Name: minimum volume vitrification of immature feline oocytes
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00
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この作品の一部は、EVSSAR(欧州小動物生殖協会)グラント2016とミラノ大学、ピアノ・ディ・ソステグノ・アラ・リセルカ2019(リネア2アツィオーネA)によって支えられていました。また、マリアジョルジア・モルセリ博士がここに描かれた実験に貢献し、画像取得に貢献してくれたことに感謝したいと思います。

ここに描かれた手順は、猫の卵巣が獣医院で、飼い主が要求した定期的な卵巣切除術または卵巣子宮摘出術による副産物として採取されたので、倫理的承認を受けなかった。
1. 卵母細胞コレクション
<ol><li>実験を開始する前に、卵巣および卵母細胞の収集のための溶液を準備する。抗生物質と抗ミキサイト剤(ペニシリンGナトリウム100 IU/mL、ストレプトマイシン硫酸塩0...

<ol>
	<li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+social+implications+of+embryo+cryopreservation.">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li><li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification.">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li><li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat.">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li><li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids.">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li><li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+and+mammalian+gametes.">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li><li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence.">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li><li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose.">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li><li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen.">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes.">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li><li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes.">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).</li><li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes.">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li><li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos:+The+Cryotop+method.">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).</li><li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification,+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer.">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li><li>Galiguis, J., G&#243;mez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes.">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li><li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique.">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions.">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329 (2019).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture:+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes.">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li><li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature,+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro.">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li><li>Cobo, A., Kuwayama, M., P&#233;rez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remoh&#237;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method.">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li><li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cryobiology.">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li><li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation+by+vitrification.">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li><li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification.">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li><li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation.">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li><li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos:+current+problems+and+future+perspectives.">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li><li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes.">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li><li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+(Felis+catus)+in+reproductive+season.">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li><li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viability+of+Serval+(Leptailurus+serval)+and+Pallas+Cat+(Felis+manul)+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method.">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li></ol>

卵母細胞凍結保存は、特にフェリダエ家のような多くの種が絶滅の危機に瀕しているタキサにおいて、重要な胚芽保護技術である。本稿では、未熟な猫卵母細胞のガラス化のためのシンプルで現場に優しいプロトコルが提示された。実験室製のメディア、最小体積ガラス化サポートおよび訓練を受けた人員は、この方法の成功のための重要な要因であり、この方法の成功の鍵となる要因であ?...

