Denne protokollen er nyttig for langsiktig bevaring av feline oocytes gjennom en kryopreservation teknikk kjent som med vitrifisering, som er avgjørende for fruktbarhet og biologisk mangfold bevaring i dyrearter. De viktigste fordelene med vitrifisering er hastigheten siden den kan fullføres på mindre enn 17 minutter og dens gjennomførbarhet i feltforhold hvis flytende nitrogen er tilgjengelig. Den innenlandske katten er en levedyktig modell for ville truede kattedyr.
Utvikling og optimalisering av kryopreservation protokoller ville tillate etablering gamete biobanker for feline bevaring programmer. Begynn med å forberede en Repro vitrification plate med tre koniske brønner på en rad. Tilsett 20 mikroliter med likevektsløsning til den første brønnen og 300 mikroliter vitrifiseringsløsning til andre og tredje brønner.
For å likevekte cumulus oocyte komplekser, eller COCer, bruk en liten-bore pipette for å overføre en eller flere komplekser til bunnen av den første brønnen. Tilsett sakte 20 mikroliter med likevektsløsning til dråpekanten og vent i tre minutter, og legg deretter til ytterligere 240 mikroliter med likevektsløsning og vent i ni minutter. Mens du venter, lag en boks med flytende nitrogen og merk en vitrifiseringsstøtte med eksperimentet eller kattens identifikasjonskode.
Sett boksen og støtte i nærheten av stereomikroskopet. Etter likevekt av COCene, utfør vitrifisering på mindre enn 90 sekunder. For å vitrify cocene, fyll pipetten med den små borepipetten med vitrifiseringsløsningen fra den andre brønnen.
Ta COCene fra bunnen av den første brønnen og flytt dem til overflaten av den andre brønnen. Vask pipetten med vitrifiseringsløsningen, flytt deretter COCene til et annet område av brønnen og bland den omkringliggende løsningen. Fyll pipetten med løsning fra et annet område av brønnen.
Flytt COCene og bland mediet som omgir dem med pipetten. Gjenta denne prosessen en gang til. Vask deretter pipetten med vitrifiseringsløsningen fra den tredje brønnen og bruk den til å flytte COCene til bunnen av den tredje brønnen.
Igjen, bland den omkringliggende løsningen. Etter å ha fylt pipetten med løsning fra et annet område av brønnen, flytt COCene og bland løsningen. Gjenta denne prosessen.
Fyll pipettespissen med vitrifiseringsløsningen fra et annet område av brønnen og bruk den til å laste cocene på stripen på vitrifiseringsstøtten nær spissen, og aspirer deretter overflødig medium. Kast umiddelbart vitrifiseringsstøtten i flytende nitrogen og bruk klemmer til å lukke den, og pass på at den forblir nedsenket. Oppbevar de lastede vitrifiseringsstøttene i en beger og oppbevar dem i en flytende nitrogentank til oppvarming.
Plasser varmetrinnet nær stereomikroskopet og slå det på til 38 grader Celsius. Varm lokket på en petriskål på toppen av scenen, og overfør deretter vitrifiseringsstøttene fra oppbevaringstanken til en boks med flytende nitrogen. Forbered en rad med en Repro plate for hver vitrifisering støtte som skal varmes opp.
Tilsett 300 mikroliter fortynningsløsning til den første brønnen og 300 mikroliter vaskeløsning til andre og tredje brønner. Ta tineoppløsningen ut av inkubatoren og slipp 100 mikroliter på lokket på petriskålen. Bruk klemmene til å åpne vitrifiseringsstøtten inne i det flytende nitrogenet.
Plasser petriskållokket under stereomikroskopet, og plukk deretter raskt opp vitrifiseringsstøtten og senk stripen i dråpen, og flytt den til alle COC-er løsner. Fjern støtten fra dråpen så snart den er tom, men la COCene stå i tineløsningen i ett minutt. Fyll en pipette med fortynningsløsning og bruk den til å flytte COCene fra tineløsningsfallet til bunnen av den første brønnen med fortynningsløsning.
La cocene være der i tre minutter. Vask pipetten med vaskeoppløsningen fra den andre brønnen, ta deretter COCene og flytt dem til bunnen av den andre brønnen. Vent i fem minutter.
Vask pipetten med en løsning fra den tredje brønnen og bruk den til å flytte COCene fra den andre brønnen til overflaten av den tredje brønnen. Vent til COCene berører bunnen av den tredje brønnen. Gjenta deretter prosessen med et annet brønnområde.
Når du er ferdig, vask pipetten med kulturmedium og flytt oocytes til en kulturrett. De aller fleste gametes overlever etter oocyte vitrifisering og oppvarming i henhold til denne protokollen. Et representativt bilde av en levedyktig vitrifisert oppvarmet katt cumulus oocyte kompleks farget med fluorescein diacetate og propidiumjodid er vist her.
Denne tabellen viser prosentandelen overlevelse etter vitrifisering, som viser data etter oppvarming av oocytter beregnet for in vitro modning. Av 435 oocytter overlevde 395, og scoret totalt 90,8 % etter oppvarmingen. Imidlertid kan noen morfologiske endringer bli lagt merke til etter oppvarming.
De hyppigste morfologiske abnormitetene er endringer i ooplasmform og granulering, delvis eller noen ganger totalt tap av kumultalceller, og zona pellucidafrakturer. Når du prøver denne prosedyren, husk å forberede media på forhånd slik at de er riktig temperatur før bruk og å følge protokolltemperaturer og tidspunkter for å unngå celletoksisitet. Protokollen kan også brukes på oocytes av andre arter.
Hvis det lykkes, kan dette også bidra til germ plasm bank for bevaring av biologisk mangfold i truede kattedyr.
