Name: automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

يعترف المؤلفون بامتنان بالمرضى وأسرهم الذين ساهموا في المواد الحيوية لهذه الدراسة. كانت خطوط الخلايا المستخدمة في الدراسة من مجموعة NINDS مع Rutgers (ND41865 كما iPS #1) ومختبر الدكتور تيلو كوناث (iPS #2). ويدعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة NOMIS (PH)، RiMod-FTD، وهو برنامج مشترك للاتحاد الأوروبي - أبحاث الأمراض العصبية (JPND) (PH)؛ مبادرة I2A الخاصة بـ DZNE (AD)؛ PD-Strat، وهو مشروع ممول من ERA-NET ERA ERASysMed (PH) ومبادرة البيانات التأسيسية لمرض باركنسون (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN - PD هو جزء من برنامج PATH TO PD لمؤسسة مايكل ج. فوكس. الكتاب الشكر ستيفن فينكبينر وميلاني كوب (معاهد غلادستون) للمساهمة في إنشاء دليل بروتوكول تمايز الخلايا العصبية mDA وماهومي سوزوكي (يوكوغاوا شركة كهربائية) للمساعدة في إعداد تحليل الخروج من نيوريت.

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases.">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li><li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease.">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li><li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions.">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647 (2015).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System.">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+derivation,+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li><li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells.">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling.">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PloS one. 8 (3), 59252 (2013).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li><li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology,+autophagy,+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons.">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death &amp; disease. 6, 1811 (2015).</li><li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2++Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation.">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li><li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Huntington's+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics,+Morphology,+and+Maturation.">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimerBank:+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification.">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, 792 (2010).</li></ol>

