Name: automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

De auteurs erkennen dankbaar de patiënten en hun families die biomateriaal hebben bijgedragen aan deze studie. Cellen lijnen gebruikt in de studie waren uit NINDS collectie met Rutgers (ND41865 als iPS # 1) en het lab van Dr Tilo Kunath (iPS # 2). Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de NOMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, een EU Joint Programme - Neurodegenerative Disease Research (JPND) (PH); Het DZNE I2A-initiatief (AD); PD-Strat, een ERA-Net ERACoSysMed gefinancierd project (PH) en het Foundational Data Initiative for Parkinson's Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD maakt deel uit van het PATH to PD-programma van de Michael J. Fox Foundation. De auteurs bedanken Steven Finkbeiner en Melanie Cobb (Gladstone Institutes) voor het bijdragen aan de oprichting van de handmatige mDA neuron differentiatie protocol en Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) voor hulp bij neurite ontgroeiing analyse setup.

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases.">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li><li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease.">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li><li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions.">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647 (2015).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System.">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+derivation,+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li><li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells.">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling.">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PloS one. 8 (3), 59252 (2013).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li><li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology,+autophagy,+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons.">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death &amp; disease. 6, 1811 (2015).</li><li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2++Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation.">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li><li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Huntington's+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics,+Morphology,+and+Maturation.">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimerBank:+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification.">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, 792 (2010).</li></ol>

We hebben niets te onthullen.

We introduceren een geautomatiseerd celkweeksysteem met geïntegreerde beeldvormingsmogelijkheden voor de standaardisatie van de hiPSC-cultuur en neuronale differentiatie. Als gevolg van minimale gebruikersinterventie is de experimentele variatie laag en zorgt het voor reproduceerbaarheid van cellulaire fenotypes tijdens differentiatie. De kalender-gebaseerde planner ondersteunt de organisatie en parallelisatie van experimenten en maakt een hoge mate van flexibiliteit op welk moment de experimenten worden uitgevoerd. Bestaande methoden kunnen eenvoudig worden aangepast en het spectrum van beschikbare methoden kan worden vergroot. Bovendien kan een groot aantal testplaatformaten worden gebruikt om de flexibiliteit van dit systeem te behouden. Het minimale systeem bestaande uit een CO2-incubator, een robotarm, een brightfield celcytometer en een vloeistofbehandelingsstation vormen de basiseenheid die nodig is voor hiPSC-cultuur en -differentiatie, met betaalbare kosten voor academische onderzoekslaboratoria. De combinatie van het geautomatiseerde celcultuursysteem met een geautomatiseerd -20 °C-opslagsysteem voor de opslag van verbindingen, RNAi-bibliotheken of CRISPR/Cas9-bibliotheken, en de integratie van een hoog-inhoud/hoge-doorvoermicroscoop maken de uitvoering van fenotypische screenings mogelijk.
In de huidige studie, de geautomatiseerde cel cultuur systeem gebruikt wegwerp tips en de cultuur media werd handmatig bijgevuld in het reservoir, waardoor het gebruik van de vloeibare handling station voor media veranderingen en andere cultuur processen vooral 's nachts te beperken. Om deze beperking te omzeilen, kunnen de methoden worden aangepast aan naaldgebruik in plaats van wegwerptips en na het installeren van buisverbindingen tussen medialijnen en mediazakken die in een koelkast zijn opgeslagen, kunnen mediareservoirs automatisch worden bijgevuld met verse media die voorverwarmd worden door verwarmingselementen. Dit zou gebruikersinterferenten verminderen die worden veroorzaakt door handmatige bijvullen van tips, cultuurmedia en reservoiruitwisselingen.
