Name: minimum volume vitrification of immature feline oocytes
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes at JoVE.com

Bu çalışma kısmen EVSSAR (Avrupa Küçük Hayvan Üreme Derneği) Grant 2016 ve Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Dr. MariaGiorgia Morselli'ye burada betimlenen deneylere ve görüntü edinimine olan katkıları için teşekkür ederiz.

Bu vesileyle yapılan işlemler, kedi yumurtalıkları veteriner kliniklerinde sahibinin istediği rutin ovariektomi veya ovariohysterektomiden elde edilen ürünler olarak toplandığı için etik onaya tabi tutulmadı.
1. Yumurta toplama
<ol><li>Deneylere başlamadan önce, yumurtalık ve yumurta toplama için çözümler hazırlayın. Antibiyotik ve antimikotikkarışımı (100 IU/mL penisilin G sodyum, 0.1 mg/mL streptomisin sülfat, 0.25 μg/mL amphotericin B) karışımı ile fosfat ta...

<ol>
	<li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+social+implications+of+embryo+cryopreservation.">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li><li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification.">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li><li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat.">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li><li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids.">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li><li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia+and+mammalian+gametes.">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li><li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence.">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li><li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose.">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li><li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen.">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li><li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes.">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li><li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes.">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, 269-274 (2009).</li><li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes.">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li><li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos:+The+Cryotop+method.">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73 (2007).</li><li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification,+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer.">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li><li>Galiguis, J., G&#243;mez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes.">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li><li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique.">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions.">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329 (2019).</li><li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture:+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes.">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li><li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature,+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro.">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li><li>Cobo, A., Kuwayama, M., P&#233;rez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remoh&#237;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method.">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li><li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+cryobiology.">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li><li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation+by+vitrification.">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li><li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification.">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li><li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation.">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li><li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos:+current+problems+and+future+perspectives.">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li><li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes.">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li><li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+(Felis+catus)+in+reproductive+season.">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li><li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viability+of+Serval+(Leptailurus+serval)+and+Pallas+Cat+(Felis+manul)+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method.">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li></ol>

Oosit kriyoprezervasyon felidae ailesi gibi birçok türün nesli tükenmekte olan taksonlarda özellikle önemli bir germplazm koruma tekniğidir. Bu yazıda, olgunlaşmamış kedi yumurtalarının vitrifikasyonu için basit ve alan dostu bir protokol sunulmuştur. Laboratuvar yapımı ortam, minimum hacim vitrifikasyon destekleri ve eğitimli personel, bu yöntemin başarısı için önemli faktörlerdir, bu da temsili sonuçlarda gösterildiği gibi sürekli ve sürekli olarak canlı yumurtaların elde edilmesine olan...

