Name: minimum volume vitrification of immature feline oocytes
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado en parte por la beca EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) 2016 y por la Universidad degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). También queremos agradecer a la Dra. MariaGiorgia Morselli por su contribución a los experimentos que se describen y a la adquisición de imágenes.

Los procedimientos por la presente descritos no se sometieron a aprobación ética ya que los ovarios de gato fueron recogidos en clínicas veterinarias como subproductos de la ovariectomía de rutina solicitada por el propietario o la ovariohisterectomía.
1. Colección de ovocitos
<ol><li>Antes de iniciar los experimentos, prepare soluciones para la recolección de ovarios y ovocitos. Preparar la solución de recolección de ovarios con solución salina tamponada de fosfato (PBS) con una m...

<ol>
	<li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+social+implications+of+embryo+cryopreservation.">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li><li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification.">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li><li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat.">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li><li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids.">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li><li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+and+mammalian+gametes.">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li><li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence.">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li><li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose.">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li><li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen.">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes.">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li><li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes.">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).</li><li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes.">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li><li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos:+The+Cryotop+method.">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).</li><li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification,+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer.">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li><li>Galiguis, J., G&#243;mez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes.">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li><li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique.">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions.">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329 (2019).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture:+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes.">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li><li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature,+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro.">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li><li>Cobo, A., Kuwayama, M., P&#233;rez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remoh&#237;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method.">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li><li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cryobiology.">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li><li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation+by+vitrification.">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li><li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification.">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li><li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation.">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li><li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos:+current+problems+and+future+perspectives.">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li><li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes.">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li><li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+(Felis+catus)+in+reproductive+season.">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li><li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viability+of+Serval+(Leptailurus+serval)+and+Pallas+Cat+(Felis+manul)+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method.">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li></ol>

La criopreservación de ovocitos es una técnica crucial de conservación del germoplasma, especialmente en taxones donde muchas especies están en peligro de extinción, como la familia Felidae. En este manuscrito, se presentó un protocolo sencillo y amigable con el campo para la vitrificación de ovocitos de gato inmaduros. Los medios de laboratorio, los soportes mínimos de vitrificación de volumen y el personal capacitado son los factores clave para el éxito de este método, que permite obtener ovocitos viables de...