Ons geautomatiseerde celcultuursysteem biedt verschillende voordelen. Een daarvan is de barcode tracking systeem. De platen geladen in het systeem worden geïdentificeerd door een unieke barcode die wordt gelezen en opgeslagen door het systeem waardoor het bijhouden van monsters tijdens en na de uitvoering van de methode. Een ander voordeel is de mogelijkheid om gebruikersspecifieke projecten te maken. Hier kunnen cultuurplaten die in het systeem worden geladen, aan een specifiek project worden toegewezen en in batches worden gegroepeerd. De structurering in batches vereenvoudigt de uitvoering van dezelfde procedure op alle platen van een bepaalde partij, aangezien er geen afzonderlijke platen hoeven te worden geselecteerd. Bovendien, een vloeibare klasse editor maakt het mogelijk om de pipetting snelheid en hoogte aan te passen, evenals de aspiratie en het verstrekken van parameters voor elke vloeibare overdracht stap. Elk proces wordt gedocumenteerd in logbestanden waardoor kan nagaan welke taken zijn uitgevoerd voor een bepaalde cultuur of testplaat.
Neuronen en andere celtypen afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) zijn nuttige in vitro-instrumenten voor het bestuderen van de mechanismen van neurodegeneratieve ziekten bij specifieke patiëntenpopulaties (bijvoorbeeld dopaminerge neuronen voor de ziekte van Parkinson) die de mogelijkheid bieden voor gepersonaliseerde geneesmiddelenscreenings. Culturing hiPSC is zeer tijd intensief en vraagt opgeleide mensen om complexe differentiatie protocollen uit te voeren, meestal beperkt tot lage schaal productie. We pasten de feedervrije cultuur van hiPSC aan een geautomatiseerde cultuur aan en implementeerden twee neuronale differentiatieprotocollen, een snel corticale neuron differentiatieprotocol op basis van NGN2 overexpressie onder een tet-on promotor10,11, en een langdurig protocol op basis van kleine moleculen voor het genereren van midbrain dopaminergische (mDA) neuronen13. De eenvoudige overdracht en reproduceerbaarheid van handmatige cultuur en differentiatie protocollen maakt het geautomatiseerde cultuursysteem zeer nuttig. Menselijke iPSC gekweekt in de geautomatiseerde cel cultuur systeem toonde consistente stamcelmorfologie en uitgedrukt belangrijke pluripotentie markers, reproduceerbaar tussen onafhankelijke experimenten. Bovendien gaf de automatisering van het hiPSC-cultuurprotocol de voorkeur aan de cultuur en uitbreiding van een groter aantal cellijnen parallel. Geautomatiseerde samenvloeiingscontroles die 's nachts moeten worden uitgevoerd, besparen tijd, zodat het systeem gedurende de dag vrij is voor downstreamprocesstappen die worden uitgevoerd toen de gebruiker zich in het laboratorium bevond (bijvoorbeeld het oogsten van cellen of handmatige replating voor differentiaties). Bij het bereiken van de door de gebruiker gedefinieerde samenvloeiingsdrempel worden cellen doorgegangerd en opnieuw gedeplateerd in extracellulaire matrixgecoate platen die beschikbaar zijn op de stacker van het geautomatiseerde celkweeksysteem. Elke passage ronde duurt ongeveer 70 minuten en genereert vier 1-well platen van een bovenliggende plaat, wat zich vertaalt naar een capaciteit van 20 passages in een dag.
De automatisering van het NGN2-differentiatieprotocol werd met succes uitgevoerd en maakte het mogelijk een homogene populatie van neuronale cellen over verschillende passages te genereren en vergelijkbaar met handmatige differentiaties. Bovendien zouden de experimentele kosten voor grootschalige screeningsstudies met meerdere cellijnen of screeningsexperimenten met duizenden testomstandigheden/verbindingen worden verlaagd als gevolg van snelle differentiaties. Kosteneffectieve en hoge doorvoer uitlezingen met inbegrip van live-cel neurite uitgroei metingen kunnen gemakkelijk worden ontwikkeld, geïmplementeerd en gebruikt als fenotypische uitlezingen voor ziekte modellering, zoals eerder aangetoond14,15,16. Zo hebben we verder aangepast de NGN2 protocol met behulp van kleine molecuul afgeleid neurale precursor (smNPC) cellen die constitutief over-express GFP. De smNPC-cellen bieden verdere voordelen, waaronder lagere kosten met cultuurmedia (een derde van de kosten met iPSC-cultuur) en tijd die nodig is om experimenten op te schalen. De celopbrengsten van smNPC zijn 7 tot 10 keer hoger dan die van iPSC. De differentiërende neuronen werden met succes gecontroleerd en afgebeeld voor meerdere dagen met behulp van een volledig geautomatiseerd beeldvormingsproces zonder de noodzaak van handmatige antilichaam vlekken of chemische etikettering, bespaart kosten en tijd die nodig zijn voor handmatige procedures met inbegrip van de beeldvorming zelf. De huidige beeldvorming van de binnenste 60 putten van een 96-put plaat duurt ongeveer 16 min per plaat wanneer 25 velden per put zijn afgebeeld, wat betekent dat de gegevens voor een imaging-gebaseerde screening voor 1000 verbindingen, kan worden verworven en geanalyseerd in een dag. In de toekomst, deze uitlezing kan worden gebruikt in samengestelde screening studies voor de redding van neurite uitgroei gebreken.
