Name: automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Forfatterne taknemmeligt anerkende patienter og deres familier, der bidrog biomateriale til denne undersøgelse. De celler, der blev anvendt i undersøgelsen, var fra NINDS-samlingen med Rutgers (ND41865 som iPS#1) og laboratoriet for Dr. Tilo Kunath (iPS#2). Dette arbejde støttes delvis af NOMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, et fælles EU-program - Neurodegenerative Disease Research (JPND) (PH); DZNE I2A-initiativet (AD); PD-Strat, et ERA-Net ERACoSysMed-finansieret projekt (PH) og Foundational Data Initiative for Parkinsons Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD er en del af The Michael J. Fox Foundation's PATH to PD program. Forfatterne takker Steven Finkbeiner og Melanie Cobb (Gladstone Institutes) for at bidrage til etableringen af den manuelle mDA neuron differentiering protokol og Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) for bistand i neurite udvækst analyse setup.

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases.">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li><li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease.">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li><li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions.">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647 (2015).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System.">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+derivation,+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li><li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells.">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling.">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PloS one. 8 (3), 59252 (2013).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li><li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology,+autophagy,+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons.">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death &amp; disease. 6, 1811 (2015).</li><li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2++Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation.">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li><li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Huntington's+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics,+Morphology,+and+Maturation.">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimerBank:+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification.">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, 792 (2010).</li></ol>

Vi har intet at afsløre.

Vi introducerer et automatiseret cellekultursystem med integrerede billeddannelsesfunktioner til standardisering af hiPSC-kultur og neuronal differentiering. På grund af minimal brugerindgriben er eksperimentel variation lav sikring af reproducerbarheden af cellulære fænotyper under differentiering. Den kalenderbaserede planlægger understøtter tilrettelæggelsen og paralleliseringen af eksperimenter og giver mulighed for en høj grad af fleksibilitet, hvorefter forsøgene udføres. De eksisterende metoder kan let tilpasses, og spektret af tilgængelige metoder kan øges. Derudover kan et stort antal analyse plade formater bruges tilføje til fleksibiliteten i dette system. Det minimale system bestående af en CO2-inkubator, en robotarm, et lyst cellecytometer og en flydende håndteringsstation udgør den grundlæggende enhed, der er nødvendig for hiPSC-kultur og -differentiering, med overkommelige omkostninger til akademiske forskningslaboratorier. Kombinationen af det automatiserede cellekultursystem med et automatiseret -20 °C lagersystem til opbevaring af forbindelser, RNAi biblioteker eller CRISPR/Cas9 biblioteker, og integrationen af et højt indhold/høj-throughput mikroskop muliggør udførelse af fænotopypiske screeninger.
I den aktuelle undersøgelse brugte det automatiserede cellekultursystem engangstips, og kulturmediet blev genopfyldt manuelt i reservoiret, hvilket begrænsede brugen af væskehåndteringsstationen til medieændringer og andre kulturprocesser, især natten over. For at omgå denne begrænsning kan metoderne justeres til nålebrug i stedet for engangsspidser, og efter installation af rørforbindelser mellem medielinjer og medieposer, der er lagret i et køleskab, kan mediereservoirer automatisk genopfyldes med friske medier, der er forvarmet af varmelegemende elementer. Dette vil reducere brugerforstyrrelser forårsaget af manuel genopfyldning af tips, kulturmedier og reservoirudvekslinger.
Vores automatiserede cellekultursystem giver flere fordele. Den ene er stregkodesporingssystemet. Pladerne, der er indlæst i systemet, identificeres ved hjælp af en unik stregkode, som læses og gemmes af systemet, hvilket gør det muligt at spore prøver under og efter metodudførelse. En anden fordel er muligheden for at oprette brugerspecifikke projekter. Her kan kulturplader, der er indlæst i systemet, tildeles til et bestemt projekt og grupperes i batches. Strukturering i partier forenkler udførelsen af den samme procedure til alle plader af et bestemt parti, da der ikke er behov for at vælge individuelle plader. Derudover gør en flydende klasseeditor det muligt at justere pipetteringshastigheden og -højden samt aspirations- og dispenseringsparametrene for hvert væskeoverførselstrin. Hver proces er dokumenteret i logfiler gør det muligt at spore hvilke opgaver er blevet udført for en given kultur eller analyse plade.