ليس لدينا ما نكشف عنه

نحن نقدم نظام ثقافة الخلايا الآلي مع قدرات التصوير المتكاملة لتوحيد ثقافة hiPSC والتمايز العصبي. بسبب الحد الأدنى من تدخل المستخدم، التباين التجريبي هو انخفاض ضمان إعادة إنتاج الأنماط الظاهرية الخلوية أثناء التمايز. ويدعم جدولة التقويم تنظيم وتوازي التجارب ويسمح بدرجة عالية من المرونة في الوقت الذي يتم فيه تنفيذ التجارب. ويمكن تكييف الأساليب القائمة بسهولة وزيادة طيف الأساليب المتاحة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام عدد كبير من تنسيقات لوحة المقايسة إضافة إلى مرونة هذا النظام. يشكل النظام الأدنى المكون من حاضنة CO2، وذراع روبوتية، ومقياس الخلايا الساطعة، ومحطة المناولة السائلة الوحدة الأساسية اللازمة لثقافة HIPSC والتمايز، مع تكاليف معقولة لمختبرات البحوث الأكاديمية. الجمع بين نظام ثقافة الخلايا الآلي مع نظام تخزين آلي -20 درجة مئوية لتخزين المركبات ، ومكتبات RNAi أو مكتبات CRISPR / Cas9 ، وتكامل مجهر عالي المحتوى / عالي الإنتاجية يمكّن من تنفيذ عمليات فحص الظواهر الظاهرية.
في الدراسة الحالية، استخدم نظام زراعة الخلايا الآلي نصائح يمكن التخلص منها وتم إعادة ملء وسائل الإعلام الثقافية يدويًا في الخزان، مما يحد من استخدام محطة المناولة السائلة في تغييرات وسائل الإعلام والعمليات الثقافية الأخرى خاصة بين عشية وضحاها. للتحايل على هذا القيد، يمكن تعديل الأساليب لاستخدام إبرة بدلا من نصائح المتاح، وبعد تركيب وصلات أنبوب بين خطوط وسائل الإعلام وأكياس وسائل الإعلام المخزنة في الثلاجة، يمكن إعادة ملء خزانات وسائل الإعلام تلقائيا مع وسائل الإعلام الطازجة قبل تدفئة عناصر سخان. ومن شأن ذلك أن يحد من تداخلات المستخدمين الناجمة عن إعادة التعبئة اليدوية للنصائح ووسائط الإعلام الثقافية وتبادل الخزانات.
لدينا نظام ثقافة الخلية الآلي يقدم العديد من المزايا. واحد هو نظام تتبع الباركود. يتم تحديد لوحات محملة في النظام من خلال الباركود الفريد الذي يقرأ وحفظها من قبل النظام مما يسمح تتبع العينات أثناء وبعد تنفيذ الأسلوب. ميزة أخرى هي إمكانية إنشاء مشاريع خاصة بالمستخدم. هنا، يمكن تعيين لوحات الثقافة المحملة في النظام إلى مشروع محدد وتجميعها على دفعات. الهيكلة على دفعات يبسط تنفيذ نفس الإجراء إلى جميع لوحات دفعة معينة حيث لا تحتاج لوحات الفردية التي تحتاج إلى اختيار. بالإضافة إلى ذلك، يسمح محرر فئة السائل لضبط سرعة الأنابيب والارتفاع وكذلك المعلمات الطموح والاستغناء عن كل خطوة نقل السائل. يتم توثيق كل عملية في ملفات السجل مما يسمح لتتبع المهام التي تم تنفيذها لثقافة معينة أو لوحة فحص.
الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC) مفيدة في الأدوات المختبرية لدراسة آليات الأمراض العصبية في مجموعات محددة من المرضى (على سبيل المثال الخلايا العصبية الدوبامينية لمرض باركنسون) تقدم إمكانية لفحوصات الأدوية الشخصية. الاستزراع hiPSC هو مكثفة جدا من الوقت وتتطلب الناس المدربين لتنفيذ بروتوكولات التمايز المعقدة، وعادة ما تقتصر على الإنتاج على نطاق منخفض. نحن تكييفها ثقافة التغذية خالية من hiPSC لثقافة مؤتمتة ونفذت بروتوكولين التمايز العصبية, بروتوكول تمايز الخلايا العصبية القشرية السريعة على أساس NGN2 الإفراط في التعبير تحت المروج tet-on10,11, وبروتوكول على المدى الطويل الصغيرة القائمة على جزيء لتوليد من الخلايا العصبية في منتصف الكبرين الدوبامين (mDA)13. إن النقل المباشر لاتفاقية الثقافة اليدوية وبروتوكولات التمايز و قابليتها للتكرار يجعلان نظام الثقافة الآلي مفيداً جداً. أظهر iPSC البشري المستزرع في نظام زراعة الخلايا الآلي مورفولوجيا الخلايا الجذعية المتسقة وعبّر عن علامات متعددة القدرات الهامة ، قابلة للتكرار بين التجارب المستقلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن أتمتة بروتوكول ثقافة hiPSC لصالح ثقافة وتوسيع عدد أكبر من خطوط الخلايا في موازاة. وفّرت عمليات فحص الالتقاء الآلي المقرر إجراؤها بين عشية وضحاها الوقت الذي يترك النظام حراً خلال النهار لخطوات عملية المصب التي تتم عندما يكون المستخدم في المختبر (مثل حصاد الخلايا أو إعادة الطلاء اليدوي للتمايزات). عند الوصول إلى عتبة التقاء المعرفة من قبل المستخدم، يتم تمرير الخلايا وإعادة طلاءها في لوحات مكسوة بمصفوفة خارج الخلية متوفرة على مكدس نظام ثقافة الخلية التلقائي. كل جولة مرور يأخذ حوالي 70 دقيقة ويولد أربعة لوحات 1-بئر من لوحة أحد الوالدين، والذي يترجم إلى قدرة 20 الممرات في يوم واحد.