Kriyopreservation destekli üreme teknikleri (ARTs) önemli bir adım haline gelmiştir. İnsanlarda, bu tıbbi veya kişisel nedenlerle doğurganlık korunması veya ebeveynlik ertelenmesi sağlar. Hayvanlarda, özellikle çiftlik hayvanları ve evcil hayvanlarda, planlanan çiftliklerde mesafe ve zamanın üstesinden gelmek ya da özellikle nesli tükenmekte olan vahşi türler olmak üzere koruma programlarındaki değerli deneklerin genetik materyallerini korumak gereklidir. Gamet kriyoppreservation bireylerin henüz seçilmiş değil ya da amacıyla embriyo dondurma ile ilgili etik sorunları önlemek için, özellikle insan tıbbı1en iyi seçimdir. Spermatozoakorumak ve erime sonra tatmin edici sonuçlar vermek nispeten kolaydır, ancak yumurta, yapısal özellikleri nedeniyle, saklamak için daha karmaşık olabilir. Nitekim, düşük yüzey / hacim oranı, hem de ooplazma çevreleyen zona pellucida varlığı,hücre2 boyunca kriyoprotektif ve su hareketini sınırlar . Ayrıca, felidler de dahil olmak üzere evcil hayvanlarda, onlar kriyopreservation3onları daha duyarlı hale getirmek için düşünülen bir lipid açısından zengin sitoplazma ile karakterizedir.
En felids tehdit altındadır, ve evcil kedi rutin ovariektomi gelen gonadların durumu sayesinde germplasm korunması için protokoller geliştirmek için bir model olarak kullanılır. Vahşi hayvanlarda, gonadlar elektif ameliyatlardan sonra veya (daha sık) post-mortemsonra elde edilebilir, ve olgunlaşmamış (germinal vezikül) gametler alınabilir. Hormonal stimülasyon olgun elde etmek için amaçlayan (metafaz II) oositler etik sorunlar ve tür nedeniyle insan ARTs olarak yaygındeğildir-ve tedavilere bireysel-özel yanıt 4 .
Bu nedenle, kriyoprezervasyon stratejilerinin geliştirilmesi genellikle nadir bireylerin beklenmedik veya ani ölümünden sonra alınabilir olgunlaşmamış gametler, odaklanmıştır. Biyolojik bir bakış açısıyla, her birinin avantajları olan olgunlaşmamış veya olgun gametlerin kriyopreservation bazı farklılıklar vardır. İlk olarak, DNA daha olgunlaşmamış oositler korunur, olan germinal vezikül bir nükleer membran ile çevrili kromozomlar içerir, metafaz II oositlerin meiotik mil kriyoyaralanmalara karşı daha savunmasız olabilirise 5. İkinci olarak, soğuk kaynaklı sitoiskelet hasarları iğ rotasyonunu, kutup cisim ekstrüzyonu, pronükleer göç ve sitokinezi etkileyebilir, bu da oosit gelişim evresine göre farklı etkilere yol açabilir, mayoz progresyonu veya döllenme sonrası olayları etkileyebilir. Son olarak, ve belki de en önemlisi, olgun yumurtadöllenmeye hazır iken, olgunlaşmamış gametler nükleer ve sitoplazmikolgunlaşma6 geçmesi için çevreleyen kümülüs hücrelerinin desteğine güveniyor , ve bu nedenle tüm kümülüs-oosit kompleksleri (COCs) cryopreserved vardır. Ancak, kümülüs hücrelerinin kaybı ve/veya gamet ve çevresindeki somatik hücreler arasındaki fonksiyonel bağlantının kaybı muhtemelen olgunlaşmamış COC'lerin kriyopreservation en zararlı etkisidir.
Kriyopreservation teknikleri arasında vitrifikasyon alan koşullarında daha kolay uygulanabilen bir tekniktir. Yavaş (veya kontrollü hız) dondurma ile karşılaştırıldığında, vitrifikasyon daha hızlıdır ve programlanabilir bir dondurucu gibi belirli ekipmanlar gerektirmez. Vitrifikasyonun üç temel prensibini (yani yüksek viskozite, yüksek kriyoprotektif konsantrasyon, küçük hacimler ve ultra hızlı sıcaklık düşüşüne bağlı) karşılamak için, özellikle olgunlaşmamış ve olgun yumurtalar için kedilerde çeşitli ortam ve destekler geliştirilmiş ve kullanılmıştır. Basit pipetler7ile başlayarak, cihazlar daha sonra "Minimum hacim" hedefine ulaşmak için geliştirilmiştir. Cryoloop8, açık çekti pipetler (OPS)9, plastik oluklar (modifiye saman)10 ve kriyotüpler11 kullanılmıştır, kadar daha verimli bir cihaz (yani, Cryotop) istihdam edildi11, hayatta kalma ve kızamık devamı iyileştirilmesi. Cryotop (Ek Şekil 1) vitrifikasyon için seçmeli açık sistem haline gelmiştir ticari olarak kullanılabilir bir destektir. İnsan yumurtaları ve embriyoların vitrifikasyon için geliştirilen, bu depolama sırasında plastik bir tüp kapağı ile korunan sert bir plastik tutucu bağlı küçük bir film şerit oluşur12. Kullanılabilirliği ve vitrifikasyon hacmindeki aşırı azalma (0,1 μL gibi az), aynı zamanda son derece hızlı soğutma ve ısınma oranlarıyol açar, bu vitrifikasyon desteği giderek çeşitli medya13,,14,15,16,17ile kullanılmıştır yerli kedi de dahil olmak üzere çeşitli türler, uygulanmıştır .
Bu makalenin amacı, insan yumurtaları için başlangıçta geliştirilen, minimum hacimli vitrifikasyon için laboratuvar yapımı medya ve ticari destekler kullanan ve olgunlaşmamış kedi COC'larının kriyopreservation için saha koşullarında kolayca uygulanabilen küçük değişikliklerle bir koleksiyon-vitrifikasyon-ısınma protokolünü tanımlamaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipettes &#38; tips</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Needed to pipette 20, 100, 240 and 300 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scalpels</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Size 10 is usually ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen beak</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamps</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Some small (Mosquito clamp) for ovary isolation, some bigger (Klemmer clamp) to work in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotop</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.CR</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol (EG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9129</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Advised lenght 230 mm (100+130)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gobelets</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>According to the canisters of the storage tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating stage</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All heating stages are ok, as long as they can keep 38&#186;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repro plate</td>
			<td>Kitazato (distributor: MBT - Medical Biological Technologies)</td>
			<td>01.K-2</td>
			<td>Distributors and catalog number may change in different countries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>As long as the operator can select the oocytes, other stereomicroscopes are ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage tank</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>Any regularly filled tank is ok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9137</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam/nitrogen resistant box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All boxes which can contain liquid nitrogen are ok, as long as the operator is comfortable. Kitazato box is called &#34;Cooling Rack&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td>/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timers</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>All timers which can be set on times until 9 minutes are ok</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimum volume vitrification of immature feline oocytes

