erhaltung der Oozytenintegrität und Lebensfähigkeit bei Erwärmung (bis zu 90%) zu erwarten, obwohl es noch Raum für Verbesserungen bei der Reifung nach der Erwärmung und den Ergebnissen der embryonalen Entwicklung gibt.

Nach der Verglasung und Erwärmung der Katze nach dem vorliegenden Protokoll (Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 1) überlebt die überwiegende Mehrheit der Gameten. Nach der Vitrifizierung kann unter anderem die Lebensfähigkeit am optischen Mikroskop als morphologische Integrität22 oder unter Verwendung von vitalen Flecken bewertet werden. Eines der letzteren ist Fluorescein-Diacetat/Propidiumiodid (FDA/PI), das die Identifizierung lebensfähige...

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Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur minimalen Volumenverglasung unreifer Katzenoozyten mit im Labor hergestellten Medien auf kommerziellen Trägern. Es deckt jeden Schritt von der Eizellenisolierung von ex vivo Gonaden bis zur Verglasung und Erwärmung ab.

Minimale Volumenverglasung von unreifen FelineOozyten

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Dieses Protokoll ist nützlich für die langfristige Erhaltung der Katzenoozyten durch eine Kryokonservierungstechnik, die als Verglasung bekannt ist, die für die Fruchtbarkeit und die Erhaltung der biologischen Vielfalt bei Tierarten von entscheidender Bedeutung ist. Die Hauptvorteile der Verglasung sind ihre Geschwindigkeit, da sie in weniger als 17 Minuten abgeschlossen werden kann, und ihre Durchführbarkeit unter Feldbedingungen, wenn flüssiger Stickstoff verfügbar ist. Die Hauskatze ist ein praktikables Modell für wild gefährdete Katzen.Die Entwicklung und Optimierung von Kryokonservierungsprotokollen würde die Einrichtung von Gamete-Biobanken für Katzenschutzprogramme ermöglichen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Repro Vitrifizierungsplatte mit drei konischen Brunnen in einer Reihe. Fügen Sie 20 Mikroliter Ausgleichslösung in den ersten Brunnen und 300 Mikroliter Verglasungslösung zu den zweiten und dritten Brunnen.Um die Cumulus-Eizellenkomplexe oder COCs zu ausdemieren, verwenden Sie eine Pipetten mit kleinen Bohrungen, um einen oder mehrere Komplexe auf den Boden des ersten Brunnens zu übertragen. Fügen Sie langsam 20 Mikroliter Ausgleichslösung an die Grenze des Tropfens und warten Sie für drei Minuten, dann fügen Sie weitere 240 Mikroliter Gleichgewichtlösung und warten Sie für neun Minuten. Während des Wartens eine Schachtel mit flüssigem Stickstoff vorbereiten und eine Verglasungsunterstützung mit dem Experiment- oder Katzenidentifikationscode kennzeichnen.Setzen Sie die Box und unterstützen Sie in der Nähe des Stereomikroskops. Nach dem Ausgleich der COCs, vitrifikieren Sie in weniger als 90 Sekunden. Um die COCs zu vitrifyn, füllen Sie die Kleinbohrpipette mit der Verglasungslösung aus dem zweiten Brunnen.Nehmen Sie die COCs von der Unterseite des ersten Brunnens und bewegen Sie sie an die Oberfläche des zweiten Brunnens. Waschen Sie die Pipette mit der Verglasungslösung, dann bewegen Sie die COCs in einen anderen Bereich des Brunnens und mischen Sie die umgebende Lösung. Füllen Sie die Pipette mit Lösung aus einem anderen Bereich des Brunnens.Bewegen Sie die COCs und mischen Sie das Medium, das sie umgibt, mit der Pipette. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal. Als nächstes waschen Sie die Pipette mit der Verglasungslösung aus dem dritten Brunnen und verwenden Sie sie, um die COCs auf den Boden des dritten Brunnens zu bewegen.Mischen Sie erneut die umgebende Lösung. Nach dem Befüllen der Pipette mit Lösung aus einem anderen Bereich des Brunnens, bewegen Sie die COCs und mischen Sie die Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang.Füllen Sie die Pipettenspitze mit der Verglasungslösung aus einem anderen Bereich des Brunnens und laden Sie sie, um die COCs auf den Streifen der Verglasungsstütze in der Nähe der Spitze zu laden, dann das überschüssige Medium ansaugen. Tauchen Sie sofort die Verglasungsstütze in flüssigen Stickstoff ein und verwenden Sie Klemmen, um sie zu schließen, um sicherzustellen, dass sie eingetaucht bleibt. Bewahren Sie die geladenen Verglasungsstützen in einem Kelchen auf und bewahren Sie sie bis zur Erwärmung in einem flüssigen Stickstofftank auf.Stellen Sie die Heizbühne in der Nähe des Stereomikroskops auf und schalten Sie sie auf 38 Grad Celsius ein. Den Deckel einer Petrischale auf der Bühne