تم تنفيذ أتمتة بروتوكول التمايز NGN2 بنجاح وسمح لتوليد مجموعة متجانسة من الخلايا العصبية عبر مقاطع مختلفة وقابلة للمقارنة مع التمايزات اليدوية. وعلاوة على ذلك، فإن التكاليف التجريبية لدراسات الفرز الواسعة النطاق التي تشمل خطوطاً متعددة من الخلايا أو تجارب فحص مع آلاف من ظروف/مركبات الاختبار ستنخفض بسبب التمايزات السريعة. يمكن بسهولة تطوير القياسات الفعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية بما في ذلك القياسات التي تُحدث في الخلايا الحية ، و15،16. وهكذا، قمنا أيضًا بتكييف بروتوكول NGN2 باستخدام خلايا السلائف العصبية المشتقة من الجزيئات الصغيرة (smNPC) التي تُبرِر بشكل مفرط GFP. وتوفر خلايا الشركات الصغيرة والمتوسطة الحجم مزايا إضافية بما في ذلك انخفاض التكاليف مع وسائط الإعلام الثقافية (ثلث التكلفة مع ثقافة iPSC) والوقت اللازم لتوسيع نطاق التجارب. الغلة الخلية من smNPC هي 7 إلى 10 مرات أعلى من تلك التي تم الحصول عليها مع iPSC. تم رصد الخلايا العصبية المتمايزة وصورها بنجاح لعدة أيام باستخدام عملية تصوير مؤتمتة بالكامل دون الحاجة إلى تلطيخات الأجسام المضادة اليدوية أو وضع العلامات الكيميائية ، مما يوفر التكاليف والوقت اللازم للإجراءات اليدوية بما في ذلك التصوير في حد ذاته. التصوير الحالي لـ 60 بئرًا داخليًا من لوحة 96 بئرًا يستغرق حوالي 16 دقيقة لكل لوحة عندما يتم تصوير 25 حقلًا في البئر ، مما يعني أنه يمكن الحصول على بيانات الفحص المستند إلى التصوير لـ 1000 مركب وتحليلها في يوم واحد. في المستقبل، يمكن استخدام هذه القراءة في دراسات الفحص المركب لإنقاذ عيوب النمو النوري.
وعلاوة على ذلك، ونحن أيضا إثبات نقل بروتوكول التمايز اليدوي لتوليد الخلايا العصبية في منتصف الفقرات الدوبامين (mDA) من iPSC. هذا بروتوكول التمايز الصغيرة القائمة على جزيء يأخذ 65 يوما، والعمل المكثف بسبب خطوات إعادة الطلاء متعددة والتغيرات وسائل الإعلام المتكررة، ومعظمها كل 2 أيام، مما يحد من إنتاج الخلايا العصبية mDA إلى خطوط iPSC قليلة في نفس الوقت. بروتوكول التمايز mDA الآلي لديه ميزة كبيرة من رفع مستوى التمايز إلى العشرات من خطوط iPSC. ويمكن تمييز ما يصل إلى 30 خط خلية في نفس الوقت. وبما أن التمايز يستند في معظمه إلى التغيرات التي تطرأ على وسائط الإعلام، فإن عملية التمايز كلها تقريباً يمكن أن تتم دون تدخل بشري. باستخدام جدولة المستندة إلى التقويم للنظام الآلي، يمكننا التخطيط للتغييرات وسائل الإعلام وفقا لخطوات التمايز. كان أحد القيود على العمل مع هذا العدد الكبير من خطوط الخلايا ولوحات الثقافة استحالة إجراء تغييرات الوسائط بين عشية وضحاها. والسبب الرئيسي هو أن نظامنا تم إعداده لاستخدام النصائح التي يمكن التخلص منها وإعادة الملء اليدوي لوسائل الإعلام الثقافية التي تتطلب من المستخدم في المختبر تنفيذ هذه الخطوة اليدوية. ولتيسير عملية تغيير الوسائط، تم تخصيص اللوحات المحملة في النظام لمشروع وتجميعها على دفعات. ثم تم تكييف حجم الدفعة مع عدد النصائح المتاح وحجم وسائل الإعلام الثقافة المتاحة. وكما نوقش أعلاه، يمكن التغلب على هذا القيد بسهولة عن طريق تنفيذ الإبر القابلة لإعادة الاستخدام/القابلة للغسل وإعادة الملء الآلي لوسائل الإعلام. التلقائي passaging / إعادة طلاء الخلايا ، كما هو مبين لـ iPSC ، هي واحدة من وسائل الراحة التي تقدمها لدينا نظام ثقافة الخلايا الآلي. لقد اختبرنا إعادة طلاء الآلي من الخلايا العصبية mDA في اليوم 25 من التمايز. ومع ذلك، فإن تفكك الخلايا العصبية mDA يتطلب فترة أطول (40 دقيقة) الحضانة مع إنزيم تفكك من iPSC (8 دقيقة) توسيع عملية إعادة الطلاء الآلي لأكثر من 1 ساعة في خطوط الخلية. ونتيجة لذلك، أصبح من المستحيل إعادة طلاء 30 خطاً خلوية آلياً في اليوم نفسه. ومن شأن تسريع الخطوات الأخرى أثناء إعادة الطلاء الآلي (نقل اللوحات، وتكييف الأنابيب) وتكييف النظام مع استخدام الإبر وخط الوسائط الذي يجعل العمل بين عشية وضحاها ممكنًا، أن يحل هذا القيد. على الرغم من العيوب، يمكننا نقل بنجاح البروتوكول اليدوي إلى تمايز الآلي من الخلايا العصبية mDA إنتاج الثقافات مع كميات كبيرة من MAP2 (الخلايا العصبية) وTH (الخلايا العصبية mDA) الخلايا الإيجابية.
إن التمييز بين العشرات من خطوط الخلايا iPSC بالتوازي أمر مهم جدًا في المشاريع التي تحقق في الآليات الجزيئية للأمراض العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون. ومع ذلك ، لإكمال المهام بشكل أسرع مع أخطاء أقل والتكاليف المخفضة هو تحد كبير. نظرا لأتمتة البروتوكولات المعروضة هنا (iPSC، smNPC والخلايا العصبية MDA)، ونحن يمكن أن تسريع، والحد من التكاليف وزيادة استنساخ في مشاريعنا. إن تطوير مشاريع مثل FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) التي تشمل مئات خطوط الخلايا المريضة يظهر الحاجة إلى ثقافة آلية وبروتوكولات التمايز. وتشمل وجهات نظرنا المستقبلية نقل دليل 3 الأبعاد (3D) نماذج ثقافة الخلية إلى النظام الآلي. وسوف تسمح التعديلات الطفيفة في إعدادات تعريف لوحة واستخدام محولات استخدام لوحات التجارية أو حسب الطلب والغرف microfluidic اللازمة للثقافات 3D. وعلاوة على ذلك، فإن تنفيذ نموذج التصوير الآلي خالية من التسمية تسمح لنا لتتبع نمو الخلايا العصبية في الوقت الحقيقي وترجمة التغييرات في نمو نيوريت، وتنظيم الخلايا العصبية والموت الخلية في فهم أفضل لآليات المرض.