Verder tonen we ook de overdracht van een handmatig differentiatieprotocol voor het genereren van midbrain dopaminerge (mDA) neuronen uit iPSC. Deze kleine molecule-gebaseerde differentiatie protocol duurt 65 dagen en is arbeidsintensief vanwege de meerdere replating stappen en frequente media veranderingen, meestal om de 2 dagen, die de productie van mDA neuronen beperkt tot enkele iPSC lijnen op hetzelfde moment. Het geautomatiseerde mDA-differentiatieprotocol heeft als groot voordeel dat de differentiatie wordt opgeschaald naar tientallen iPSC-lijnen. Tot 30 cellijnen zouden parallel kunnen worden onderscheiden. Aangezien de differentiatie meestal gebaseerd is op veranderingen in de media, kan bijna het hele differentiatieproces worden uitgevoerd zonder menselijke inmenging. Met behulp van de agenda-gebaseerde planner van het geautomatiseerde systeem, kunnen we de media wijzigingen plannen op basis van de differentiatie stappen. Een beperking van het werken met zo'n groot aantal cellijnen en cultuurplaten was de onmogelijkheid om nachtelijke mediaveranderingen uit te voeren. De belangrijkste reden is het feit dat ons systeem is opgezet voor het gebruik van wegwerptips en het handmatig bijvullen van cultuurmedia waarbij een gebruiker in het laboratorium deze handmatige stap moet uitvoeren. Om het proces van mediaverandering te vergemakkelijken, werden platen die in het systeem werden geladen, toegewezen aan een project en gegroepeerd in batches. De batchgrootte werd vervolgens aangepast aan het aantal beschikbare wegwerptips en het volume van de beschikbare kweekmedia. Zoals hierboven besproken, kan deze beperking gemakkelijk worden overwonnen door de implementatie van herbruikbare / wasbare naalden en geautomatiseerde bijvullen van de media. Geautomatiseerd doorgeven/herberijzen van cellen, zoals aangetoond voor iPSC, is een van de gemakken aangeboden door onze geautomatiseerde cel cultuur systeem. We hebben getest de geautomatiseerde replating van mDA neuronen op dag 25 van differentiatie. Echter, de dissociatie van mDA neuronen vereist langere (40 min) incubatie met de dissociatie enzym dan iPSC (8 min) uitbreiding van de geautomatiseerde replating proces tot meer dan 1 h per cel lijnen. Als gevolg hiervan werd het geautomatiseerd herbewijden van 30 cellijnen op dezelfde dag onmogelijk. Het versnellen van andere stappen tijdens het geautomatiseerd herladen (transport van platen, pipetting) en het aanpassen van het systeem aan het gebruik van naalden en medialijn die een nachtelijk werk mogelijk maakt, zou deze beperking oplossen. Ondanks de nadelen konden we met succes het handmatige protocol overbrengen naar een geautomatiseerde differentiatie van mDA-neuronen die culturen produceren met aanzienlijke hoeveelheden MAP2 (neuron) en TH (mDA-neuronen) positieve cellen.