La criopreservación se ha convertido en un paso clave de las técnicas de reproducción asistida (AT). En los seres humanos, permite la preservación de la fertilidad o el aplazamiento de la paternidad por razones médicas o personales. En animales, es necesario superar la distancia y el tiempo en apareamientos planificados, especialmente en animales de granja y mascotas, o preservar material genético de sujetos valiosos en programas de conservación, particularmente en especies silvestres en peligro de extinción. La criopreservación de gametos es la mejor opción cuando los individuos a criar aún no han sido elegidos o para evitar problemas éticos asociados con la congelación de embriones, especialmente en la medicina humana1. Los espermatozoides son relativamente fáciles de preservar y dan resultados satisfactorios después de la descongelación, pero los ovocitos, debido a sus características estructurales, podrían ser más complejos de almacenar. De hecho, la baja relación superficie/volumen, así como la presencia de la zona pellucida que rodea el ooplasma, limita el movimiento de crioprotectores y agua a través de la célula2. Además, en los animales domésticos, incluidos los feminidos, se caracterizan por un citoplasma rico en lípidos, que se cree que los hace más sensibles a la criopreservación3.
La mayoría de los fetas están amenazados, y el gato doméstico se utiliza como modelo para desarrollar protocolos para la preservación del germoplasma gracias a la disponibilidad de gónadas de la ovariectomía de rutina. En animales salvajes, las gónadas se pueden obtener después de cirugías electivas o (más frecuentemente) se pueden recuperar gametos post morteme inmaduros (vesícula germinal). La estimulación hormonal destinada a obtener ovocitos maduros (metafase II) no es tan común como en los ÁRT humanos debido a las cuestiones éticas y a la respuesta específica de las especies e individuos a los tratamientos4.
Por lo tanto, el desarrollo de estrategias de criopreservación se ha centrado en los gametos inmaduros, que generalmente se pueden recuperar después de la muerte inesperada o repentina de individuos raros. Desde un punto de vista biológico, hay algunas diferencias en la criopreservación de gametos inmaduros o maduros, cada uno con sus ventajas. En primer lugar, el ADN está más protegido en ovocitos inmaduros, cuya vesícula germinal contiene cromosomas rodeados por una membrana nuclear, mientras que el husillo meótico de los ovocitos metafase II podría ser más vulnerable a los criocinitos5. En segundo lugar, los daños por citoesqueleto inducidos por el frío pueden afectar la rotación del husillo, la extrusión del cuerpo polar, la migración pronuclear y la citoquinesis, que podrían tener diferentes impactos según la fase de desarrollo de los ovocitos, influyendo en la progresión de la meiosis o en eventos posteriores a la fertilización. Por último, y tal vez lo más importante, mientras que los ovocitos maduros están listos para ser fertilizados, los gametos inmaduros confían en el apoyo de las células cúmulos circundantes para pasar por la maduración nuclear y citoplasma6,y esta es la razón por la que los complejos cúmulos-oocitos (COC) enteros son criopreservados. Sin embargo, la pérdida de células cúmulos y/o la pérdida de conexión funcional entre el gameto y las células somáticas circundantes son probablemente el efecto más perjudicial de la criopreservación de COCs inmaduros.
Entre las técnicas de criopreservación, la vitrificación es una que se puede aplicar más fácilmente en condiciones de campo. En comparación con la congelación lenta (o de velocidad controlada), la vitrificación es más rápida y no requiere equipos específicos, como un congelador programable. Con el fin de satisfacer los tres principios fundamentales de la vitrificación (es decir, alta viscosidad, conectado a alta concentración crioprotectora, pequeños volúmenes y disminución ultrarráptica de la temperatura), varios medios y soportes especialmente se han desarrollado y utilizado en gatos tanto para ovocitos inmaduros como maduros. A partir de pajitas simples7, los dispositivos se desarrollaron para alcanzar el objetivo de "Volumen mínimo". Cryoloop8, pajitas abiertas (OPS)9, canalones de plástico (paja modificada)10 y criotubos11 se han utilizado, hasta que se emplee un dispositivo más eficiente (es decir, Cryotop)11, mejorando la supervivencia y la reanudación de la meiosis. Cryotop(Figura Suplementaria 1) es un soporte disponible comercialmente que se ha convertido en el sistema abierto electivo para la vitrificación. Desarrollado para la vitrificación de ovocitos y embriones humanos, consiste en una pequeña tira de película unida a un soporte de plástico duro, protegido por una tapa de tubo de plástico durante el almacenamiento12. Gracias a su facilidad de uso y a la extrema reducción del volumen de vitrificación (tan solo 0,1 l), lo que también conduce a tasas de enfriamiento y calentamiento extremadamente rápidas, este soporte de vitrificación se ha aplicado cada vez más en varias especies, incluido el gato doméstico, en el que se ha utilizado con una variedad de medios13,,14,,15,,16,,17.
El propósito de este manuscrito es describir un protocolo de calentamiento de la vitrificación de colección, con pequeñas modificaciones del desarrollado originalmente para ovocitos humanos, que emplea medios de laboratorio y soportes comerciales para la vitrificación de volumen mínimo y se puede aplicar fácilmente en condiciones de campo para la criopreservación de COC felinos inmaduros.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipettes &#38; tips</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpels</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Size 10 is usually ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beak</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.CR</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9129</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Advised lenght 230 mm (100+130)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gobelets</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>According to the canisters of the storage tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating stage</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All heating stages are ok, as long as they can keep 38&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repro plate</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.K-2</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage tank</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Any regularly filled tank is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam/nitrogen resistant box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called &#34;Cooling Rack&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timers</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All timers which can be set on times until 9 minutes are ok</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimum volume vitrification of immature feline oocytes