Vahşi hayvanların koruma programlarında, gamet bankacılığı değerli bireylerin ve nadir türlerin genetik kaynaklarını korumak ve biyolojik çeşitliliğin korunmasını teşvik etmek için çok önemlidir. Felids, çoğu tür yok olma tehlikesiyle karşı karşıya, ve yerli ırklar germplasm bankacılık için protokollerin verimliliğini artırmak için bir model olarak kullanılır. Oosit kriyoprezervasyon teknikleri arasında, vitrifikasyon insan ve veteriner destekli üreme daha popüler. İlk olarak insan yumurtaları ve embriyolar için geliştirilen cryotop vitrifikasyon, kedi yumurtaları için çok uygun olduğunu göstermiştir. Bu yöntem, alan koşullarındafizibilite ve yordamın hızı gibi çeşitli avantajlar sunar ve bu da birkaç numunenin işlenmesi gerektiğinde yararlı olabilir. Ancak, verimlilik güçlü operatörün becerilerine bağlıdır ve intra-ve laboratuvarlar arası standardizasyon yanı sıra personel eğitimi gereklidir. Bu protokol, yumurta koleksiyonundan ısınmaya kadar, adım adım alan dostu protokolile ticari destek te olgunlaşmamış kedi yumurtalarının minimum hacimli vitrifikasyonu dur. Protokolün ardından, yumurta bütünlüğünün ve ısınmada canlılığın korunması (%90'a kadar) ısınma sonrası olgunlaşma ve embriyonik gelişim sonuçlarında iyileşme için hala yer olmasına rağmen, beklenebilir.

Mevcut protokole göre kedi yumurtası vitrifikasyonve ısınmasını takiben(Şekil 1 ve Ek Şekil 1),gametlerin büyük çoğunluğu hayatta kalır. Vitrifikasyon sonrası, diğer tekniklerin yanı sıra, canlılık optik mikroskopta morfolojik bütünlük22 veya hayati lekelerin kullanımı ile değerlendirilebilir. İkincisi floresan diasetat / propidium iyodür (FDA / PI), hangi canlı (parlak yeşil floresan) ve ölü hücrelerin (kırmızı flo...