凍結保存は、再生支援技術(ART)の重要なステップとなっています。人間では、医療や個人的な理由で生殖能力の保持や親の延期を可能にします。動物では、特に家畜やペットの計画交配の距離と時間を克服したり、特に野生の絶滅危惧種の保全プログラムで貴重な被験者の遺伝物質を保存する必要があります。配育する個体がまだ選ばれていない場合、または特にヒト医学における胚凍結に関連する倫理的問題を回避するために、配られる人が選ばれなかった場合の最良の選択である。精子は比較的簡単に保存し、解凍後に満足のいく結果を与えるが、卵母細胞は、その構造的特徴のために、保存するのがより複雑である可能性がある。実際、低い表面/体積比は、卵形プラズマを囲む透明帯の存在と同様に、細胞2を横切る凍結保護剤および水の移動を制限する。さらに、フェリドを含む家畜では、脂質が豊富な細胞質が特徴であり、凍結保存に対してより敏感であると考えられている。
ほとんどのフェリドは脅かされ、家畜猫は定期的な卵巣切除術から生殖腺が利用可能なおかげで生殖器保存のためのプロトコルを開発するためのモデルとして使用されます。野生動物では、生殖腺は、選択的手術後、または(より頻繁に) 死後に得ることができ、未熟な(胚芽小胞)配偶を取り出すことができます。成熟した(メタフェーズII)卵母細胞を得ることを目的としたホルモン刺激は、倫理的な問題と治療4に対する種および個々の特異的応答のためにヒトARTほど一般的ではない。
したがって、凍結保存戦略の開発は、通常、まれな個体の予期せぬまたは突然の死の後に取り出すことができる未熟なアテです。生物学的な観点から、未熟または成熟したアテの凍結保存にはいくつかの違いがあり、それぞれがその利点を有する。第一に、DNAは、胚芽小胞が核膜に囲まれた染色体を含む未熟な卵母細胞でより保護され、メタフェーズII卵母細胞のmeioticスピンドルは凍結傷害に対してより脆弱である可能性がある5。第二に、冷間誘発細胞骨格の損傷は、紡錘の回転、極体押出、前核移動およびサイトカネシスに影響を及ぼし、卵母細胞発生期に応じて異なる影響を及ぼし、微粉症の進行または受精後の事象に影響を及ぼす可能性がある。最後に、おそらく最も重要なのは、成熟した卵母細胞が受精する準備ができているのに対し、未熟なジマテは核および細胞質成熟6を通過するために周囲の積雲細胞の支持に依存しており、これが積雲母細胞複合体(COC)全体が凍結保存されている理由である。しかし、乳液細胞の喪失や、カテと周囲の体細胞との間の機能的なつながりの喪失は、おそらく未熟なCOCcの凍結保存の最も有害な影響である。
凍結保存技術の中でも、ガラス化は、フィールド条件でより容易に適用できるものです。低速(または制御速度)の凍結と比較して、ガラス化はより速く、プログラム可能な冷凍庫のような特定の装置を必要としない。ガラス化の三つの基本原則(すなわち、高粘度、高い凍結保護濃度、少量および超急速温度減少に結び付く)を満たすために、いくつかの媒体および支持剤は、特に未熟および成熟卵子の両方のために猫で開発され、使用されてきた。単純なストロー7から始まり、デバイスは「最小音量」目標に到達するために開発されました。クライオループ8、オープンプルストロー(OPS)9、プラスチック側溝(変性ストロー)10及びクライオチューブ11が用いられ、より効率的な装置(すなわち、クライオトップ)が採用されるまで、生存率及び明治を改善する。9クライオトップ(補足図1)は、ガラス化用の選択開放システムとなっている市販のサポートです。ヒト卵母細胞および胚のガラス化のために開発され、それは、貯蔵12の間にプラスチック管キャップによって保護された硬いプラスチックホルダーに取り付けられた小さなフィルムストリップからなる。ガラス化容積の極度の減少(わずか0.1μL)により、このガラス化サポートは、家庭用ネコを含む数種にますます適用され、様々なメディア13、14、15、16、17と共に使用されています。13,14,15,16,17
この原稿の目的は、実験室製のメディアと商業支援を用いて最小の体積ガラス化のために使用し、未熟なネコCOCの凍結保存のためのフィールド条件で容易に適用することができるヒト卵母細胞のために最初に開発されたものからのマイナーな変更を伴う、コレクションガラス化温暖化プロトコルを記述することです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipettes &#38; tips</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpels</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Size 10 is usually ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beak</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.CR</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9129</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Advised lenght 230 mm (100+130)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gobelets</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>According to the canisters of the storage tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating stage</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All heating stages are ok, as long as they can keep 38&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repro plate</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.K-2</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage tank</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Any regularly filled tank is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam/nitrogen resistant box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called &#34;Cooling Rack&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timers</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All timers which can be set on times until 9 minutes are ok</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimum volume vitrification of immature feline oocytes

野生動物の保護プログラムでは、有価者や希少種の遺伝資源を保護し、生物多様性保全を促進するために、テガレバンキングが重要です。フェリドでは、ほとんどの種が絶滅の危機に瀕しており、国内の品種は、ゲルプラズムバンキングのためのプロトコルの効率を高めるためのモデルとして使用されています。卵母細胞凍結保存技術の中で、ガラス化はヒトおよび獣医支援生殖においてますます普及している。ヒト卵母細胞および胚のために最初に開発されたクライオトップガラス化は、猫の卵母細胞に適することが実証された。この方法には、フィールド条件の実現可能性や手順の速度など、いくつかの利点があり、いくつかのサンプルを処理する必要がある場合に役立ちます。しかし、効率はオペレータのスキルに大きく依存し、ラボ内およびラボ間の標準化、および人員訓練が必要です。このプロトコルは、卵母細胞の収集から温暖化まで、ステップバイステップのフィールドフレンドリーなプロトコルで商業的サポート上の未熟なネコ卵母細胞の最小体積ガラス化を記述する。プロトコルに従って、温暖化時の卵母細胞の完全性と生存率の維持(90%まで高い)温暖化後の成熟と胚発生の結果にはまだ改善の余地があるが、期待できる。

本プロトコル(図1および補足図1)に従ってネコの卵卵子ガラス化および温暖化に続き、大多数のシロネコが生存する。ガラス化後、他の技術の中でも、生存率は、形態学的完全性22として、またはバイタル染色を使用して光学顕微鏡で評価することができる。後者の1つは、生き生きとしている(明るい緑色蛍光)と死細胞(赤い蛍光)を同定でき...