erwärmen und dann die Verglasungsstützen aus dem Lagertank in eine Box mit flüssigem Stickstoff geben. Bereiten Sie eine Reihe einer Repro-Platte für jede Verglasungsunterstützung vor, die erwärmt werden soll.Fügen Sie 300 Mikroliter Verdünnungslösung in den ersten Brunnen und 300 Mikroliter Waschlösung zu den zweiten und dritten Brunnen. Nehmen Sie die Auftaulösung aus dem Inkubator und lassen Sie 100 Mikroliter auf den Deckel der Petrischale fallen. Verwenden Sie die Klemmen, um die Verglasungsunterstützung im Inneren des flüssigen Stickstoffs zu öffnen.Legen Sie den Petrischalendeckel unter das Stereomikroskop, nehmen Sie dann schnell die Verglasungsstütze auf und tauchen Sie ihren Streifen in den Tropfen ein, indem Sie ihn bewegen, bis sich alle COCs lösen. Entfernen Sie die Unterstützung aus dem Drop, sobald sie leer ist, aber lassen Sie die COCs für eine Minute in der Auftaulösung. Füllen Sie eine Pipette mit Verdünnungslösung und verwenden Sie sie, um die COCs von der Auftaulösung tropfen auf den Boden des ersten Brunnens mit Verdünnungslösung zu bewegen.Lassen Sie die COCs dort für drei Minuten. Waschen Sie die Pipette mit der Waschlösung aus dem zweiten Brunnen, dann nehmen Sie die COCs und bewegen Sie sie auf den Boden des zweiten Brunnens. Warten Sie fünf Minuten.Waschen Sie die Pipette mit einer Lösung aus dem dritten Brunnen und verwenden Sie sie, um die COCs vom zweiten Brunnen an die Oberfläche des dritten Brunnens zu bewegen. Warten Sie, bis die COCs den Boden des dritten Brunnens berühren. Wiederholen Sie dann den Vorgang mit einem anderen Brunnenbereich.Wenn sie fertig ist, waschen Sie die Pipette mit Kulturmedium und bewegen Sie die Eizellen zu einem Kulturgericht. Die überwiegende Mehrheit der Gameten überlebt nach Eizellenverglasung und Erwärmung nach diesem Protokoll. Ein repräsentatives Bild eines lebensfähigen vitrifizierten gewimserten Katzenkumulus-Oozytenkomplexes, der mit Fluorescein-Diacetat und Propidiumjodid befleckt ist, ist hier zu sehen.Diese Tabelle zeigt den Prozentsatz des Überlebens nach der Vitrifizierung, der Daten von Eizellen nach der Erwärmung darstellt, die für die In-vitro-Reifung bestimmt sind. Von 435 Eizellen überlebten 395, was insgesamt 90,8 % der Lebensfähigkeit nach der Erwärmung entspricht. Allerdings können einige morphologische Veränderungen nach der Erwärmung bemerkt werden.Die häufigsten morphologischen Anomalien sind Veränderungen in der Ooplasmaform und Granulation, teilweiser oder manchmal vollständiger Verlust von Cumuluszellen und Zona pellucida Frakturen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, denken Sie daran, Medien im Voraus vorzubereiten, damit sie die richtige Temperatur vor dem Gebrauch sind, und Protokolltemperaturen und -zeiten zu befolgen, um Zelltoxizität zu vermeiden. Das Protokoll könnte auch auf Eizellen anderer Arten angewendet werden.Im Erfolgsfalle könnte dies auch zum Keimplasma-Banking zur Erhaltung der biologischen Vielfalt in gefährdeten Katzen beitragen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression von fluoreszierenden Proteinen in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Durch mRNA Injektion in ungedüngte Eizellen

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolierung und Charakterisierung von Maus Antral Oozyten Basierend auf Nucleolar Chromatinorganisation

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Modifizierte MicroSecure Vitrifikation: Eine sichere, einfache und sehr effektive Kryokonservierung Verfahren für Human Blastozysten

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Analyse der Chromosomensegregation, Histonacetylierung und Spindelmorphologie in Pferdeozyten

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Eine neuronale Netzwerk-basierte Identifikation der entwicklungsgeschichtlich zuständigen oder inkompetent Maus ausgewachsene Eizellen

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimal invasiven Embryotransfer und Embryo-Vitrifizierung auf der Optimal-Botn-Bühne im Kaninchenmodell

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

Menschliche Blastozysten Biopsie und Vitrifikation

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

In Vitro Kulturstrategie für Oozyten aus dem frühen Antralfollikel bei Rindern

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Trennung von Follikulärzellen und Oozyten in Denrogarischen Follikel von Zebrafischen

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...