Name: minimum volume vitrification of immature feline oocytes
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00
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이 작품은 부분적으로 EVSSAR에 의해 지원되었다 (작은 동물 재생을위한 유럽 수의학 협회) 그랜트 2016 및 Università degli Studi 디 밀라노, 피아노 디 소스테그노 알라 Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A)에 의해 지원되었다. 또한 마리아조르지아 모셀리 박사가 이 실험에 기여한 것에 대해 감사드리며, 이미지 수집에 기여하고 자합니다.

이에 따라 묘사된 절차는 고양이 난소가 수의장에서 주인이 요청한 일상적인 혈관 절제술 또는 혈관 절제술의 부산물로서 수집되었기 때문에 윤리적 승인을 받지 못했습니다.
1. 오사이클 컬렉션
<ol><li>실험을 시작하기 전에 난소 및 난소 수집을 위한 솔루션을 준비합니다. 항생제와 항마이코틱스(페니실린 G 나트륨 100 IU/mL, 연쇄상 구균 황산염 0.1 mg/mL, 암포테린 비의 0.25 μg...

<ol>
	<li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+social+implications+of+embryo+cryopreservation.">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li><li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification.">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li><li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat.">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li><li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids.">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li><li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+and+mammalian+gametes.">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li><li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence.">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li><li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose.">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li><li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen.">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes.">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li><li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes.">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).</li><li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes.">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li><li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos:+The+Cryotop+method.">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).</li><li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification,+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer.">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li><li>Galiguis, J., G&#243;mez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes.">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li><li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique.">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions.">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329 (2019).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture:+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes.">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li><li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature,+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro.">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li><li>Cobo, A., Kuwayama, M., P&#233;rez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remoh&#237;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method.">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li><li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cryobiology.">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li><li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation+by+vitrification.">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li><li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification.">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li><li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation.">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li><li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos:+current+problems+and+future+perspectives.">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li><li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes.">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li><li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+(Felis+catus)+in+reproductive+season.">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li><li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viability+of+Serval+(Leptailurus+serval)+and+Pallas+Cat+(Felis+manul)+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method.">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li></ol>

오키테 냉동 보존은 특히 펠리대 가족과 같이 많은 종들이 멸종 위기에 처한 택시에서 중요한 세균 보존 기술입니다. 이 원고에서는 미숙한 고양이 난모세포의 유리화를 위한 간단하고 현장 친화적인 프로토콜이 제시되었습니다. 실험실에서 만든 미디어, 최소 볼륨 바이트화 지원 및 훈련 된 인력은이 방법의 성공을위한 핵심 요소이며, 이는 실행 가능한 난모세포를 일관되고 반복적으로 얻을 수...