Neuroner og andre celletyper fremstillet af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) er nyttige in vitro-værktøjer til at studere mekanismerne i neurodegenerative sygdomme i specifikke patientpopulationer (f.eks. dopaminerge neuroner mod Parkinsons sygdom), hvilket giver mulighed for personlige lægemiddelscreeninger. Culturing hiPSC er meget tidskrævende og kræver uddannede mennesker til at udføre komplekse differentiering protokoller, normalt begrænset til lav skala produktion. Vi tilpassede hiPSC's feeder-fri kultur til en automatiseret kultur og implementerede to neuronaldifferentieringsprotokoller, en hurtig kortikal neurondifferentieringsprotokol baseret på NGN2 overudtryk under en tet-on promotor10,11og en langsigtet lille molekylebaseret protokol til generering af midbrain dopaminerge (mDA) neuroner13. Den enkle overførsel og reproducerbarhed af manuel kultur og differentieringsprotokoller gør det automatiserede kultursystem meget nyttigt. Human iPSC dyrket i det automatiserede cellekultursystem viste konsekvent stamcellemorfologi og udtrykte vigtige pluripotency markører, reproducerbare mellem uafhængige eksperimenter. Desuden favoriserede automatiseringen af hiPSC-kulturprotokollen kulturen og udvidelsen af et større antal cellelinjer parallelt. Automatiseret sammenkoblingskontrol, der er planlagt til at blive udført natten over, sparede tid på at lade systemet være frit i løbet af dagen for de efterfølgende procestrin, der blev udført, da brugeren var i laboratoriet (f.eks. høst af celler eller manuel replating til differentiering). Når cellerne når den brugerdefinerede sammenløbstærskel, oversendes og genindlægges de i ekstracellulære matrixbelagte plader, der er tilgængelige på stableren i det automatiserede cellekultursystem. Hver passage runde tager omkring 70 min og genererer fire 1-brønd plader fra en forælder plade, hvilket svarer til en kapacitet på 20 passager på en dag.
Automatiseringen af NGN2-differentieringsprotokollen blev udført med succes og gjorde det muligt at skabe en homogen population af neuronale celler på tværs af forskellige passager og sammenlignes med manuelle differentieringer. Desuden vil de eksperimentelle omkostninger til storstilede screeningsundersøgelser, der omfatter flere cellelinjer eller screeningsforsøg med tusindvis af testbetingelser/-forbindelser, blive reduceret på grund af hurtige differentieringer. Omkostningseffektive og høj-throughput udlæsninger, herunder levende-celle neurite outgrowth målinger kan let udvikles, gennemføres og anvendes som fænotopypiske udlæsninger til sygdom modellering, som vist tidligere14,15,16. Således har vi yderligere tilpasset NGN2-protokollen ved hjælp af små molekyle afledt neurale forløber (smNPC) celler, der konstituerende over-ekspres GFP. SmNPC-cellerne giver yderligere fordele, herunder reducerede omkostninger med kulturmedier (en tredjedel af omkostningerne med iPSC-kultur) og den tid, der kræves for at opskalere eksperimenter. Celleudbyttet fra smNPC er 7 til 10 gange højere end den, der opnås med iPSC. De differentierende neuroner blev overvåget og afbildet i flere dage ved hjælp af en fuldautomatisk billeddannelsesproces uden behov for manuelle antistoffarvninger eller kemisk mærkning, hvilket sparede omkostninger og tid, der kræves til manuelle procedurer, herunder billeddannelse i sig selv. Den nuværende billeddannelse af indre 60 brønde af en 96-brønd plade tager omkring 16 min per plade, når 25 felter pr brønd er afbildet, hvilket betyder, at data for en billedbehandling-baseret screening for 1000 forbindelser, kunne erhverves og analyseres på en dag. I fremtiden kan denne udlæsning anvendes i sammensatte screeningsundersøgelser til redning af neurite udvækstdefekter.