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Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

本稿は、商業的支援上の実験室製のメディアを用いた未熟な猫卵母細胞の最小体積ガラス化のためのプロトコルを記述する。それは、エキビボ生殖腺からガラス化および温暖化に至る卵母細胞の分離からあらゆるステップをカバーする。

未熟ネコの最小体積ガラス化

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

このプロトコルは、動物種の生殖能力と生物多様性の保存に不可欠なガラス化と呼ばれる凍結保存技術を通じて、ネコ卵母細胞の長期的な保存に有用である。ガラス化の主な利点は、液体窒素が利用可能な場合、17分未満で完了することができるので、その速度とフィールド条件での実現可能性です。飼い猫は野生の絶滅危惧種のネコの実行可能なモデルです。凍結保存プロトコルの開発と最適化により、ネコ保護プログラムのためのテレットバイオバンクを確立することができます。1 列に 3 つの円錐形のウェルを持つ Repro ガラス化プレートを準備します。第1ウェルに平衡液20マイクロリットル、2番目と3番目のウェルに300マイクロリットルのガラス化溶液を加えます。積雲卵母細胞複合体、またはCOCを平衡化するには、小孔ピペットを使用して、1つ以上の複合体を第1ウェルの底部に移す。ゆっくりと20マイクロリットルの平衡溶液を落下の境界に加え、3分間待ってから、さらに240マイクロリットルの平衡溶液を加え、9分間待ちます。待っている間、液体窒素の箱を準備し、実験または猫の識別コードでガラス化のサポートにラベルを付けます。箱と支をステレオ顕微鏡の近くに置きます。COCを平衡化した後、90秒未満でガラス化を行います。COCsをビトリフィとして、小ボアピペットに第2ウェルのガラス化液を充填します。最初のウェルの底からCOCを取り、2番目の井戸の表面に移動します。ガラス化溶液でピペットを洗浄し、COCをウェルの別の領域に移動させ、周囲の溶液を混合します。ウェルの別の領域からの溶液でピペットを充填します。COCを動かし、周囲のミディアムをピペットと混ぜます。このプロセスをもう一度繰り返します。次に、3番目のウェルからガラス化溶液でピペットを洗浄し、それを使用してCOCsを3番目のウェルの底に移動させます。ここでも、周囲の溶液を混ぜます。配管を別のウェルの領域から溶液で満たした後、COCsを動かし、溶液を混合します。このプロセスを繰り返します。ピペットチップにウェルの別の領域からのガラス化溶液を充填し、それを使用してチップに近いガラス化支持体のストリップにCOCsをロードし、余分な培地を吸引します。すぐに液体窒素中のガラス化支持を突き落とし、クランプを使用して閉じ、浸漬したままであることを確認します。ロードされたガラス化サポートをゴブレットに保管し、加温するまで貯蔵液窒素タンクに保管してください。熱の段階をステレオ顕微鏡の近くに置き、38°Cにします。ステージの上にペトリ皿の蓋を温め、その後、ガラス化支持体を貯蔵タンクから液体窒素付きの箱に移します。各ガラス化支持体を温めるごとに、Reproプレートの1列を用意します。第1ウェルに300マイクロリットルの希釈液を加え、300マイクロリットルの洗浄液を第2および第3の井戸に加えます。解凍液をインキュベーターから取り出し、ペトリ皿の蓋に100マイクロリットルを落とします。クランプを使用して、液体窒素の内部でガラス化支持体を開きます。ペトリ皿の蓋をステレオ顕微鏡の下に置き、ガラス化支持体を素早く拾い上げ、ストリップをドロップに浸し、すべてのCOCsが切り離されるまで動かします。サポートが空になるとすぐにドロップからサポートを削除しますが、COC は 1 分間解凍ソリューションに残します。ピペットに希釈液を充填し、それを使用して、融解液の低下から希釈液の底部にCOCsを移動させます。COCは3分間そこに置いておきます。2番目の井戸から洗浄液でピペットを洗い、その後、COCsを取り、第二の井戸の底にそれらを移動します。5 分間待ちます。ピペットを3番目の井戸から溶液で洗い、それを使用してCOCを第2ウェルから第3ウェルの表面に移動させます。COCが3番目の井戸の底に触れるのを待ちます。次に、別のウェル領域でプロセスを繰り返します。完成したら、培養液でピペットを洗い、卵母細胞を培養皿に移します。このプロトコルに従って、大多数のジテが卵母細胞のガラス化と温暖化の後に生き残る。フルオレセイン・ジアセテートとヨウ化プロピジウムで染色された生き生きとしたガラス化された温めたネコ積雲卵母細胞複合体の代表的な画像をここに示す。この表は、体外成熟を目的とした卵母細胞の温暖化後のデータを示すガラス化後の生存率を示しています。435の卵母細胞のうち、395人が生き残り、全体の90.8%の温暖化後の生存率を獲得しました。しかし、いくつかの形態学的変化は、温暖化後に気づくことができます。最も頻繁な形態異常は、卵形の形状および造粒、積雲細胞の部分的または時には全損失、および透明帯骨折の変化である。この手順を試みる際には、使用前に適切な温度になるようにメディアを事前に準備し、細胞毒性を避けるためにプロトコルの温度とタイミングに従うことを忘れないでください。このプロトコルは、他の種の卵母細胞にも適用できます。成功すれば、絶滅の危機に瀕しているネコの生物多様性保全のための胚芽プラスムバンキングにも貢献する可能性があります。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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