الخلايا الجذعية المستحثة البشرية متعددة القدرات (hiPSC) هي تجديد ذاتي ويمكن أن تفرق في أي نوع خلية بالغ تقريبا. هذه الخصائص تجعل hiPSC أداة مفيدة لنمذجة الأمراض في البحوث الأساسية واكتشاف المخدرات1. يحتفظ iPSC الإنسان الخلفية الوراثية المانحة التي تسمح اشتقاق أنواع الخلايا ذات الصلة بالأمراض التي هي الأكثر تضررا / المشاركة في مسار المرض، على سبيل المثال، الأنواع الفرعية العصبية المختلفة للأمراض العصبية2،3. أيضا، hiPSC يتغلب على بعض القيود على نماذج الإفراط في التعبير الحيواني والخلوي من خلال نموس الأمراض في سياق الإنسان ومستويات التعبير عن البروتين الفسيولوجية، وقد ثبت أن رصيدا قيما في النمذجة الأمراض التي تتراوح بين اضطرابات أحادية الحساسية، معقدة و اللاجينية، فضلا عن الأمراض في وقت متأخر من الظهور4.
وعلى الرغم من هذه الفوائد والفرص، لا تزال هناك عدة قيود على الإعاقة التي لا تزال بحاجة إلى معالجة. إن الثقافة الحالية للبروتوكولات الخاصة بالهون اPsc والتمايز ليست فعالة من حيث التكلفة، ويصعب توحيدها، وهي كثيفة العمالة. خطوات الثقافة اليدوية يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع في التغير في الغلة والأنماط الظاهرية بسبب الاختلافات في النمو والتمايز التلقائي من hiPSC. ولذلك، تحتاج إلى تقليل التباين المعتمد على التجربة عن طريق تنفيذ تقنيات معالجة أكثر توحيدا وتبسيط البروتوكولات التي يمكن تحقيقها باستخدام الأتمتة5. وسيحدد إنشاء بروتوكولات للثقافة والتمايز الآليين للـهيبسك معايير مشتركة لكل من مشاريع البحوث الأكاديمية والصناعية، ويسمح بتوليد نماذج للأمراض ذات الصلة بيولوجياً ونتائج أكثر قابلية للتكرار.
وقد حاول العمل السابق أتمتة الثقافات hiPSC6،7،8 ولكن تم تقييد بروتوكولاتها إلى صيغ لوحة ثقافة الخلية محددة تعتمد على النظام وتفتقر إلى القدرة على التكيف مع مختلف أشكال المقايسة. هذه الأنظمة مفيدة في يستكثر من الخلايا ولكن قد لا تكون مناسبة للتمايز الآلي في أنواع الخلايا المطلوبة، وفرز المرض، وأغراض الفرز. بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف منصة آلية واسعة النطاق لاشتقاق الخلايا الليفية ، وتوليد hiPSC والتمايز9 ولكن على نطاق لا يمكن تحقيقه إلا من قبل المختبرات عالية الإنتاجية المخصصة لإنتاج خطوط التي تبدو جذابة ولكن يمكن أن تكون غير محتملة بالنسبة للعديد من المختبرات الأكاديمية.
لقد طورنا نظامًا آليًا بالكامل لثقافة الخلايا استنادًا إلى محطة معالجة سائلة في بيئة مصفاة للهواء الجسيمات عالي الكفاءة (HEPA) بالتزامن مع حاضنة CO2 ذات سعة كبيرة ، ومقياس هواء التصوير المضيء وذراعًا روبوتيًا لنقل الألواح. وتوفر هذه المكونات الأساس لثقافة وتمايز hiPSC مستقرين ويمكن استنساخه. أكملنا النظام مع نظام تخزين آلي -20 درجة مئوية لتخزين المركب أو الفيروسات وصورة قرص غزل عالية السرعة كونفوكال الخلايا الحية. تم إنشاء بروتوكولات مصنوعة حسب الطلب تسمح بذر الخلايا الآلي ، وتغييرات الوسائط ، وفحوصات الالتقاء ، وتوسيع الخلايا ، وتوليد لوحة الفحص مع معالجة العينات وتصوير الألواح ، مما يجعل النظام متوافقًا مع فحوصات عالية المحتوى / عالية الإنتاجية. يتم تشغيل نظام الخلايا وثقافة التصوير الآلي باستخدام برنامج التحكم وواجهة المستخدم الرسومية المصنوعة حسب الطلب (GUI). تسمح واجهة المستخدم الرسومية للمستخدمين باستيراد ملفات CSV التي تحتوي على معلمات خاصة بخط الخلية المطلوبة لتنفيذ الأسلوب. بالإضافة إلى ذلك، تمكن واجهة المستخدم الرسومية من جدولة العديد من التجارب في أي تسلسل باستخدام طريقة عرض التقويم المضمنة مما يسمح بالتحكم الكامل في الوقت الذي يبدأ فيه كل أسلوب.
يستخدم نظام ثقافة الخلايا الآلي لدينا سرعات الأنابيب القياسية ، وأوقات المرور ، وعتبات الالتقاء ، وكثافات البذر ، والأحجام المتوسطة مع المرونة لخلايا الثقافة في مجموعة متنوعة من تنسيقات الألواح (96 -، 48 - ، 24 - ، 12 - ، 6 - أو تنسيق لوحة 1 well). نحن تكييفها نشرت مؤخرا بروتوكول التمايز على المدى القصير لتحويل hiPSC إلى الخلايا العصبية التي يمكن أن تسفر عن الخلايا العصبية إيجابية TUBB3 في 6 أيام10,11. أنشأنا أيضا التمايز الآلي والتصوير من الخلايا جزيء صغير السلائف العصبية (smNPC) في الخلايا العصبية التي تعبر عن GFP تحت EF1a المروج12 و iPSC في الخلايا العصبية الدوبامين منتصف القرنية (mDA) ، والتكيف مع بروتوكول تثبيط المزدوج SMAD المنشورة سابقا13 أن تسفر عن الخلايا العصبية mDA في غضون 65 يوما.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287</td>
			<td>1 to 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Oct3/4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>1 to 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti- TUBB3</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>1 to 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-BRN2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-TH</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-74421</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei counterstaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechest 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1 to 8,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent TapeStation system</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>4200</td>
			<td>Automated electrophoresis 
			for DNA and RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated -20 &#176;C storage system</td>
			<td>Hamilton Storage 
			Technologies</td>
			<td>Sample Access Manager 
			(SAM -20C, 3200 series)</td>
			<td>Storage of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode reader</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>Barcode Reader Orbit</td>
			<td>Barcode scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield cell cytomat</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Confluence check and 
			cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Automated confocal 
			microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for cell cultures</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 24 C, CU</td>
			<td>12 stackers pitch 28 mm, 
			12 stackers pitch 23 mm 
			(total of 456 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for thawing samples</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 2-LIN, 60 DU 
			(Drying Unit)</td>
			<td>2 stackers pitch 28 mm 
			(total of 42 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Hood Flow Star UV</td>
			<td>Modified by Hamilton 
			Robotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling station</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Microlab Star</td>
			<td>Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml 
			and 96 Channel MPH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>188211APE</td>
			<td>Media/reagents reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water system</td>
			<td>Veolia Water</td>
			<td>ELGA PURELAB Classic</td>
			<td>Provides pure water for 
			needle wash station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Real-Time 
			PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>QSTUDIO12KOA</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Rackrunner</td>
			<td>Transport of plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turn table</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Turn Table</td>
			<td>Adjust plate orientiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterruptible power supply</td>
			<td>APC</td>
			<td>Smart UPS RT Unit, 
			10000 VA Power supply</td>
			<td>Backup power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO-pipettes</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4500</td>
			<td>Electronic pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4453545</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well culture plate (84 cm2)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td>Nunc OmniTray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates (9.6 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate (3.9 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate (0.32 cm2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005558</td>