Het parallel onderscheiden van tientallen iPSC-cellijnen is van groot belang voor projecten die de moleculaire mechanismen van neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson, onderzoeken. Echter, om taken sneller te voltooien met minder fouten en tegen lagere kosten is een grote uitdaging. Door de automatisering van de hier gepresenteerde protocollen (iPSC, smNPC en mDA neuron), kunnen we de kosten versnellen, verlagen en de reproduceerbaarheid in onze projecten verhogen. De ontwikkeling van projecten zoals FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) met honderden patiëntcellijnen toont behoefte aan geautomatiseerde cultuur- en differentiatieprotocollen. Onze toekomstperspectieven omvatten de overdracht van handmatige 3-dimensionale (3D) celcultuurmodellen naar het geautomatiseerde systeem. Kleine aanpassingen in de plaatdefinitie-instellingen en het gebruik van adapters zullen het gebruik van commerciële of op maat gemaakte platen en microfluïde kamers die nodig zijn voor de 3D-culturen mogelijk maken. Bovendien zal de implementatie van een geautomatiseerd label-vrij beeldvormingsmodel ons in staat stellen om de neuronale groei in real-time te volgen en veranderingen in neurite-uitgroei, neuronorganisatie en celdood te vertalen naar een beter begrip van de ziektemechanismen.

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) zijn zelfvernieuwend en kunnen zich onderscheiden in bijna elk volwassen celtype. Deze kenmerken maken hiPSC een nuttig hulpmiddel voor ziektemodellering in fundamenteel onderzoek en medicijnontdekking1. Het menselijk iPSC behoudt de donorgenetische achtergrond die het mogelijk maakt ziekterelevante celtypen af te leiden die het meest worden aangetast/betrokken bij het ziekteverloop, bijvoorbeeld verschillende neuronale subtypen voor neurodegeneratieve ziekten2,3. Ook, hiPSC overwint een aantal van de beperkingen van dierlijke en cellulaire over-expressie modellen door het modelleren van ziekten in een menselijke context en fysiologische eiwit expressie niveaus, en hebben bewezen een waardevolle troef in het modelleren van ziekten, variërend van monogene, complexe en epigenetische aandoeningen, evenals late ziektes4.
Ondanks deze voordelen en mogelijkheden, verschillende beperkingen van hiPSC nog steeds moeten worden aangepakt. De huidige hiPSC cultuur- en differentiatieprotocollen zijn niet kosteneffectief, moeilijk te standaardiseren en arbeidsintensief. Handmatige cultuurstappen kunnen leiden tot een hoge variabiliteit in de opbrengsten en fenotypes als gevolg van verschillen in groei en spontane differentiatie van hiPSC. Daarom moet de variatie op experimenten worden verminderd door meer gestandaardiseerde verwerkingstechnieken te implementeren en protocollen te vereenvoudigen die met automatisering kunnen worden bereikt5. De invoering van geautomatiseerde hiPSC-cultuur- en differentiatieprotocollen zal gemeenschappelijke normen vaststellen voor zowel academische als industriële onderzoeksprojecten, en zal het mogelijk maken biologisch relevante ziektemodellen en meer reproduceerbare resultaten te genereren.
Eerder werk heeft geprobeerd automatisering van hiPSC culturen6,7,8, maar hun protocollen zijn beperkt tot specifieke cel cultuur plaat formaten afhankelijk van het systeem en gebrek aan aanpassingsvermogen aan verschillende test formaten. Dergelijke systemen zijn nuttig bij het ophopen van cellen, maar zijn mogelijk niet geschikt voor geautomatiseerde differentiatie in gewenste celtypen, ziektefenotypering en screeningsdoeleinden. Bovendien is een grootschalig geautomatiseerd platform voor fibroblast afleiding, hiPSC-generatie en -differentiatie beschreven9, maar op een schaal die alleen kan worden bereikt door laboratoria met een hoge doorvoer die zich toeleggen op de productie van lijnen die aantrekkelijk lijken, maar voor veel academische laboratoria onbetaalbaar kunnen zijn.