Endvidere demonstrerer vi også overførslen af en manuel differentieringsprotokol til generering af midbrain dopaminerge (mDA) neuroner fra iPSC. Denne lille molekyle-baserede differentiering protokol tager 65 dage og er arbejdskrævende på grund af de mange replating trin og hyppige medieændringer, for det meste hver 2 dage, hvilket begrænser produktionen af mDA neuroner til få iPSC linjer på samme tid. Den automatiserede mDA-differentieringsprotokol har den store fordel at opskalere differentieringen til snesevis af iPSC-linjer. Op til 30 cellelinjer kan differentieres parallelt. Da differentieringen for det meste er baseret på medieændringer, kan næsten hele differentieringsprocessen udføres uden menneskelig indblanding. Ved hjælp af den kalenderbaserede planlægger af det automatiserede system kunne vi planlægge medieændringerne i henhold til differentieringstrinnene. En begrænsning af arbejdet med et så stort antal cellelinjer og kulturplader var det umuligt at udføre dag-til-dag medieændringer. Den væsentligste årsag er, at vores system er sat op til brug af engangstips og manuel genopfyldning af kulturmedier, der kræver en bruger i laboratoriet til at udføre dette manuelle trin. For at lette medieændringsprocessen blev plader, der blev indlæst i systemet, tildelt til et projekt og grupperet i batches. Batchstørrelsen blev derefter tilpasset antallet af engangstips og mængden af kulturmedier, der var til rådighed. Som beskrevet ovenfor kan denne begrænsning let overvindes ved implementering af genanvendelige/vaskbare nåle og automatiseret genopfyldning af medier. Automatiseret aflevering/replating af celler, som vist for iPSC, er en af de bekvemmeligheder, der tilbydes af vores automatiserede cellekultursystem. Vi har testet den automatiserede replating af mDA neuroner på dag 25 af differentiering. Dissociationen af mDA-neuroner kræver dog længere (40 min) inkubation med dissociationsenzymet end iPSC (8 min) og udvider den automatiserede replatingsproces til mere end 1 time pr. cellelinjer. Som følge heraf blev den automatiserede replating af 30 cellelinjer på samme dag umulig. Fremskynde andre trin under automatiseret replating (transport af plader, pipettering) og tilpasning af systemet til brugen af nåle og medier linje, der gør en overnatning arbejde muligt ville løse denne begrænsning. På trods af ulemperne kunne vi med held overføre den manuelle protokol til en automatiseret differentiering af mDA neuroner, der producerer kulturer med betydelige mængder MAP2 (neuron) og TH (mDA neuroner) positive celler.
Differentiering snesevis af iPSC cellelinjer parallelt er af stor interesse i projekter, der undersøger de molekylære mekanismer af neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom. Men at udføre opgaver hurtigere med færre fejl og til reducerede omkostninger er en stor udfordring. På grund af automatiseringen af de protokoller, der præsenteres her (iPSC, smNPC og mDA neuron), kunne vi fremskynde, reducere omkostningerne og øge reproducerbarheden i vores projekter. Udviklingen af projekter som FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/), der involverer hundredvis af patientcellelinjer, viser behov for automatiseret kultur og differentieringsprotokoller. Vores fremtidige perspektiver omfatter overførsel af manuelle 3-dimensionelle (3D) cellekulturmodeller til det automatiserede system. Mindre tilpasninger i pladedefinitionsindstillingerne og brug af adaptere vil gøre det muligt at anvende kommercielle eller specialfremstillede plader og mikrofluidiske kamre, der er nødvendige for 3D-kulturerne. Desuden vil gennemførelsen af en automatiseret etiketfri billeddannelsesmodel give os mulighed for at spore neuronal vækst i realtid og omsætte ændringer i neurite udvækst, neuron organisation og celledød i bedre forståelse af sygdommen mekanismer.

Humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) er selvforsynende og kan differentiere i næsten enhver voksen celletype. Disse egenskaber gør hiPSC et nyttigt redskab til sygdomsmodellering i grundforskning og lægemiddelopdagelse1. Human iPSC bevarer donorgenetiske baggrund, som gør det muligt at udlede sygdomsrelevante celletyper, der er mest berørt / involveret i sygdomsforløbet, for eksempel forskellige neuronale undertyper for neurodegenerative sygdomme2,3. Også hiPSC overvinder nogle af de begrænsninger af dyr og cellulære over-udtryk modeller ved modellering sygdomme i en menneskelig sammenhæng og fysiologiske protein udtryk niveauer, og har vist sig at være et værdifuldt aktiv i modellering sygdomme lige fra monogene, komplekse og epigenetiske lidelser samt sent indsættende sygdomme4.