			<td>CellCarrier-96 Black plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 50-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235987</td>
			<td>50-uL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 300-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235985</td>
			<td>300-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 1000-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235939</td>
			<td>1000-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 5-mL</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>184022</td>
			<td>5-mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 15-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>15-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 50-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>50-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene cryogenic 2.0 mL vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V5007</td>
			<td>Cryovials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_hEF1a_rtTA3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61472</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61474</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sequence (forward)</td>
			<td>Sequence (reverse)</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 (ID 4505967a1)</td>
			<td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td>
			<td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG (ID 153945815c3)</td>
			<td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td>
			<td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REX1 (ID 89179322c1)</td>
			<td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td>
			<td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2 (ID 87578393c1)</td>
			<td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>
			<td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN2 (ID 380254475c1)</td>
			<td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td>
			<td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUX2 (ID 291045458c2)</td>
			<td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td>
			<td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td>
			<td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td>
			<td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td>
			<td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td>
			<td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH</td>
			<td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td>
			<td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td>
			<td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Housekeeping genes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td>
			<td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAZ1</td>
			<td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td>
			<td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLPO</td>
			<td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td>
			<td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPL13A</td>
			<td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td>
			<td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Use concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 - 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC culture medium 
			(Essential 8 Flex medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - NGN2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.909 mL (50 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331093</td>
			<td>484.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL ( 2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>0.25 mL (2.5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - SRM medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.5 mL (55 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>409.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement 
			(serum replacement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>75 mL (15%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - N2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>475 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL(1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline (dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate 
			magnesium (AA2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>64 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic factor-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMA)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833-10MG</td>
			<td>0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>420220-10MG</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13197</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid (AA1)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189 (LDN)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11802</td>
			<td>100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (Purm)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Hedgehog/Shh (C24II) 
			N-Terminus (SHH)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1845-SH</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542 (SB)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13031</td>
			<td>10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor type &#223;3 
			(TGF&#223;3)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>243-B3</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10005583</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell dissociation reagent 
			(StemPro Accutase)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11575020</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation and cDNA kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Rneasy MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Trizol lysis buffer (RNA 
			lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080-085</td>
			<td>SuperScript III Reverse 
			Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Framework (CCF) 
			(Graphical user interface, GUI)</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>User interface for the automated system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellPathFinder software 
			(image analysis software 1)</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellPathfinder HCS Software</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager Measurement System</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>Included with 
			CellVoyager 7000</td>
			<td>Microscope controlling 
			software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus software 
			(image analysis software 2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloud based qPCR app</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Themo Fisher cloud</td>
			<td>Analysis software for 
			qRT-PCR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus software</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>VENUS Two Dynamic 
			Schedular 5.1 Software</td>
			<td>Controlling software for the 
			automated system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring

من الصعب توحيد الثقافات اليدوية وبروتوكولات التمايز للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من البشر ، وإظهار التباين العالي ، وهي عرضة للتمايز التلقائي في أنواع الخلايا غير المرغوب فيها. وهذه الأساليب كثيفة العمالة ولا يسهل أن تكون قابلة للتجارب الواسعة النطاق. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير نظام ثقافة الخلايا الآلي مقرونًا بنظام تصوير عالي الإنتاجية وبروتوكولات تنفيذها للحفاظ على خطوط hiPSC متعددة في التمايز المتوازي والخلوي. نحن نصف أتمتة بروتوكول التمايز على المدى القصير باستخدام Neurogenin-2 (NGN2) الإفراط في التعبير لإنتاج الخلايا العصبية القشرية المستمدة من hiPSC في غضون 6\u20128 أيام، وتنفيذ بروتوكول التمايز على المدى الطويل لتوليد الخلايا العصبية الدوبامين منتصف البرية المشتقة من hiPSC (mDA) في غضون 65 يوما. أيضا، طبقنا نهج NGN2 على خلايا السلائف العصبية الصغيرة المشتقة من الجزيء (smNPC) التي تم تحويلها مع فيروس العدس GFP وأنشأنا مقايسة نيوريت الأوتوماتيكية الحية. نقدم نظامًا آليًا مع بروتوكولات مناسبة لثقافة hiPSC الروتينية والتمايز إلى الخلايا العصبية القشرية والدوبامينية. منصتنا مناسبة لثقافة طويلة الأجل خالية من اليدين وعالية المحتوى / عالية الإنتاجية المركب القائم على hiPSC ، RNAi و CRISPR / Cas9 فحص لتحديد آليات الأمراض الجديدة وأهداف المخدرات.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