We ontwikkelden een volledig geautomatiseerd celkweeksysteem op basis van een vloeistofbehandelingsstation in een high-efficiency particulate air (HEPA)-gefilterde omgeving in combinatie met een CO2-incubator met grote capaciteit, een brightfield imaging cytometer en een robotarm voor plaattransport. Deze componenten vormen de basis voor stabiele en reproduceerbare hiPSC cultuur en differentiatie. We hebben het systeem aangevuld met een geautomatiseerd -20 °C opslagsysteem voor samengestelde of virusopslag en een high-speed draaiende schijfconfocale live-cel imager. Er werden op maat gemaakte protocollen gegenereerd die geautomatiseerde celzaaien, mediawijzigingen, samenvloeiingscontroles, celexpansie en het genereren van testplaats met monsterbehandeling en plaatbeeldvorming mogelijk maakten, waardoor het systeem compatibel is met screenings met een hoog inhoud/hoge doorvoer. Het geautomatiseerde celcultuur- en beeldverwerkingssysteem wordt bediend met behulp van de besturingssoftware en de op maat gemaakte grafische gebruikersinterface (GUI). Met de GUI kunnen gebruikers CSV-bestanden importeren die cellijnspecifieke parameters bevatten die nodig zijn voor de uitvoering van de methode. Bovendien maakt de GUI het mogelijk om tal van experimenten in elke reeks te plannen met behulp van de ingebouwde kalenderweergave, waardoor volledige controle over de tijd wanneer elke methode wordt gestart.
Ons geautomatiseerde celkweeksysteem maakt gebruik van gestandaardiseerde pipettingsnelheden, doorlooptijden, samenvloeiingsdrempels, zaaidichtheid en middelgrote volumes met de flexibiliteit om cellen te kweken in verschillende plaatformaten (96-, 48-, 24-, 12-, 6- of 1-well plaatformaat). We hebben een recent gepubliceerd protocol voor differentiatie op korte termijn aangepast voor het omzetten van hiPSC in neuronen die TUBB3-positieve neuronen kunnen opleveren in 6 dagen10,11. We hebben ook de geautomatiseerde differentiatie en beeldvorming van kleine molecuul neurale precursor cellen (smNPC) in neuronen constitutief uitdrukken GFP onder EF1a promotor12 en iPSC in midbrain dopaminergische (mDA) neuronen, aanpassing van een eerder gepubliceerde dual-SMAD remming protocol13 dat mDA neuronen levert binnen 65 dagen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287</td>
			<td>1 to 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Oct3/4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>1 to 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti- TUBB3</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>1 to 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-BRN2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-TH</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-74421</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei counterstaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechest 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1 to 8,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent TapeStation system</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>4200</td>
			<td>Automated electrophoresis 
			for DNA and RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated -20 &#176;C storage system</td>
			<td>Hamilton Storage 
			Technologies</td>
			<td>Sample Access Manager 
			(SAM -20C, 3200 series)</td>
			<td>Storage of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode reader</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>Barcode Reader Orbit</td>
			<td>Barcode scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield cell cytomat</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Confluence check and 
			cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Automated confocal 
			microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for cell cultures</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 24 C, CU</td>
			<td>12 stackers pitch 28 mm, 
			12 stackers pitch 23 mm 
			(total of 456 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for thawing samples</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 2-LIN, 60 DU 
			(Drying Unit)</td>
			<td>2 stackers pitch 28 mm 
			(total of 42 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Hood Flow Star UV</td>
			<td>Modified by Hamilton 
			Robotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling station</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Microlab Star</td>
			<td>Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml 
			and 96 Channel MPH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>188211APE</td>
			<td>Media/reagents reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water system</td>
			<td>Veolia Water</td>
			<td>ELGA PURELAB Classic</td>
			<td>Provides pure water for 
			needle wash station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Real-Time 
			PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>QSTUDIO12KOA</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Rackrunner</td>
			<td>Transport of plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turn table</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Turn Table</td>
			<td>Adjust plate orientiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterruptible power supply</td>
			<td>APC</td>
			<td>Smart UPS RT Unit, 
			10000 VA Power supply</td>
			<td>Backup power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO-pipettes</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4500</td>
			<td>Electronic pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4453545</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well culture plate (84 cm2)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td>Nunc OmniTray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates (9.6 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate (3.9 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate (0.32 cm2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005558</td>
			<td>CellCarrier-96 Black plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 50-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235987</td>
			<td>50-uL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 300-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235985</td>
			<td>300-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 1000-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235939</td>
			<td>1000-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 5-mL</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>184022</td>
			<td>5-mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 15-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>15-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 50-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>50-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene cryogenic 2.0 mL vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V5007</td>
			<td>Cryovials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_hEF1a_rtTA3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61472</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61474</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sequence (forward)</td>
			<td>Sequence (reverse)</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 (ID 4505967a1)</td>
			<td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td>
			<td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG (ID 153945815c3)</td>
