Name: minimum volume vitrification of immature feline oocytes
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes at JoVE.com

Questo lavoro è stato in parte sostenuto da EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 e dall'Università della Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). Ringraziamo anche la Dott.ssa MariaGiorgia Morselli per il suo contributo agli esperimenti descritti e all'acquisizione di immagini.

Le procedure descritte non sono state sottoposte all'approvazione etica in quanto le ovaie dei gatti sono state raccolte nelle cliniche veterinarie come sottoprodotti dall'ovariectomia di routine richiesta dal proprietario o dall'ovario.
1. Collezione Oocyte
<ol><li>Prima di iniziare gli esperimenti, preparare le soluzioni per la raccolta di ovaie e ovociti. Preparare la soluzione di raccolta delle ovaie con salina tampina tamponata da fosfato (PBS) con una miscela di antibiotici e antimicot...

<ol>
	<li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+social+implications+of+embryo+cryopreservation.">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li><li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification.">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li><li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat.">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li><li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids.">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li><li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+and+mammalian+gametes.">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li><li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence.">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li><li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose.">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li><li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen.">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes.">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li><li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes.">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).</li><li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes.">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li><li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos:+The+Cryotop+method.">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).</li><li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification,+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer.">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li><li>Galiguis, J., G&#243;mez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes.">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li><li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique.">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions.">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329 (2019).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture:+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes.">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li><li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature,+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro.">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li><li>Cobo, A., Kuwayama, M., P&#233;rez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remoh&#237;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method.">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li><li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cryobiology.">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li><li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation+by+vitrification.">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li><li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification.">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li><li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation.">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li><li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos:+current+problems+and+future+perspectives.">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li><li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes.">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li><li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+(Felis+catus)+in+reproductive+season.">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li><li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viability+of+Serval+(Leptailurus+serval)+and+Pallas+Cat+(Felis+manul)+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method.">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li></ol>

La crioconservazione degli ovociti è una tecnica cruciale di conservazione del germoplasma, specialmente nei taxa dove molte specie sono in pericolo, come la famiglia Felidae. In questo manoscritto è stato presentato un protocollo semplice e rispettoso del campo per la vetrificazione degli ovociti di gatto immaturi. I supporti di laboratorio, i supporti per la vitrificazione del volume minimo e il personale addestrato sono i fattori chiave per il successo di questo metodo, che consente di ottenere ovociti vitali in mod...