냉동 보존은 보조 재생 기술 (ARTs)의 핵심 단계가되었습니다. 인간에서는, 그것은 의학 또는 개인적인 이유로 부모의 불임 또는 연기의 보존을 허용합니다. 동물에서는 계획된 짝짓기, 특히 농장 동물과 애완 동물에서 거리와 시간을 극복하거나 특히 야생 멸종 위기에 처한 종의 보존 프로그램에서 귀중한 과목의 유전 물질을 보존할 필요가 있습니다. Gamete 냉동 보존은 사육할 개인이 아직 선택되지 않았거나 배아 동결과 관련된 윤리적 문제를 피하기 위해 선택되지 않았을 때, 특히 인간 의학1에서최선의 선택입니다. 정자는 해동 후 비교적 보존하고 만족스러운 결과를 제공하기 쉽지만, 구조적인 특징으로 인해 난모세포는 보관하기가 더 복잡할 수 있습니다. 실제로, 낮은 표면/부피 비뿐만 아니라 우플라즈마를 둘러싼 조나 펠루치다의 존재는 셀2를가로지르는 극저온 보호제와 물의 이동을 제한한다. 또한, 골뚜껑을 포함한 국산 동물에서는 지질이 풍부한 세포질이 특징이며, 이는 냉동 보존3에더 민감하게 반응할 것으로 생각된다.
대부분의 고양이는 위협을 받고 있으며, 국내 고양이는 일상적인 ovariectomy에서 생식샘의 가용성 덕분에 세균 보존을위한 프로토콜을 개발하는 모델로 사용됩니다. 야생 동물에서는, 생식강은 선택적 수술 후 또는 (더 자주) 사후 사후후에 얻을 수 있고, 미숙한 (발아 소포) 게임테스는 회수될 수 있습니다. 성숙한 (담수 II) 난모세포는 치료4에대한 윤리적 문제와 종 및 개별별 반응으로 인해 인간 ART에서와 같이 일반적이지 않다.
따라서, 냉동 보존 전략의 개발은 일반적으로 희귀 한 개인의 예기치 않거나 갑작스런 죽음 후 검색 할 수있는 미숙한 게임에 초점을 맞추고있다. 생물학적 관점에서, 미숙하거나 성숙한 게임족의 냉동 보존에 약간의 차이가 있습니다. 첫째, DNA는 미성숙 한 난모세포에서 더 보호되며, 발아 소포에는 핵 막으로 둘러싸인 염색체가 포함되어 있으며, 메타 위 II 난우세포의 메이오틱 스핀들 (meiotic spindle)은 극저온 부상5에더 취약 할 수 있습니다. 둘째, 냉으로 유발된 사이토스켈레톤 손상은 척추 회전, 극지 체압, 핵 이동 및 사이토카네시스에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 난소 세포 발달 단계에 따라 다른 영향을 미칠 수 있으며, 이는 메이오시스 진행 또는 후 수정 사건에 영향을 미칩니다. 마지막으로, 아마도 가장 중요한 것은, 성숙한 난모세포가 수정될 준비가 되어 있는 반면, 미숙한 게임들은 핵과 세포질성숙6을통과하기 위해 주변 적혈구의 지원에 의존하며, 이것이 전체 적혈구-오낭복합체(COC)가 극저온보존되는 이유입니다. 그러나, 적혈구의 손실 및/또는 게임및 주변 체세포 사이 기능적인 연결의 손실은 아마 미숙한 COCs의 극저온 보존의 가장 해로운 효력일 것입니다.
극저온 보존 기술 중, 진동은 필드 조건에서 더 쉽게 적용 할 수있는 하나입니다. 느린(또는 제어 속도) 동결에 비해, 유리화는 빠르며 프로그래밍 가능한 냉동고와 같은 특정 장비가 필요하지 않습니다. 유리화의 세 가지 기본 원칙(즉, 높은 점도, 높은 극저온 보호 농도, 소량 및 초고속 온도 감소)을 충족시키기 위해, 여러 미디어와 지지는 특히 미숙하고 성숙한 난모세포 모두에 대해 고양이에서 개발및 사용되었습니다. 간단한 빨대7로시작하여 장치가 개발되어 "최소 볼륨"목표에 도달했습니다. Cryoloop8,오픈 풀기 빨대 (OPS)9,플라스틱 배수구 (수정 된 빨대)10 및 냉동 튜브(11)가 사용되었으며, 보다 효율적인 장치 (즉, Cryotop)가11을고용하여 생존 및 메이오시스 재개를 개선하였다. 극저온(보충도1)은시험신화를 위한 선택개방 시스템이 된 시판지원이다. 인간 난모세포와 배아의 유리화를 위해 개발된 이 스트립은 단단한 플라스틱 홀더에 부착된 작은 필름 스트립으로 구성되어 있으며, 저장12에서플라스틱 튜브 캡에 의해 보호된다. 사용효과와 매우 빠른 냉각 및 온난화 율로 이어지는 유리화 부피(0.1 μL 만큼 약간)의 극단적인 감소덕분에, 이 병신 지원은 다양한 미디어,13,,14,15,16,17로사용되고 있는 국내 고양이를 포함한 여러 종에서 점점 더 많이 적용되고있다.,
이 원고의 목적은 수집 -유리화 온난화 프로토콜을 설명하는 것입니다, 원래 인간의 난모세포에 대해 개발 된 것에서 사소한 수정, 이는 실험실 만든 미디어 및 최소 볼륨 유리화에 대한 상업 지원을 고용하고 미숙한 고양이 COC의 냉동 보존을위한 필드 조건에서 쉽게 적용 할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipettes &#38; tips</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpels</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Size 10 is usually ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beak</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.CR</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9129</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Advised lenght 230 mm (100+130)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gobelets</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>According to the canisters of the storage tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating stage</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All heating stages are ok, as long as they can keep 38&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repro plate</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.K-2</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage tank</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Any regularly filled tank is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam/nitrogen resistant box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called &#34;Cooling Rack&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timers</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All timers which can be set on times until 9 minutes are ok</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimum volume vitrification of immature feline oocytes