På trods af disse fordele og muligheder er der stadig flere begrænsninger i hiPSC, der skal løses. Nuværende hiPSC kultur og differentiering protokoller er ikke omkostningseffektive, vanskelige at standardisere og er arbejdskrævende. Manuelle kulturtrin kan resultere i høj variation i udbyttet og fænotyperne på grund af forskelle i vækst og spontan differentiering af hiPSC. Derfor skal eksperimentatorafhængig variation reduceres ved at implementere mere standardiserede håndteringsteknikker og forenkle protokoller, der kan opnås ved hjælp af automatisering5. Indførelsen af automatiserede hiPSC-kultur- og differentieringsprotokoller vil fastsætte fælles standarder for både akademiske og industrielle forskningsprojekter og muliggøre generering af biologisk relevante sygdomsmodeller og mere reproducerbare resultater.
Tidligere arbejde har forsøgt automatisering af hiPSC kulturer6,7,8, men deres protokoller har været begrænset til specifikke cellekultur plade formater afhængige af systemet og mangler tilpasningsevne til forskellige analyse formater. Sådanne systemer er nyttige i bulking af celler, men kan ikke være egnet til automatiseret differentiering i ønskede celletyper, sygdom fænotypebestemmelse, og screening formål. Derudover er en storstilet automatiseret platform for fibroblast afledning, hiPSC generation og differentiering blevet beskrevet9, men på en skala, der kun kan opnås ved high-throughput laboratorier dedikeret til produktion af linjer, der synes attraktive, men kan være uoverkommelige for mange akademiske laboratorier.
Vi udviklede et fuldautomatisk cellekultursystem baseret på en væskehåndteringsstation i et hepa-filtreret miljø (High-Efficiency Particulate Air) sammen med en CO2-inkubator med stor kapacitet, et lysfeltsbilledcytometer og en robotarm til pladetransport. Disse komponenter danner grundlag for stabil og reproducerbar hiPSC kultur og differentiering. Vi supplerede systemet med et automatiseret -20 °C lagersystem til blanding eller virus opbevaring og en high-speed spinning disk konfokale live-celle imager. Skræddersyede protokoller blev genereret tillader automatiseret celle såning, medieændringer, sammenløb kontrol, celle ekspansion og analyse plade generation med prøve behandling og plade billeddannelse, hvilket gør systemet kompatibelt med højt indhold / høj-throughput screeninger. Det automatiserede cellekultur- og billedsystem drives ved hjælp af den styrende software og den skræddersyede grafiske brugergrænseflade (GUI). GUI'en giver brugerne mulighed for at importere CSV-filer, der indeholder cellelinjespecifikke parametre, der er nødvendige for metodekørsel. Derudover gør GUI'en det muligt at planlægge mange eksperimenter i enhver sekvens ved hjælp af den indbyggede kalendervisning, hvilket giver fuld kontrol over det tidspunkt, hvor hver metode starter.
Vores automatiserede cellekultursystem bruger standardiserede pipetteringshastigheder, afleveringstider, sammenløbstærskler, såningstætheder og mellemstore volumener med fleksibilitet til at dyrke celler i en række forskellige pladeformater (96-, 48-, 24-, 12-, 6- eller 1-brøndpladeformat). Vi har tilpasset en nyligt offentliggjort kortsigtet differentiering protokol til konvertering af hiPSC til neuroner, der kan give TUBB3 positive neuroner i 6 dage10,11. Vi har også etableret den automatiserede differentiering og billeddannelse af små molekyle neurale prækursorceller (smNPC) i neuroner konstituerende udtryk for GFP under EF1a promotor12 og iPSC i midbrain dopaminerge (mDA) neuroner, tilpasse en tidligere offentliggjort dual-SMAD hæmning protokol13, der giver mDA neuroner inden for 65 dage.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287</td>
			<td>1 to 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Oct3/4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>1 to 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti- TUBB3</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>1 to 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-BRN2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-TH</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-74421</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei counterstaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechest 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1 to 8,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent TapeStation system</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>4200</td>
			<td>Automated electrophoresis 
			for DNA and RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated -20 &#176;C storage system</td>
			<td>Hamilton Storage 
			Technologies</td>
			<td>Sample Access Manager 
			(SAM -20C, 3200 series)</td>
			<td>Storage of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode reader</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>Barcode Reader Orbit</td>
			<td>Barcode scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield cell cytomat</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Confluence check and 
			cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Automated confocal 
			microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for cell cultures</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 24 C, CU</td>
			<td>12 stackers pitch 28 mm, 
			12 stackers pitch 23 mm 
			(total of 456 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for thawing samples</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 2-LIN, 60 DU 
			(Drying Unit)</td>
			<td>2 stackers pitch 28 mm 
			(total of 42 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Hood Flow Star UV</td>
			<td>Modified by Hamilton 
			Robotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling station</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Microlab Star</td>
			<td>Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml 
			and 96 Channel MPH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>188211APE</td>
			<td>Media/reagents reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water system</td>
			<td>Veolia Water</td>
			<td>ELGA PURELAB Classic</td>
			<td>Provides pure water for 
			needle wash station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Real-Time 
			PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>QSTUDIO12KOA</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Rackrunner</td>
			<td>Transport of plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turn table</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Turn Table</td>
			<td>Adjust plate orientiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterruptible power supply</td>
			<td>APC</td>
			<td>Smart UPS RT Unit, 
			10000 VA Power supply</td>
			<td>Backup power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO-pipettes</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4500</td>
			<td>Electronic pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4453545</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well culture plate (84 cm2)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td>Nunc OmniTray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates (9.6 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate (3.9 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate (0.32 cm2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005558</td>
			<td>CellCarrier-96 Black plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 50-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235987</td>
			<td>50-uL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 300-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235985</td>
			<td>300-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 1000-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235939</td>
			<td>1000-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 5-mL</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>184022</td>