			<td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td>
			<td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REX1 (ID 89179322c1)</td>
			<td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td>
			<td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2 (ID 87578393c1)</td>
			<td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>
			<td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN2 (ID 380254475c1)</td>
			<td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td>
			<td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUX2 (ID 291045458c2)</td>
			<td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td>
			<td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td>
			<td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td>
			<td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td>
			<td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td>
			<td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH</td>
			<td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td>
			<td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td>
			<td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Housekeeping genes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td>
			<td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAZ1</td>
			<td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td>
			<td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLPO</td>
			<td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td>
			<td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPL13A</td>
			<td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td>
			<td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Use concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 - 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC culture medium 
			(Essential 8 Flex medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - NGN2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.909 mL (50 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331093</td>
			<td>484.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL ( 2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>0.25 mL (2.5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - SRM medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.5 mL (55 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>409.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement 
			(serum replacement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>75 mL (15%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - N2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>475 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL(1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline (dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate 
			magnesium (AA2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>64 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic factor-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMA)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833-10MG</td>
			<td>0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>420220-10MG</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13197</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid (AA1)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189 (LDN)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11802</td>
			<td>100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (Purm)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Hedgehog/Shh (C24II) 
			N-Terminus (SHH)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1845-SH</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542 (SB)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13031</td>
			<td>10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor type &#223;3 
			(TGF&#223;3)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>243-B3</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10005583</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell dissociation reagent 
			(StemPro Accutase)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11575020</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation and cDNA kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Rneasy MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Trizol lysis buffer (RNA 
			lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080-085</td>
			<td>SuperScript III Reverse 
			Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Framework (CCF) 
			(Graphical user interface, GUI)</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>User interface for the automated system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellPathFinder software 
			(image analysis software 1)</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellPathfinder HCS Software</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager Measurement System</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>Included with 
			CellVoyager 7000</td>
			<td>Microscope controlling 
			software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus software 
			(image analysis software 2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloud based qPCR app</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Themo Fisher cloud</td>
			<td>Analysis software for 
			qRT-PCR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus software</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>VENUS Two Dynamic 
			Schedular 5.1 Software</td>
			<td>Controlling software for the 
			automated system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring

Handmatige cultuur en differentiatie protocollen voor de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) zijn moeilijk te standaardiseren, tonen een hoge variabiliteit en zijn gevoelig voor spontane differentiatie in ongewenste celtypes. De methoden zijn arbeidsintensief en zijn niet gemakkelijk vatbaar voor grootschalige experimenten. Om deze beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we een geautomatiseerd celkweeksysteem gekoppeld aan een beeldvormingssysteem met hoge doorvoer en implementeerden we protocollen voor het onderhouden van meerdere hiPSC-lijnen in parallelle en neuronale differentiatie. We beschrijven de automatisering van een korte-termijn differentiatie protocol met behulp van Neurogenin-2 (NGN2) over-expressie om hiPSC-afgeleide corticale neuronen te produceren binnen 6\u20128 dagen, en de uitvoering van een lange termijn differentiatie protocol om hiPSC-afgeleide midbrain dopaminergische (mDA) neuronen te genereren binnen 65 dagen. Ook hebben we de NGN2-benadering toegepast op een kleine molecuul-afgeleide neurale precursorcellen (smNPC) die met GFP lentivirus werden getransduced en een live-cel geautomatiseerde neuriet-uitgroeitesten hebben vastgesteld. We presenteren een geautomatiseerd systeem met protocollen die geschikt zijn voor routinematige hiPSC-cultuur en differentiatie in corticale en dopaminerge neuronen. Ons platform is geschikt voor lange termijn hands-free cultuur en high-content / high-throughput hiPSC-gebaseerde compound, RNAi en CRISPR / Cas9 screenings om nieuwe ziekte mechanismen en drug doelen te identificeren.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

We tonen de automatisering van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcelculturen (hiPSC) culturen en neuronale differentiaties die compatibel zijn met geautomatiseerde beeldvorming en analyse.