نظهر أتمتة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSC) والثقافات والتمايزات العصبية المتوافقة مع التصوير الآلي والتحليل.

الإنتاج الآلي من الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية المشتقة الخلايا الجذعية الخلايا العصبية القشرية والدوبامين مع المتكاملة مراقبة الخلايا الحية

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

الهدف العام من هذه الدراسة هو إظهار كيفية تنفيذ الإجراءات الآلية لأصناف وتمايز خلايا IPS البشرية إلى أنساب الخلايا العصبية ، فضلا عن التصوير الآلي. تسمح الإجراءات الآلية الموحدة بانخفاض التباين التجريبي مع ضمان قابلية تكرار عالية للـphenotypic. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف النظام من أجل وضع بروتوكولات جديدة.إثبات الإجراءات سيكون (يواكيم تاغر) و(إليسانجيلا بريسان) بعد المستندات من مختبرنا في واجهة المستخدم الرسومية للنظام الآلي، انقر فوق طريقة عرض عملية أداة الموارد وحدد عملية أداة المورد. انقر فوق تشغيل عملية الصك وتشغيل غطاء محرك السيارة هيبا تشغيل وإعادة تحميل العمليات.حدد الموارد التي سيتم تحميلها، وفتح الباب وتحميل لوحات ثقافة الخلية والنصائح المتاح في المواضع المناسبة كما هو مبين من قبل الصور المنبثقة. ثم إزالة التلوث الباب مع 70٪ الإيثانول قبل إغلاق وتشغيل عملية إزالة التلوث. سيتم تعقيم النظام بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.لتحميل لوحات مع كاشف الثقافة المتوسطة أو فصل، تنفيذ الخطوة هيبا هود تشغيل وفتح باب محطة التعامل مع السائل. بعد إزالة التلوث مع 70٪ الإيثانول، ضع الخزانات على سطح السفينة إلى الموقع المخصص وإزالة غطاء لهم. إغلاق باب محطة معالجة السائل، ثم تشغيل عملية أداة الموارد InitHepaHood إلى السلطة أسفل غطاء محرك السيارة HEPA.لتنفيذ أسلوب ثقافة تلقائي، في طريقة عرض التقويم لواجهة مستخدم الرسوم، انقر فوق إضافة خطوة عملية وحدد خط الخلية الذي سيتم استخدامه في التجربة. استخدم المعالج لتحديد المشروع ووضع علامة على المجموعة التي سيتم استخدامها. انقر فوق رأس السهم المواجه لليمين وانتقل إلى الصفحة التالية من المعالج لتحديد خطوة العملية التي سيتم تنفيذها.في الصفحة الأخيرة من المعالج، قم بجدولة التجربة وتعيين متغيرات تفاصيل المعلمات المناسبة الضرورية لتشغيل الأسلوب. ثم انقر فوق موافق. بعد تحميل أنبوب 50 ملليلتر مع تعليق خلية IPS الإنسان، تحميل لوحات الثقافة المغلفة لاستقبال الخلايا على الرف وتنفيذ البذر من لوحات من طريقة أنابيب. لحساب الخلايا في جهاز قياس الخلايا التصوير برايتفيلد، قم بإعداد لوحة العد 384 بئرًا تلقائيًا مع تعليق الخلية على سطح السفينة واستخدام الذراع الروبوتية لنقل لوحة العد 384 من سطح السفينة إلى مقياس الخلايا التصويرية لـ Brightfield.بعد العد، فإن النظام العودة لوحة إلى موقعها الأصلي ونقل ثقافة المغلفة أو لوحة المقايسة من الرف إلى سطح الأنابيب. ثم سيقوم النظام بذر الخلايا في عدد المعرفة من قبل المستخدم وأحجام مناسبة للوحة ومزيج عن طريق الأنابيب. وبعد البذر، سيتم نقل اللوحة إلى شاكر على سطح السفينة لمدة 10 ثوانٍ بمعدل 500 ثورة في الدقيقة لتوزيع الخلايا قبل نقلها إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون.لتقييم الالتقاء الآلي، قم بتنفيذ طريقة التقاء الاختيار وحدد دفعة تحتوي على لوحة ثقافة واحدة على الأقل ولا لوحات فحص. في قسم تفاصيل المعلمات، أدخل iPSCf_2020 للحصول على الصور في إعدادات تحليل الصور. ثم سيقوم النظام بنقل اللوحة الأولى من الحاضنة إلى مقياس الخلايا التصويرية في Brightfield وصورة التقاء الخلية.لتغيير ثقافة الخلية أو وسائط لوحة المعايرة، قم بتنفيذ طريقة تغيير الوسائط للوحات الثقافة وحدد دفعة تحتوي على لوحات بيانات ونُفذة فقط. سيقوم النظام بنقل اللوحات إلى سطح السفينة وإمالة اللوحات للسماح بطموح المابير. سيتم التخلص من المابير إلى وحدة جمع النفايات والتخلص من النصائح وسيتم إضافة 12 ملليلتر من المتوسطة الطازجة إلى كل لوحة.