			<td>5-mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 15-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>15-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 50-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>50-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene cryogenic 2.0 mL vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V5007</td>
			<td>Cryovials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_hEF1a_rtTA3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61472</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61474</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sequence (forward)</td>
			<td>Sequence (reverse)</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 (ID 4505967a1)</td>
			<td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td>
			<td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG (ID 153945815c3)</td>
			<td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td>
			<td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REX1 (ID 89179322c1)</td>
			<td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td>
			<td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2 (ID 87578393c1)</td>
			<td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>
			<td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN2 (ID 380254475c1)</td>
			<td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td>
			<td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUX2 (ID 291045458c2)</td>
			<td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td>
			<td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td>
			<td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td>
			<td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td>
			<td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td>
			<td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH</td>
			<td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td>
			<td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td>
			<td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Housekeeping genes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td>
			<td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAZ1</td>
			<td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td>
			<td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLPO</td>
			<td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td>
			<td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPL13A</td>
			<td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td>
			<td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Use concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 - 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC culture medium 
			(Essential 8 Flex medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - NGN2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.909 mL (50 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331093</td>
			<td>484.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL ( 2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>0.25 mL (2.5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - SRM medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.5 mL (55 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>409.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement 
			(serum replacement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>75 mL (15%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - N2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>475 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL(1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline (dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate 
			magnesium (AA2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>64 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic factor-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMA)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833-10MG</td>
			<td>0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>420220-10MG</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13197</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid (AA1)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189 (LDN)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11802</td>
			<td>100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (Purm)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Hedgehog/Shh (C24II) 
			N-Terminus (SHH)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1845-SH</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542 (SB)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13031</td>
			<td>10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor type &#223;3 
			(TGF&#223;3)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>243-B3</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10005583</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell dissociation reagent 
			(StemPro Accutase)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11575020</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation and cDNA kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Rneasy MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Trizol lysis buffer (RNA 
			lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080-085</td>
			<td>SuperScript III Reverse 
			Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Framework (CCF) 
			(Graphical user interface, GUI)</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>User interface for the automated system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellPathFinder software 
			(image analysis software 1)</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellPathfinder HCS Software</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager Measurement System</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>Included with 
			CellVoyager 7000</td>
			<td>Microscope controlling 
			software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus software 
			(image analysis software 2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloud based qPCR app</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Themo Fisher cloud</td>
			<td>Analysis software for 
			qRT-PCR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus software</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>VENUS Two Dynamic 
			Schedular 5.1 Software</td>
			<td>Controlling software for the 
			automated system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring

Manuel kultur og differentieringsprotokoller for humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) er vanskelige at standardisere, viser høj variation og er tilbøjelige til spontan differentiering i uønskede celletyper. Metoderne er arbejdskrævende og er ikke let modtagelige for store eksperimenter. For at overvinde disse begrænsninger udviklede vi et automatiseret cellekultursystem koblet til et billedsystem med høj overførselshastighed og implementerede protokoller til vedligeholdelse af flere hiPSC-linjer parallel og neuronal differentiering. Vi beskriver automatiseringen af en kortsigtet differentieringsprotokol ved hjælp af Neurogenin-2 (NGN2) overudfoldelse til at producere hiPSC-afledte kortikale neuroner inden for 6\u20128 dage og implementering af en langsigtet differentieringsprotokol for at generere hiPSC-afledte midbrain dopaminergiske (mDA) neuroner inden for 65 dage. Også, vi anvendt NGN2 tilgang til et lille molekyle-afledte neurale forløber celler (smNPC) transduced med GFP lentivirus og etableret en levende celle automatiseret neurite udvækst assay. Vi præsenterer et automatiseret system med protokoller egnet til rutinemæssig hiPSC kultur og differentiering i kortikale og dopaminerge neuroner. Vores platform er velegnet til langsigtet håndfri kultur og højindhold/høj-throughput hiPSC-baserede sammensatte, RNAi og CRISPR/ Cas9 screeninger for at identificere nye sygdomsmekanismer og narkotikamål.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Vi viser automatisering af human induceret pluripotent stamcelle (hiPSC) kulturer og neuronal differentiering kompatibel med automatiseret billeddannelse og analyse.