Geautomatiseerde productie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale en dopaminerge neuronen met geïntegreerde live-cel monitoring

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Het algemene doel van deze studie is om te laten zien hoe geautomatiseerde procedures voor het kweken en differentiëren van menselijke IPS-cellen in neuronale afstammingen, evenals hun geautomatiseerde beeldvorming te implementeren. Gestandaardiseerde geautomatiseerde procedures zorgen voor een lage experimentele variatie en zorgen tegelijkertijd voor een hoge fenotypische reproduceerbaarheid. Bovendien kan het systeem worden aangepast voor de ontwikkeling van nieuwe protocollen.Het aantonen van de procedures zijn Joachim Tager en Elisangela Bressan, post-docs van ons lab. Klik in de grafische gebruikersinterface van het geautomatiseerde systeem op de procesweergave van het resource-instrument en selecteer het resourceinstrumentproces. Klik op instrumentproces uitvoeren en voer de run HEPA-kap en herlaadprocessen uit.Selecteer de te laden resources, open de deur en laad de celkweekplaten en wegwerptips in de juiste posities, zoals aangegeven door de pop-upafbeeldingen. Ontsmet vervolgens de deur met 70% ethanol voor het sluiten en voer het ontsmettingsproces uit. Het systeem wordt gedurende 30 minuten gesteriliseerd door UV-straling.Om de platen te laden met cultuur medium of dissociatie reagens, voer de run HEPA kap stap en open de deur van de vloeistof handling station. Na ontsmetting met 70% ethanol, plaats de reservoirs op het dek naar de toegewezen positie en de-deksel hen. Sluit de deur van het vloeistofbehandelingsstation en voer vervolgens het InitHepaHood resource instrument proces uit om de HEPA-kap uit te drijven.Als u een geautomatiseerde cultuurmethode wilt uitvoeren, klikt u in de agendaweergave van de grafische gebruikersinterface op processtap toevoegen en selecteert u de celregel die in het experiment moet worden gebruikt. Gebruik de wizard om het project te selecteren en de te gebruiken batch te markeren. Klik op de pijlpunt rechts en navigeer naar de volgende pagina van de wizard om de processtap te selecteren die moet worden uitgevoerd.Plan op de laatste pagina van de wizard het experiment en stel de juiste parameters in die nodig zijn voor het uitvoeren van de methode. Klik vervolgens op OK. Na het laden van een 50 milliliter buis met de menselijke IPS cel suspensie, laden gecoate kweekplaten voor het ontvangen van de cellen op de plank en het zaaien van platen uit buizen methode uit te voeren. Om de cellen in de Brightfield imaging cytometer te tellen, bereid je automatisch een 384-goed telplaat met celophang op het dek voor en gebruik je de robotarm om de 384-goed tellende plaat van het dek naar de Brightfield imaging cytometer over te brengen.Na het tellen brengt het systeem de plaat terug naar zijn oorspronkelijke positie en brengt het een gecoate kweek- of testplaat van de plank naar het pipetdek. Het systeem zal dan zaad van de cellen in de gebruiker gedefinieerde aantal en volumes die geschikt zijn voor de plaat en mix door pipetting. Na het zaaien wordt de plaat gedurende 10 seconden bij 500 omwentelingen per minuut naar de schudmachine op het dek verplaatst voor celdistributie voordat deze naar de koolstofdioxide-incubator wordt overgebracht.Als u de geautomatiseerde samenvloeiing wilt beoordelen, voert u de methode voor de controlevloeivloeiing uit en selecteert u een batch die ten minste één kweekplaat en geen testplaten bevat. Voer in de sectie parametersdetails iPSCf_2020 in voor het verwerven van afbeeldingen in de instellingen voor beeldanalyse. Het systeem zal dan de overdracht van de eerste plaat van de incubator naar de Brightfield imaging cytometer en beeld van de cel samenvloeiing.Als u de