En los programas de conservación de animales salvajes, la banca de gametos es crucial para salvaguardar los recursos genéticos de individuos valiosos y especies raras y para promover la preservación de la biodiversidad. En los delitos, la mayoría de las especies están amenazadas de extinción, y las razas domésticas se utilizan como modelo para aumentar la eficiencia de los protocolos para la banca por germoplasma. Entre las técnicas de criopreservación de ovocitos, la vitrificación es cada vez más popular en la reproducción asistida humana y veterinaria. La vitrificación de la criotop, que al principio se desarrolló para ovocitos y embriones humanos, ha demostrado ser adecuada para los ovocitos de gato. Este método ofrece varias ventajas, como la viabilidad en las condiciones de campo y la velocidad del procedimiento, que puede ser útil cuando es necesario procesar varias muestras. Sin embargo, la eficiencia depende en gran medida de las habilidades del operador, y se necesita estandarización entre laboratorios e intra-laboratorios, así como capacitación del personal. Este protocolo describe la vitrificación de volumen mínimo de ovocitos felinos inmaduros en un soporte comercial en un protocolo paso a paso favorable al campo, desde la colección de ovocitos hasta el calentamiento. Siguiendo el protocolo, preservación de la integridad de los ovocitos y viabilidad en el calentamiento (hasta 90%) puede esperarse, aunque todavía hay margen de mejora en la maduración posterior al calentamiento y los resultados del desarrollo embrionario.

Tras la vitrificación y calentamiento de ovocitos de gato de acuerdo con el protocolo actual(Figura 1 y Figura Suplementaria 1),la gran mayoría de los gametos sobreviven. Después de la vitrificación, entre otras técnicas, la viabilidad se puede evaluar en el microscopio óptico como integridad morfológica22 o con el uso de manchas vitales. Uno de estos últimos es el diacetato de fluoresceína/yoduro propidium (FDA/PI), que permite la identifica...

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Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Este manuscrito describe un protocolo para la vitrificación de volumen mínimo de ovocitos de gato inmaduros con medios de laboratorio en soportes comerciales. Cubre cada paso desde el aislamiento de ovocitos desde las gónadas ex vivo hasta la vitrificación y el calentamiento.