La crioconservazione è diventata un passo fondamentale delle tecniche di riproduzione assistita (ART). Nell'uomo, permette la conservazione della fertilità o il rinvio della genitorialità per motivi medici o personali. Negli animali, è necessario superare la distanza e il tempo negli accoppiamenti pianificati, in particolare negli animali da allevamento e negli animali domestici, o per preservare il materiale genetico di soggetti di valore in programmi di conservazione, in particolare nelle specie selvatiche a rischio di estinzione. La crioconservazione del gamet è la scelta migliore quando gli individui da allevare non sono ancora stati scelti o per evitare problemi etici associati al congelamento degli embrioni, soprattutto nella medicina umana1. Gli spermatozoi sono relativamente facili da preservare e dare risultati soddisfacenti dopo lo scongelamento, ma gli ovociti, a causa delle loro caratteristiche strutturali, potrebbero essere più complessi da conservare. Infatti, il basso rapporto superficie/volume, così come la presenza della zona pellucida che circonda l'ooplasma, limita il movimento dei crioprotettori e dell'acqua attraverso la cella2. Inoltre, negli animali domestici compresi i felidi, sono caratterizzati da un citoplasma ricco di lipidi, che si pensa li renda più sensibili alla crioconservazione3.
La maggior parte dei felidi sono minacciati, e il gatto domestico è usato come modello per sviluppare protocolli per la conservazione del germoplasma grazie alla disponibilità di gonadi da ovariectomia di routine. Negli animali selvatici, le gonadi possono essere ottenute dopo interventi chirurgici elettivi o (più frequentemente) post-mortem, e immaturi (vescicole germinale) gameti possono essere recuperati. La stimolazione ormonale mirata a ottenere ovociti maturi (metafase II) non è così comune come negli ART umani a causa delle questioni etiche e della risposta specifica delle specie e dell'individuo ai trattamenti4.
Pertanto, lo sviluppo di strategie di crioconservazione si è concentrato su gameti immaturi, che di solito possono essere recuperati dopo la morte inaspettata o improvvisa di individui rari. Da un punto di vista biologico, ci sono alcune differenze nella crioconservazione di gameti immaturi o maturi, ognuno con i suoi vantaggi. In primo luogo, il DNA è più protetto negli ovociti immaturi, la cui vescicolo germinale contiene cromosomi circondati da una membrana nucleare, mentre il mandrino meiotico degli ovociti metafase II potrebbe essere più vulnerabile alle criolesioni5. In secondo luogo, i danni da citoscheletro indotti dal freddo potrebbero influenzare la rotazione del mandrino, l'estrusione polare del corpo, la migrazione pronucleare e la citocinesi, che potrebbero avere impatti diversi a seconda della fase di sviluppo degli ovociti, influenzando la progressione della meiosi o gli eventi post-fecondazione. Infine, e forse la cosa più importante, mentre gli ovociti maturi sono pronti per essere fecondati, i gameti immaturi si basano sul supporto delle cellule cumuli che circondano per passare attraverso la maturazione nucleare e citoplastica6, e questo è il motivo per cui tutti i complessi cumulo-oocyte (COC) sono crioconservati. Tuttavia, la perdita di cellule cumuli e/o la perdita di connessione funzionale tra il gamete e le cellule somatiche circostanti sono probabilmente l'effetto più dannoso della crioconservazione dei COC immaturi.
Tra le tecniche di crioconservazione, la vetrificazione è una che può essere applicata più facilmente in condizioni di campo. Rispetto al congelamento lento (o a velocità controllata), la vetrificazione è più veloce e non richiede attrezzature specifiche, come un congelatore programmabile. Al fine di soddisfare i tre principi fondamentali della vetrificazione (cioè un'elevata viscosità, collegata ad alta concentrazione crioprotettrice, piccoli volumi e diminuzione ultra-rapida della temperatura), sono stati sviluppati e utilizzati in particolare diversi supporti e supporti nei gatti sia per gli ovociti immaturi che per quelli maturi. A partire da semplici cannucce7, sono stati poi sviluppati dispositivi per raggiungere l'obiettivo "Volume minimo". Cryoloop8, cannucce tirate aperte (OPS)9, grondaie di plastica (paglia modificata)10 e criotubi11 sono stati utilizzati, fino a quando un dispositivo più efficiente (cioè, Cryotop) è stato impiegato11, migliorando la sopravvivenza e meiosis ripresa. Cryotop (Figura supplementare 1) è un supporto disponibile in commercio che è diventato il sistema aperto elettivo per la vetrificazione. Sviluppato per la vetrificazione di ovociti ed embrioni umani, è costituito da una piccola striscia di pellicola attaccata a un supporto di plastica dura, protetta da un tappo di plastica durante lo stoccaggio12. Grazie alla sua usabilità e all'estrema riduzione del volume di vetrificazione (appena 0,1 l), che porta anche a tassi di raffreddamento e riscaldamento estremamente rapidi, questo supporto di vetrificazione è stato sempre più applicato in diverse specie, tra cui il gatto domestico, in cui è stato utilizzato con una varietà di media13,14,15,1616,17.
Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere un protocollo di raccolta-vitrificazione-riscaldamento, con piccole modifiche da quello originariamente sviluppato per gli ovociti umani, che impiega supporti multimediali e commerciali fatti in laboratorio per la vitrificazione del volume minimo e può essere facilmente applicato in condizioni di campo per la crioconservazione dei COC felini immaturini.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipettes &#38; tips</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpels</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Size 10 is usually ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beak</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.CR</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9129</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Advised lenght 230 mm (100+130)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gobelets</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>According to the canisters of the storage tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating stage</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All heating stages are ok, as long as they can keep 38&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repro plate</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.K-2</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage tank</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Any regularly filled tank is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam/nitrogen resistant box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called &#34;Cooling Rack&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timers</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All timers which can be set on times until 9 minutes are ok</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimum volume vitrification of immature feline oocytes