celcultuur of de testplaatmedia wilt veranderen, voert u de methode cultuurplaats in de media uit en selecteert u een batch met alleen kweekplaten. Het systeem brengt de platen over naar het dek en kantelt de platen om aspiratie van de supernatant mogelijk te maken. De supernatant wordt naar de afvalinzamelingsmodule gegooid en de tips weggegooid en aan elke plaat worden 12 milliliter vers medium toegevoegd.Het systeem zal dan opnieuw deksel van de platen en de platen terug te keren naar de cel cultuur incubator. Als alternatief, om medium van testplaten te veranderen, voer media verandering van testplaten methode. Als u de cellen subcultiveert, voert u de subteelt van de methode van aanhangende cellen uit en selecteert u de batch met de kweekplaten die subteelt nodig hebben.Na het weggooien van het medium, zal het systeem de cellen een keer wassen met acht milliliter PBS per plaat voordat het acht milliliter van 0,5 millimolar EDTA aan de cellen toevoegt. Na acht minuten op het dek met kanteloptie wordt de EDTA vervangen door 12 milliliter vers medium per plaat. Het systeem zal de platen schudden op 2.000 omwentelingen per minuut gedurende een minuut om de kolonies los te maken voordat de cellen tritureren met vijf cycli van pipet om de kolonies op te splitsen in 50 tot 80 micron klonters.De cellen worden vervolgens overgebracht naar een buis van 50 milliliter op het dek voordat ze in een één-op-zeven-gesplitste verhouding worden ingezaaid. Voor geautomatiseerd hoog gehalte, hoge doorvoercelbeeldvorming, voert u de beeldvormingsmethode uit en selecteert u een batch die ten minste één testplaat en geen kweekplaten bevat. Het systeem zal dan een testplaat overbrengen naar de geautomatiseerde confocale microscoop voor beeldvorming.Zorg ervoor dat u de juiste batch- en plaat-id's selecteert tijdens het uitvoeren van de vereiste processtappen. De hiPSC culturen moeten dagelijks worden gecontroleerd op groei en geanalyseerd voor hun percentage van samenvloeiing in de Brightfield imaging cytometer. Na het doorgeven en handmatige of geautomatiseerde systeemcultuur vertonen de cellen een typische stamcel- en pluripotentiemarkeringsexpressie.Neuronen gedifferentieerd in het geautomatiseerde cultuursysteem tonen een vergelijkbare morfologie en neuronale netwerkorganisatie aan neuronen die handmatig worden gecultiveerd. Na zes dagen van differentiatie zijn automatisch gedifferentieerde corticale neuronen positief voor neuron-specifieke klasse III bèta-tubuline en bovenste corticale laagmarkeringsexpressie. Na acht dagen, de cellen ook uitgedrukt microtubuli-geassocieerde eiwit 2, de neurale cel hechting molecuul, en synapsine I, evenals corticale neuron markers.Zeer lage of geen expressie van deze markers wordt waargenomen in hiPSC. Dit systeem kan ook worden gebruikt om een live cel geautomatiseerde neurite uitgroei test die het mogelijk maakt neurotische lengtes worden gemeten over 11 dagen van differentiatie vast te stellen zonder handmatige tussenkomst. Met behulp van de geautomatiseerde cultuur systeem om middelgrote veranderingen uit te voeren over een 65-daagse cultuurperiode vergemakkelijkt hiPSC differentiatie in midbrain dopaminerge neuronen met de verwachte cellulaire organisatie en morfologie.Naast de neurite uitgroei, andere geautomatiseerde fenotypische testen die relevant zijn voor het bestuderen van neurodegeneratie, bijvoorbeeld, TDP-43 translocatie RNA foci en alpha-synuclein fibril opname, kan worden onderzocht met behulp van deze hoge doorvoer, hoge inhoud formaat.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van menselijke fibroblasten herprogrammeren met de Stemgent Human TF lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfecteren en Nucleofecting Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...