Automatiseret produktion af humane inducerede pluripotente stamceller-afledte kortikale og dopaminerge neuroner med integreret Live-Cell Overvågning

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Det overordnede mål med denne undersøgelse er at vise, hvordan man gennemfører automatiserede procedurer for dyrkning og differentiere menneskelige IPS-celler i neuronale slægter, samt deres automatiserede billeddannelse. Standardiserede automatiserede procedurer giver mulighed for lav eksperimentel variation og sikrer samtidig høj fænoypisk reproducerbarhed. Desuden kan systemet tilpasses til udvikling af nye protokoller.Demonstration af procedurerne vil være Joachim Tager og Elisangela Bressan, post-docs fra vores laboratorium. Klik på ressourceinstrumentprocesvisning i det automatiserede systems grafiske brugergrænseflade, og vælg ressourceinstrumentprocessen. Klik på kør instrumentprocessen, og kør de kørende HEPA-hætte- og genladningsprocesser.Vælg de ressourcer, der skal indlæses, åbn døren og indlæs cellekulturpladerne og engangsspidserne i de relevante positioner som angivet af popup-billederne. Derefter dekontaminere døren med 70% ethanol før lukning og køre dekontaminering proces. Systemet vil blive steriliseret af UV-stråling i 30 minutter.For at lægge pladerne i med kulturmedium eller dissociationsrenation skal du udføre trinnet TIL at køre HEPA-emhætten og åbne døren til væskehåndteringsstationen. Efter dekontaminering med 70% ethanol, placere reservoirerne på dækket til den tildelte position og af-låget dem. Luk døren til den flydende håndtering station, derefter køre InitHepaHood ressource instrument proces til at lukke HEPA hætten.Hvis du vil udføre en automatiseret kulturmetode, skal du klikke på tilføj procestrin i kalendervisningen af den grafiske brugergrænseflade og vælge den cellelinje, der skal bruges i eksperimentet. Brug guiden til at markere projektet og markere den batch, der skal bruges. Klik på højre mod pilespids, og naviger til næste side i guiden for at vælge det procestrin, der skal udføres.I den sidste side i guiden skal du planlægge eksperimentet planlægges og angive de relevante parametre detaljer variabler, der er nødvendige for at køre metoden. Klik derefter på OK. Efter iladning af et 50 milliliterrør med den menneskelige IPS-celleaffjedring, skal der vejes belagte kulturplader til modtagelse af cellerne på hylden, og såning af plader udføres fra rørmetoden. For at tælle cellerne i Brightfield imaging cytometer, automatisk forberede en 384-brønd tælle plade med celle suspension på dækket og bruge robot arm til at overføre 384-brønd tælle plade fra dækket til Brightfield imaging cytometer.Efter optællingen vil systemet returnere pladen til sin oprindelige position og overføre en belagt kultur eller analyseplade fra hylden til pipetteringsdækket. Systemet vil derefter frø cellerne i det brugerdefinerede antal og mængder egnet til pladen og blandes ved pipettering. Efter såning, vil pladen blive flyttet til on-deck shaker i 10 sekunder ved 500 omdrejninger i minuttet for cellefordeling, før de overføres til kuldioxid inkubator.For at vurdere det automatiske sammenløb skal du udføre kontrol sammenløbetsmetoden og vælge et batch, der indeholder mindst én kulturplade og ingen analyseplader. I afsnittet med detaljer om parametre skal du iPSCf_2020 for billedopkøb i billedanalyseindstillingerne. Systemet vil derefter overføre den første plade fra inkubatoren til Brightfield imaging cytometer og billede af cellekonfluence.Hvis du vil ændre cellekultur eller analyseplademedier, skal du udføre metoden med medieændring af kulturplader og vælge et batch, der kun indeholder kulturplader. Systemet overfører pladerne til dækket og vippe pladerne for at tillade aspiration af supernatanten. Supernatanten vil blive kasseret til affaldsindsamlingsmodulet og kassere spidserne, og der tilsættes 12 milliliter frisk medium til hver plade.Systemet vil derefter sætte pladerne på igen og returnere pladerne