Nei programmi di conservazione degli animali selvatici, la gamete banking è fondamentale per salvaguardare le risorse genetiche di individui di valore e specie rare e per promuovere la conservazione della biodiversità. Nei felini, la maggior parte delle specie sono minacciate di estinzione, e le razze domestiche sono utilizzate come modello per aumentare l'efficienza dei protocolli per il germoplasma bancario. Tra le tecniche di crioconservazione degli ovociti, la vetrificazione è sempre più popolare nella riproduzione assistita umana e veterinaria. La vetrificazione criotopica, che è stata inizialmente sviluppata per gli ovociti umani e gli embrioni, ha dimostrato di essere adatta per gli ovociti di gatto. Questo metodo offre diversi vantaggi, come la fattibilità delle condizioni di campo e la velocità della procedura, che può essere utile quando è necessario elaborare più campioni. Tuttavia, l'efficienza dipende fortemente dalle competenze dell'operatore e sono necessarie una standardizzazione intra-laboratorio e interlaboratorio, nonché la formazione del personale. Questo protocollo descrive la vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi su un supporto commerciale in un protocollo passo dopo passo, favorevole al campo, dalla raccolta degli ovociti al riscaldamento. Seguendo il protocollo, la conservazione dell'integrità e della vitalità degli ovociti al riscaldamento (fino al 90%) ci si può aspettare, anche se c'è ancora spazio per migliorare la maturazione post-riscaldamento e i risultati dello sviluppo embrionale.

Dopo la vitrificazione e il riscaldamento degli ovociti di gatto secondo il protocollo attuale (Figura 1 e Figura supplementare 1), la stragrande maggioranza dei gameti sopravvive. Dopo la vitrificazione, tra le altre tecniche, la vitalità può essere valutata al microscopio ottico come integrità morfologica22 o con l'uso di macchie vitali. Uno di questi ultimi è fluoresceina diacetate/propidio iodide (FDA/PI), che consente l'identificazione di viv...

Watch this Scientific Journal Video about Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes at JoVE.com

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Questo manoscritto descrive un protocollo per la vetrificazione del volume minimo di ovociti di gatto immaturi con supporti fatti in laboratorio su supporti commerciali. Copre ogni passo dall'isolamento degli ovociti dalle gonadi ex vivo alla vetrificazione e al riscaldamento.

Vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Questo protocollo è utile per la conservazione a lungo termine degli ovociti felini attraverso una tecnica di crioconservazione nota come vetrificazione, che è cruciale per la fertilità e la conservazione della biodiversità nelle specie animali. I principali vantaggi della vetrificazione sono la sua velocità poiché può essere completata in meno di 17 minuti e la sua fattibilità in condizioni di campo se è disponibile azoto liquido. Il gatto domestico è un modello praticabile per i felini selvatici in via di estinzione.Lo sviluppo e l'ottimizzazione dei protocolli di crioconservazione consentirebbero di stabilire biobanche gamete per programmi di conservazione felina. Inizia preparando una piastra di vetrificazione Repro con tre pozzi conici in una riga. Aggiungere 20 microlitri di soluzione di equilibrazione al primo pozzo e 300 microlitri di soluzione di vetrificazione al secondo e al terzo pozzo.Per equilibrare i complessi di ovocite cumulos, o COC, utilizzare una pipetta a piccolo foro per trasferire uno o più complessi sul fondo del primo pozzo. Aggiungere lentamente 20 microlitri di soluzione di equilibrazione al bordo della goccia e attendere tre minuti, quindi aggiungere altri 240 microlitri di soluzione di equilibrazione e attendere nove minuti. Durante l'attesa, preparare una scatola con azoto liquido ed etichettare un supporto di vetrificazione con l'esperimento o il codice di identificazione del gatto.Metti la scatola e il supporto vicino al microscopio stereo. Dopo aver equilibrato i COC, eseguire la vetrificazione in meno di 90 secondi. Per vetrificare i COC, riempire la pipetta a piccolo foro con la soluzione di vetrificazione dal secondo pozzo.Prendi i COC dal fondo del primo pozzo e spostali sulla superficie del secondo pozzo. Lavare la pipetta con la soluzione di vetrificazione, quindi spostare i COC in un'altra area del pozzo e mescolare la soluzione circostante. Riempire la pipetta con soluzione da un'altra area del pozzo.Spostare i COC e mescolare il mezzo che li circonda con la pipetta. Ripetere questo processo ancora una volta. Quindi, lavare la pipetta con la soluzione di vetrificazione dal terzo pozzo e utilizzarla per spostare i COC sul fondo del terzo pozzo.Ancora una volta, mescolare la soluzione circostante. Dopo aver riempito la pipetta con soluzione da un'altra area del pozzo, spostare i COC e mescolare la soluzione. Ripetere questo processo.Riempire la punta della pipetta con la soluzione di vetrificazione da un'altra area del pozzo e utilizzarla per caricare i COC sul nastro del supporto di vetrificazione vicino alla punta, quindi aspirare il mezzo in eccesso. Immergere immediatamente il supporto di vetrificazione in azoto liquido e utilizzare morsetti per chiuderlo, assicurandosi che rimanga immerso. Conservare i supporti di vetrificazione caricati in un calice e conservarli in un serbatoio di azoto liquido di stoccaggio fino al riscaldamento.Posizionare lo stadio di riscaldamento vicino al microscopio stereo e accenderlo a 38 gradi Celsius. Scaldare il coperchio di una piastra di Petri sopra il palco, quindi trasferire i supporti di vetrificazione dal serbatoio di stoccaggio a una scatola con azoto liquido. Preparare una fila di una piastra Repro per ogni supporto di vetrificazione da riscaldare.Aggiungere 300 microlitri di soluzione di diluizione al primo pozzo e 300 microlitri di soluzione di lavaggio al secondo e al terzo pozzo. Togliere la soluzione di scongelamento dall'incubatrice e far cadere 100 microlitri sul coperchio della piastra di Petri. Utilizzare i morsetti per aprire il supporto di vetrificazione all'interno dell'azoto liquido.Posizionare il coperchio della piastra di Petri al microscopio stereo, quindi raccogliere rapidamente il supporto di vetrificazione e immergere la sua striscia nella goccia, spostandolo fino a quando tutti i COC si staccano. Rimuovere il supporto dalla goccia non appena è vuoto, ma lasciare i COC nella soluzione di scongelamento per un minuto. Riempire una pipetta con soluzione di diluizione e utilizzarla per spostare i COC dalla soluzione di scongelamento cadere sul fondo del primo pozzo con soluzione di diluizione.Lasciare i COC lì per tre minuti. Lavare la pipetta con la soluzione di lavaggio dal secondo pozzo, quindi prendere i COC e spostarli sul fondo del secondo pozzo. Aspetta cinque minuti.Lavare la pipetta con una soluzione dal terzo pozzo e utilizzarla per spostare i COC dal secondo pozzo alla superficie del terzo pozzo. Attendere che i COC tocchino bene la parte inferiore del terzo pozzo. Quindi ripetere il processo con un'altra area del pozzo.Al termine, lavare la pipetta con un mezzo di coltura e spostare gli ovociti in un piatto di coltura. La stragrande maggioranza dei gameti sopravvive dopo la vetrificazione e il riscaldamento degli ovociti secondo questo protocollo. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa di un valido complesso di ovocite cumulo di gatto riscaldato vetrificato macchiato di diacetato di fluoresceina e ioduro di propidio.Questa tabella mostra la percentuale di sopravvivenza dopo la vetrificazione, che descrive i dati post-riscaldamento degli ovociti destinati alla maturazione in vitro. Su 435 ovociti, 395 sopravvissero, segnando una redditività complessiva del 90,8% dopo il riscaldamento. Tuttavia, alcuni cambiamenti morfologici possono essere notati dopo il riscaldamento.Le anomalie morfologiche più frequenti sono i cambiamenti nella forma e nella granulazione dell'ooplasma, la perdita parziale o talvolta totale di cellule cumuliformi e le fratture della zona pellucida. Quando si tenta questa procedura, ricordarsi di preparare i supporti in anticipo in modo che siano la temperatura giusta prima dell'uso e di seguire le temperature e i tempi del protocollo per evitare la tossicità cellulare. Il protocollo potrebbe essere applicato anche agli ovociti di altre specie.In caso di successo, ciò potrebbe anche contribuire alla banca del plasma germinale per la conservazione della biodiversità nei felini in via di estinzione.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

L&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; By mRNA iniezione in ovociti non fecondate

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Modificato vetrificazione MicroSecure: Un altamente Procedura Crioconservazione sicuro ed efficace, semplice e per blastocisti umane

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Un'identificazione basato su rete neurale di ovociti adulto Mouse inerente allo sviluppo competente o incompetente

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Trasferimento embrionale minimamente invasivo e vetrificazione embrionale nella fase embrionale ottimale nel modello Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

Biopsia e vetrificazione dell'esplosione umana

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Strategia di coltura in vitro per oociti dal follicolo antralico precoce nel bestiame

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...