ثم سيقوم النظام بإعادة غطاء اللوحات وإعادة اللوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية. بدلا من ذلك، لتغيير المتوسطة من لوحات المقايسة، وتنفيذ تغيير وسائل الإعلام من طريقة لوحات فحص. إلى subcultivate الخلايا، تنفيذ subcultivation من الأسلوب الخلايا الضم وتحديد الدفعة التي تحتوي على لوحات الثقافة التي تحتاج subcultivation.بعد التخلص من المتوسطة، سيقوم النظام بغسل الخلايا مرة واحدة بثمانية ملليلترات من PBS لكل لوحة قبل إضافة ثمانية ملليلترات من 0.5 ملليمولار EDTA إلى الخلايا. بعد ثماني دقائق على سطح السفينة مع خيار إمالة، سيتم استبدال EDTA مع 12 ملليلتر من المتوسطة الطازجة لكل لوحة. النظام سوف يهز لوحات في 2،000 الثورات في الدقيقة الواحدة لمدة دقيقة واحدة لطرد المستعمرات قبل triturating الخلايا مع خمس دورات من الأنابيب لتفريق المستعمرات إلى 50 إلى 80 ميكرون كتل.ثم يتم نقل الخلايا إلى أنبوب 50 ملليلتر على سطح السفينة قبل بذرها في نسبة تقسيم واحد إلى سبعة. بالنسبة لمحتوى عالي تلقائي، تصوير خلايا إنتاجية عالية، قم بتنفيذ طريقة التصوير وحدد دفعة تحتوي على لوحة فحص واحدة على الأقل ولا توجد لوحات بيانات استزراع. سيقوم النظام بعد ذلك بنقل لوحة فحص إلى المجهر confocal الآلي للتصوير.تأكد من تحديد معرفات الدفعية والصفائح الصحيحة أثناء تنفيذ خطوات العملية المطلوبة. وينبغي رصد الثقافات hiPSC يوميا للنمو وتحليلها بالنسبة المئوية من التقاء في جهاز القياس التصويري برايتفيلد. بعد passaging وثقافة النظام اليدوي أو الآلي ، تظهر الخلايا تعبيرًا نموذجيًا لخلية جذعية وتعبير علامة متعددة القدرات.تظهر الخلايا العصبية المتمايزة في نظام الثقافة الآلي تنظيمًا مماثلًا للتشكل والشبكة العصبية للخلايا العصبية المزروعة يدويًا. بعد ستة أيام من التمايز، الخلايا العصبية القشرية المتمايزة تلقائياً إيجابية للفئة الثالثة بيتا توبولين وعلامة الطبقة القشرية العليا. بعد ثمانية أيام، أعربت الخلايا أيضا عن البروتين المرتبط بالميككتوبول 2، وجزيء التصاق الخلية العصبية، والتشابك الأول، فضلا عن علامات الخلايا العصبية القشرية.ويلاحظ انخفاض جدا أو أي تعبير عن هذه العلامات في hiPSC. ويمكن أيضا أن يستخدم هذا النظام لإنشاء خلية حية الآلي مقايسة نوريت التي تسمح أطوال neurite أن تقاس على مدى 11 يوما من التمايز دون تدخل يدوي. باستخدام نظام الثقافة الآلي لإجراء تغييرات متوسطة على مدى فترة ثقافة 65 يوما يسهل التمايز hiPSC في الخلايا العصبية الدوبامين منتصف البرية مع التنظيم الخلوي المتوقع ومورفولوجيا.بالإضافة إلى نفيروث neurite، يمكن استكشاف غيرها من المقايسات الظاهرية الآلي ذات الصلة لدراسة تنكس الأعصاب، على سبيل المثال، TDP-43 نقل الحمض النووي الريبي foci و امتصاص ألفا سينوكلين فيبريل، باستخدام هذا الإنتاجية العالية، تنسيق المحتوى العالي.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

تعيين جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان مع الإنسان الفيروسة البطيئة TF Stemgent

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

وبنقل العدوى إلى الإنسان Nucleofecting الجذعية المحفزة المستحثة خلايا

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

اختيار وعزل المستعمرات من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة برمجتها من الخلايا الليفية الكبار

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

إعداد خلايا الفأر الجنينية الخلايا الليفية مناسبة للالإنسان التثقيف الجنينية والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

بسرعة وكفاءة توليد الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في تنسيق اللوحة Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

الاشتقاق وتوصيف خالية من التحوير الإنسان المستحثة متعددة القدرات خط الخلايا الجذعية والتحويل إلى تعريف الحالات السريرية الصف

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...