야생 동물의 보존 프로그램에서 gamete 뱅킹은 귀중한 개인과 희귀 종의 유전 자원을 보호하고 생물 다양성 보존을 촉진하는 데 매우 중요합니다. 고양이에서, 대부분의 종은 멸종 위협, 국내 품종은 세균 은행 프로토콜의 효율성을 높이기 위해 모델로 사용된다. 난염 극저온 보존 기술 중, 유리화는 인간과 수의학 지원 생식에서 점점 더 인기가 있습니다. 인간 난모세포와 배아를 위해 처음 개발된 극저온 상체화는 고양이 난모세포에 적합하다는 것을 입증했습니다. 이 방법은 여러 샘플을 처리해야 할 때 유용할 수 있는 현장 조건의 타당성 및 절차 속도와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 그러나 효율성은 작업자의 기술에 크게 의존하며, 실험실 간 표준화와 인력 교육이 필요합니다. 이 프로토콜은 난소 수집에서 온난화에 이르기까지 단계별 필드 친화적 인 프로토콜에 의해 단계적으로 상업적 지원에 미숙한 고양이 난모세포의 최소 볼륨 바이트화를 설명합니다. 프로토콜에 따라 온난화시 난낭 무결성 및 생존 가능성 보존(90%까지 높음) 온난화 후 성숙과 배아 발달 결과에 개선을 위한 여지가 여전히 남아 있지만, 예상될 수 있습니다.

현재 프로토콜(도 1 및 보충도1)에 따라 고양이 의진동및 온난화에 따라 대부분의 게임테가 살아남습니다. 생체화 후, 다른 기술 중에서도 생체내성(22)으로 광학 현미경에서 또는 중요한 얼룩을 사용하여 생존성을 평가할 수 있다. 후자 중 하나는 형광 희석제 /propidium 요오드 (FDA/PI), 실행 가능한의 식별을 허용 (밝은 녹색 형광) 및 죽은 세포 (적...

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Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

이 원고는 상업적 지원에 실험실에서 만든 미디어와 미숙한 고양이 난모세포의 최소 볼륨 바이트화에 대한 프로토콜을 설명합니다. 전 생체 부 조나에서 바이피화및 온난화에 이르는 난소 분리에서 부터 모든 단계를 다룹니다.