Watch this Scientific Journal Video about Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes at JoVE.com

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

Bu el yazması, olgunlaşmamış kedi yumurtalarının ticari destekler de laboratuvar yapımı ortamla minimum hacimli vitrifikasyonuna ilişkin bir protokolü açıklamaktadır. Oosit izolasyonundan ex vivo gonadlardan vitrifikasyon ve ısınmaya kadar her adımı kapsar.

Olgunlaşmamış Kedi Yumurtalarının Minimum HacimVitrifikasyonu

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Bu protokol, hayvan türlerinde doğurganlık ve biyolojik çeşitliliğin korunması için çok önemli olan vitrifikasyon ile bilinen kriyopreservation tekniği ile kedi yumurtalarının uzun süreli korunması için yararlıdır. Vitrifikasyonun en önemli avantajları, 17 dakikadan daha kısa sürede tamamlanabildiği için hızı ve sıvı nitrojen varsa alan koşullarındaki fizibilitesidir. Evcil kedi vahşi nesli tükenmekte olan kedi için uygun bir modeldir.Kriyoppreservation protokollerinin geliştirilmesi ve optimizasyonu kedi koruma programları için gamet biyobankaların kurulmasını sağlayacaktır. Bir satırda üç konik kuyular ile bir Repro vitrifikasyon plaka sıyrık hazırlayarak başlayın. Birinci kuyuya 20 mikrolitre denge çözeltisi, ikinci ve üçüncü kuyulara ise 300 mikrolitre vitrifikasyon çözeltisi ekleyin.Kümülüs yumurta komplekslerini veya COC'leri dengelemek için, bir veya daha fazla kompleksi ilk kuyunun altına aktarmak için küçük delikli bir pipet kullanın. Yavaşça damla sınırına 20 mikrolitre denge çözeltisi ekleyin ve üç dakika bekleyin, sonra başka bir 240 mikrolitre denge çözeltisi ekleyin ve dokuz dakika bekleyin. Beklerken sıvı nitrojen içeren bir kutu hazırlayın ve deney veya kedi tanımlama koduyla vitrifikasyon desteği etiketleyin.Kutuyu ve desteği stereo mikroskobun yakınına koyun. COC'leri dengeledikten sonra, 90 saniyeden daha kısa bir sürede vitrifikasyon yapın. COC'leri vitrifiye etmek için, küçük delikli pipeti ikinci kuyudan vitrifikasyon çözeltisi ile doldurun.CoC'leri ilk kuyunun altından alın ve ikinci kuyunun yüzeyine taşıyın. Pipeti vitrifikasyon solüsyonuyla yıkayın, ardından COC'leri kuyunun başka bir bölgesine taşıyın ve çevredeki çözeltiyi karıştırın. Pipeti kuyunun başka bir alanından gelen çözeltiyle doldurun.COC'leri hareket ettirin ve çevredeki ortamı pipetle karıştırın. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, pipeti üçüncü kuyudan vitrifikasyon çözeltisi ile yıkayın ve COC'ları üçüncü kuyunun dibine taşımak için kullanın.Yine, çevreleyen çözeltiyi karıştırın. Pipeti kuyunun başka bir alanından gelen solüsyonlarla doldurduktan sonra, COC'leri hareket ettirin ve çözeltiyi karıştırın. Bu işlemi tekrarlayın.Pipet ucunu kuyunun başka bir alanından gelen vitrifikasyon çözeltisi ile doldurun ve coc'ları ucuna yakın vitrifikasyon desteğinin şeridine yüklemek için kullanın, sonra fazla ortamı aspire edin. Hemen sıvı nitrojen vitrifikasyon desteği daldırma ve onu kapatmak için kelepçeler kullanın, o batık kalır emin olun. Yüklü vitrifikasyon desteklerini bir kadehte saklayın ve ısınına kadar bir depolama sıvı azot tankında saklayın.Isıtma aşamasını stereo mikroskoba yakın yerleştirin ve 38 santigrat dereceye açın. Sahnenin üstündeki Petri kabının kapağını ısıtın, ardından vitrifikasyon desteklerini depolama tankından sıvı nitrojen içeren bir kutuya aktarın. Isınmak için her vitrifikasyon desteği için bir sıra Repro plaka hazırlayın.