Vitrificación de Volumen Mínimo de Ovocitos Felinos Inmaduros

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Este protocolo es útil para la conservación a largo plazo de los ovocitos felinos a través de una técnica de criopreservación conocida con vitrificación, que es crucial para la fertilidad y la preservación de la biodiversidad en especies animales. Las principales ventajas de la vitrificación son su velocidad ya que se puede completar en menos de 17 minutos y su viabilidad en condiciones de campo si hay nitrógeno líquido disponible. El gato doméstico es un modelo viable para felinos en peligro de extinción salvaje.El desarrollo y optimización de protocolos de criopreservación permitiría establecer biobancos de gametos para programas de conservación de felinos. Comience preparando una placa de vitrificación Repro con tres pozos cónicos en una fila. Añadir 20 microlitros de solución de equilibrio al primer pozo y 300 microlitros de solución de vitrificación al segundo y tercer pocóculo.Para equilibrar los complejos de ovocitos cúmulos, o COC, utilice una pipeta de diámetro pequeño para transferir uno o más complejos al fondo del primer pozo. Añadir lentamente 20 microlitros de solución de equilibrio al borde de la caída y esperar tres minutos, luego añadir otros 240 microlitros de solución de equilibrio y esperar nueve minutos. Mientras espera, prepare una caja con nitrógeno líquido y etiquete un soporte de vitrificación con el experimento o el código de identificación del gato.Coloque la caja y el soporte cerca del microscopio estéreo. Después de equilibrar los COC, realice la vitrificación en menos de 90 segundos. Para vitrificar los COC, llene la pipeta de diámetro pequeño con la solución de vitrificación del segundo pozo.Tome los COC de la parte inferior del primer pozo y muévalos a la superficie del segundo pozo. Lave la pipeta con la solución de vitrificación, luego mueva los COC a otra zona del pozo y mezcle la solución circundante. Llene la pipeta con solución de otra zona del pozo.Mueva los COC y mezcle el medio que los rodea con la pipeta. Repita este proceso una vez más. A continuación, lave la pipeta con la solución de vitrificación del tercer pozo y utilicándola para mover los COC a la parte inferior del tercer pozo.Una vez más, mezcle la solución circundante. Después de llenar la pipeta con solución de otra zona del pozo, mueva los COC y mezcle la solución. Repita este proceso.Llene la punta de la pipeta con la solución de vitrificación de otra zona del pozo y utilízla para cargar los COC en la tira del soporte de vitrificación cerca de la punta, luego aspire el medio sobrante. Sumerja inmediatamente el soporte de vitrificación en nitrógeno líquido y utilice abrazaderas para cerrarlo, asegurándose de que permanezca sumergido. Almacene los soportes de vitrificación cargados en una copa y guárdelos en un tanque de nitrógeno líquido de almacenamiento hasta el calentamiento.Coloque la etapa de calentamiento cerca del microscopio estéreo y enciéndala a 38 grados centígrados. Caliente la tapa de un plato de Petri en la parte superior del escenario, luego transfiera los soportes de vitrificación desde el tanque de almacenamiento a una caja con nitrógeno líquido. Prepare una fila de una placa de reproducción para cada soporte de vitrificación que se va a calentar.Añadir 300 microlitros de solución de dilución al primer pozo y 300 microlitros de solución de lavado al segundo y tercer pocóculo. Saque la solución de descongelación de la incubadora y deje caer 100 microlitros en la tapa de la placa Petri. Utilice las abrazaderas para abrir el soporte de vitrificación dentro del nitrógeno líquido.Coloque la tapa de la placa Petri debajo del microscopio estéreo, luego recoja rápidamente el soporte de vitrificación y sumerja su tira en la gota, moviéndola hasta que todos los COC se desprendan. Retire el soporte de la caída tan pronto como esté vacío, pero deje los COC en la solución de descongelación durante un minuto. Llene una pipeta con solución de dilución y utilice para mover los COC de la solución de descongelación hasta la parte inferior del primer pozo con solución de dilución.Deje los COC allí durante tres minutos. Lave la pipeta con la solución de lavado del segundo pozo, luego tome los COC y muévalos al fondo del segundo pozo. Espera cinco minutos.Lavar la pipeta con una solución del tercer pozo y utilizarla para mover los COC desde el segundo pozo a la superficie del tercer pozo. Espere a que los COC toquen la parte inferior del tercer pozo. A continuación, repita el proceso con otra área de pozo.Cuando haya terminado, lave la pipeta con un medio de cultivo y mueva los ovocitos a un plato de cultivo. La gran mayoría de los gametos sobreviven después de la vitrificación y el calentamiento de los ovocitos de acuerdo con este protocolo. Aquí se muestra una imagen representativa de un complejo de ovocitos cúmulos de gato calentado vitrificado viable teñido con diacetato de fluoresceína y yoduro de propidium.Esta tabla muestra el porcentaje de supervivencia después de la vitrificación, que representa los datos posteriores al calentamiento de los ovocitos destinados a la maduración in vitro. De los 435 ovocitos, 395 sobrevivieron, con una viabilidad general del 90,8% después del calentamiento. Sin embargo, algunos cambios morfológicos se pueden notar después del calentamiento.Las anomalías morfológicas más frecuentes son cambios en la forma y granulación del ooplasmo, pérdida parcial o a veces total de células cúmulos, y fracturas de zona pellucida. Al intentar este procedimiento, recuerde preparar los medios con antelación para que tengan la temperatura correcta antes de su uso y seguir las temperaturas y los tiempos del protocolo para evitar la toxicidad celular. El protocolo también podría aplicarse a los ovocitos de otras especies.Si tiene éxito, esto también podría contribuir a la banca de germoplasma para la preservación de la biodiversidad en felinos en peligro de extinción.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expresión de proteínas fluorescentes en<em&gt; Lanceolatum Branchiostoma</em&gt; Por mRNA La inyección en ovocitos no fecundados

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Aislamiento y caracterización de ratón antral Los ovocitos Sobre la base de organización de la cromatina nucleolar

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Análisis de la segregación cromosómica, acetilación de histonas y morfología de huso en ovocitos de caballo

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Una identificación basada en redes neuronal desarrollo competentes o incompetentes adulto de ovocitos de ratón

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Transferencia de embriones mínimamente invasiva y vitrificación de embriones en la etapa óptima del embrión en el modelo Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

Biopsia y vitrificación de blastocisto humano

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Estrategia de cultivo In Vitro para ovocitos del folículo antral temprano en el ganado bovino

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Separación de células foliculares y ocitos en folículos ováricos de pez cebra

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...