til cellekulturkubvøsen. Alternativt, at ændre medium af analyse plader, udføre medieændring af analyse plader metode. For at underdyrke cellerne udføres subdyrkningsmetoden af klæbende celler, og batchen indeholder de kulturplader, der skal subdyrkes.Efter udsmid af mediet vasker systemet cellerne én gang med otte milliliter PBS pr. plade, før der tilsættes otte milliliter 0,5 millimolar EDTA til cellerne. Efter otte minutter på dækket med vippemulighed vil EDTA blive erstattet med 12 milliliter frisk medium pr. plade. Systemet vil ryste pladerne på 2.000 omdrejninger i minuttet i et minut for at løsne kolonierne, før de triturerer cellerne med fem cyklusser af pipettering for at bryde kolonierne op i 50 til 80 mikronklumper.Cellerne vil derefter blive overført til et 50 milliliterrør på dækket, før de sås i et en-til-syv splitforhold. For automatiseret højt indhold, høj gennemløb celle billeddannelse, udføre billeddannelse metode og vælge et parti, der indeholder mindst én analyseplade og ingen kultur plader. Systemet vil derefter overføre en analyseplade til det automatiske konfokale mikroskop til billedbehandling.Sørg for at vælge de korrekte batch- og plade-id'er, mens du udfører de nødvendige procestrin. HiPSC-kulturerne bør overvåges dagligt for vækst og analyseres for deres procentdel af sammenløbet i Brightfield imaging cytometer. Efter aflevering og manuel eller automatiseret systemkultur udviser cellerne et typisk stamcelle- og pluripotency markørudtryk.Neuroner differentieret i det automatiserede kultursystem demonstrere en lignende morfologi og neuronal netværk organisation til neuroner dyrkes manuelt. Efter seks dages differentiering, automatisk differentieret kortikale neuroner er positive for neuron-specifikke klasse III beta-tubulin og øvre kortikale lag markør udtryk. Efter otte dage, cellerne også udtrykt mikrotubule-associeret protein 2, den neurale celle vedhæftning molekyle, og synapsin I, samt kortikale neuron markører.Meget lav eller intet udtryk for disse markører er observeret i hiPSC. Dette system kan også bruges til at etablere en levende celle automatiseret neurite outgrowth assay, der tillader neurite længder, der skal måles over 11 dages differentiering uden manuel indgriben. Brug af det automatiserede kultursystem til at udføre medium ændringer over en 65-dages kulturperiode letter hiPSC-differentiering i midbrain dopaminerge neuroner med den forventede cellulære organisation og morfologi.Ud over neurite outgrowth, andre automatiserede fænoypiske analyser er relevante for at studere neurodegeneration, for eksempel, TDP-43 translokation RNA foci og alpha-synuclein fibril optagelse, kan udforskes ved hjælp af denne høje overførselshastighed, højt indhold format.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selektion og isolering Kolonier af Human induceret pluripotente stamceller omprogrammeret fra voksne fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering humane somatiske celler i induceret pluripotente stamceller (IPSC&#39;er) under anvendelse af retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Udarbejdelse af muse embryonale fibroblastceller anvendes til dyrkning af menneskelige embryoner og induceret pluripotente stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Hurtig og effektiv generering af neuroner fra humane pluripotente stamceller i en Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human cardiomyocytes: En Differentiering Protocol fra Feeder-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelige induceret pluripotente stamceller fra humane somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative kulturer til human Pluripotente Stem Cell Produktion, vedligeholdelse og Genetisk analyse

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Udledning og karakterisering af et transgen-fri menneskeskabte Pluripotente stamcellelinje og Omstilling i bestemte klinisk kvalitet Betingelser

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...