İlk kuyuya 300 mikrolitre seyreltme çözeltisi, ikinci ve üçüncü kuyulara 300 mikrolitre yıkama çözeltisi ekleyin. Çözülme solüsyonu kuvözden alın ve Petri kabının kapağına 100 mikrolitre bırakın. Sıvı azot içinde vitrifikasyon desteği açmak için kelepçeler kullanın.Petri kabının kapağını stereo mikroskobun altına yerleştirin, ardından vitrifikasyon desteğini hızlıca alın ve şeridini damlaya batırın ve tüm COC'ler ayrılana kadar hareket ettirin. Boşalır boş alır almaz desteği damladan çıkarın, ancak COC'leri çözülme çözeltisinde bir dakika bekletin. Bir pipeti seyreltme çözeltisi ile doldurun ve kokları erime çözeltisinden seyreltme çözeltisi ile ilk kuyunun dibine taşımak için kullanın.COC'leri üç dakika orada bırakın. Pipeti ikinci kuyudan yıkama solüsyonuyla yıkayın, sonra COC'leri alın ve ikinci kuyunun dibine taşıyın. Beş dakika bekleyin.Pipeti üçüncü kuyudan bir çözeltiyle yıkayın ve COC'leri ikinci kuyudan üçüncü kuyunun yüzeyine taşımak için kullanın. COC'ların üçüncü kuyunun dibine dokunmasını bekleyin. Sonra başka bir kuyu alanı ile işlemi tekrarlayın.Bittiğinde, pipetkültür orta ile yıkayın ve bir kültür çanak için yumurta hareket ettirin. Gametlerin büyük çoğunluğu bu protokole göre yumurta vitrifikasyon ve ısınma dan sonra hayatta kalır. Floresan diasetat ve propidium iyodür ile boyanmış canlı vitrifiye ısıtılmış kedi kümülüs oosit kompleksinin temsili bir resmi burada gösterilmiştir.Bu tablo, in vitro olgunlaşma için tasarlanmış yumurtaların ısınma sonrası verilerini gösteren vitrifikasyon sonrası sağkalım yüzdesini göstermektedir. 435 oositten 395'i hayatta kalarak ,%90,8'lik bir ısınma sonrası canlılık elde etti. Ancak, Bazı morfolojik değişiklikler ısınma dan sonra fark edilebilir.En sık görülen morfolojik anormallikler ooplazm şekli ve granülasyon değişiklikleri, kümülüs hücrelerinin kısmi veya bazen toplam kaybı ve zona pellucida kırıklarıdır. Bu yordamı denerken, medyayı kullanmadan önce doğru sıcaklıkta olacak şekilde önceden hazırlamayı ve hücre toksisitesini önlemek için protokol sıcaklıklarını ve zamanlamalarını izlemeyi unutmayın. Protokol diğer türlerin yumurtalarına da uygulanabilir.Başarılı olursa, bu da nesli tükenmekte olan kedi biyolojik çeşitliliğin korunması için mikrop plazm bankacılık katkıda bulunabileceği.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Floresan protein ifadesindeki<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; Döllenmemiş Oositlerinin içine mRNA Enjeksiyon

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Modifiye MicroSecure Vitrifikasyon: İnsan Blastosistlerinin A, Güvenli Basit ve Etkili Kryoprezervasyon Prosedürü

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

At Oositlerinde Kromozom Ayrımı, Histon Asetilasyonu ve İşmili Morfolojisi Analizi

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Bir Neural ağ tabanlı kimlik gelişimsel olarak yetkili veya yetersiz fare köklerin yumurta

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

İnsan blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

Sığırlarda Erken Antral Folikülden Oositler Için Tüp Bebek Kültür Stratejisi

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebra Balıklarının Yumurtalık Foliküllerinde Foliküler Hücrelerin ve Oositlerin Ayrılması

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...