미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

이 프로토콜은 동물 종의 다산 및 생물 다양성 보존에 중요한 유리화로 알려진 냉동 보존 기술을 통해 고양이 난모세포의 장기 보존에 유용합니다. 유리화의 주요 장점은 액체 질소를 사용할 수있는 경우 17 분 이내에 완료 할 수 있기 때문에 속도와 필드 조건에서의 타당성입니다. 국내 고양이는 야생 멸종 위기에 처한 고양이의 실행 가능한 모델입니다.냉동 보존 프로토콜의 개발 및 최적화는 고양이 보존 프로그램을 위한 게임테 바이오뱅크를 설립할 수 있게 해 줄 것입니다. 한 줄에 세 개의 원뿔형 우물이 있는 Repro 진동판을 준비하여 시작합니다. 제1웰에 20마이크로리터의 평형 용액과 2차 및 세 번째 우물에 300마이크로리터의 진동용 액수를 추가합니다.적정 한 oocyte 복합체 또는 COC를 평형하려면 작은 보어 파이펫을 사용하여 하나 이상의 복합체를 첫 번째 우물의 바닥으로 옮깁니다. 천천히 20 마이크로리터의 평형 용액을 드롭 테두리에 넣고 3분 간 기다린 다음, 240마이크로리터의 평형 솔루션을 추가하고 9분 동안 기다립니다. 기다리는 동안 액체 질소로 상자를 준비하고 실험 또는 고양이 식별 코드로 유리화 지지체에 라벨을 붙입니다.스테레오 현미경 근처에 상자와 지원을 넣어. COC를 상화한 후 90초 이내에 진동을 수행합니다. COC를 진동시키기 위해 작은 보어 파이펫을 두 번째 우물에서 바이트화 용액으로 채웁니다.첫 번째 우물의 바닥에서 COC를 가져 와서 두 번째 우물의 표면으로 이동합니다. 바이트화 용액으로 파이펫을 씻은 다음 COC를 우물의 다른 영역으로 이동하고 주변 용액을 혼합합니다. 파이펫을 우물의 다른 영역에서 용액으로 채웁니다.COC를 이동하고 주변 의 매체를 파이펫과 혼합합니다. 이 프로세스를 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 세 번째 우물에서 바이트화 용액으로 파이펫을 세척하고 COC를 세 번째 우물의 바닥으로 이동하는 데 사용합니다.다시, 주변 솔루션을 혼합. 파이펫을 우물의 다른 영역에서 용액으로 채운 후 COC를 이동하고 솔루션을 혼합합니다. 이 프로세스를 반복합니다.파이펫 팁을 우물의 다른 영역에서 바이트화 용액으로 채우고 팁 에 가까운 유리화 지지대스트립에 COC를 로드한 다음 초과 배지를 흡인시합니다. 즉시 액체 질소에 유리화 지원을 급락하고 그것을 닫기 위해 클램프를 사용하여, 그것은 침지 남아 있는지 확인. 로드된 유리화 지지대를 잔에 보관하고 온난화될 때까지 저장 액체 질소 탱크에 보관하십시오.가열 단계를 스테레오 현미경에 가깝게 놓고 섭씨 38도로 켭니다. 페트리 접시뚜껑을 무대 위에 데운 다음, 유리화 지지대를 저장 탱크에서 액체 질소가 있는 상자로 옮습니다. 각 진동 지지체가 따뜻해질 수 있도록 Repro 플레이트 한 줄을 준비합니다.제1웰에 300마이크로리터의 희석액을 추가하고 제2 및 세 번째 웰에 300마이크로리터의 세척 용액을 추가합니다. 해빙 용액을 인큐베이터에서 꺼내 페트리 접시 뚜껑에 100 마이크로리터를 떨어 뜨립니다. 클램프를 사용하여 액체 질소 내부의 진동 지원을 엽니다.페트리 접시 뚜껑을 스테레오 현미경 아래에 놓고, 신속하게 유리화 지지대를 집어 들고 스트립을 드롭에 담그고 모든 COC가 분리 될 때까지 움직입니다. 비어 있는 즉시 드롭에서 지원을 제거하지만 COC를 해동 용액에 1분 동안 둡니다. 희석 용액으로 파이펫을 채우고 이를 사용하여 COC를 해동 용액 드롭에서 희석 용액으로 첫 번째 우물의 바닥으로 이동합니다.3 분 동안 거기에 COC를 둡니다. 두 번째 잘 세척 용액으로 파이펫을 씻은 다음 COC를 가져 와서 두 번째 의 바닥으로 잘 옮겨 넣습니다. 5분 간 기다립니다.파이펫을 세 번째 우물에서 용액으로 씻고 COC를 두 번째 우물에서 세 번째 우물의 표면으로 이동하는 데 사용합니다. COC가 세 번째 우물의 바닥을 만질 때까지 기다립니다. 그런 다음 다른 우물 영역으로 프로세스를 반복합니다.완료되면 배양 매체로 파이펫을 씻고 난모세포를 문화 요리로 옮깁니다. 게임의 대부분은 이 프로토콜에 따라 난분염 진동과 온난화 후에 살아남습니다. 플루오레세인 디아세테이트와 프로피듐 요오드로 얼룩진 생존 가능한 유리화된 온난한 고양이 cumulus oocyte 복합체의 대표적인 사진이 여기에 표시됩니다.이 표는 시험관 내 성숙을 위한 난온세포의 후온후 데이터를 묘사하는 시험화 후 생존의 비율을 보여줍니다. 435개의 난초 중 395개를 살아남았고, 온난화 후 생존능력은 90.8%를 기록했습니다. 그러나, 일부 형태학적 변화는 온난화 후 발견 될 수있다.가장 빈번한 형태학적 이상은 ooplasm 모양과 과립의 변화, 적운 세포의 부분적 또는 때로는 총 손실, 및 조나 펠루시다 골절입니다. 이 절차를 시도할 때, 사용 전에 올바른 온도가 되도록 미디어를 미리 준비하고 세포 독성을 피하기 위해 프로토콜 온도와 타이밍을 따라야 합니다. 프로토콜은 또한 다른 종의 난모세포에 적용될 수 있었습니다.성공하면 멸종 위기에 처한 고양이의 생물 다양성 보존을 위한 세균 플라스엠 뱅킹에도 기여할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

형광 단백질의 발현에<em&gt; 창고 기</em&gt; 미 수정 난자에 mRNA의 주입에 의한

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

연구

발생학

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

수정 MicroSecure의 유리화 : 인간 배반포를위한 안전 간단하고 매우 효과적인 냉동 보존 절차

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

말의 난 모세포에서의 염색체 분리, 히스톤 아세틸 화 및 스핀들 형태의 분석

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

토끼 모형에 있는 최적 배아 단계에서 최소 침 습 배아 이식 및 배아 확산

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

인간 배반포 생검 및 유리화

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

얼룩말 피시의 난소 여포에서 여포 세포와 난소 세포의 분리

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...