Name: automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Die Autoren würdigen die Patienten und ihre Familien, die Biomaterial für diese Studie beigesteuert haben. Die in der Studie verwendeten Zelllinien stammten aus der NINDS-Sammlung mit Rutgers (ND41865 als iPS-Nr.) und dem Labor von Dr. Tilo Kunath (iPS-2). Diese Arbeit wird zum Teil von der NOMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, einem Gemeinsamen EU-Programm - Neurodegenerative Disease Research (JPND) (PH); Die Initiative DZNE I2A (AD); PD-Strat, ein von ERA-Net ERACoSysMed gefördertes Projekt (PH) und die Foundational Data Initiative for Parkinson es Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD ist Teil des PATH to PD-Programms der Michael J. Fox Foundation. Die Autoren danken Steven Finkbeiner und Melanie Cobb (Gladstone Institutes) für ihren Beitrag zur Einrichtung des manuellen mDA Neuron Differenzierungsprotokolls und Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) für die Unterstützung bei der Einrichtung der Neuriten-Auswuchsanalyse.

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	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases.">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li><li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease.">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li><li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions.">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647 (2015).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System.">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+derivation,+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li><li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells.">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling.">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PloS one. 8 (3), 59252 (2013).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li><li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology,+autophagy,+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons.">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death &amp; disease. 6, 1811 (2015).</li><li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2++Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation.">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li><li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Huntington's+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics,+Morphology,+and+Maturation.">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimerBank:+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification.">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, 792 (2010).</li></ol>

Wir haben nichts zu verraten.

Wir führen ein automatisiertes Zellkultursystem mit integrierten Bildgebungsfunktionen zur Standardisierung der HiPSC-Kultur und neuronalen Differenzierung ein. Aufgrund der minimalen Benutzerintervention ist die experimentelle Variation gering, um die Reproduzierbarkeit zellulärer Phänotypen während der Differenzierung zu gewährleisten. Der kalenderbasierte Scheduler unterstützt die Organisation und Parallelisierung von Experimenten und ermöglicht ein hohes Maß an Flexibilität, zu dem die Experimente durchgeführt werden. Bestehende Methoden können leicht angepasst und das Spektrum der verfügbaren Methoden erweitert werden. Darüber hinaus kann eine große Anzahl von Assay-Plattenformaten verwendet werden, um die Flexibilität dieses Systems zu erhöhen. Das Minimale System bestehend aus einem CO2-Inkubator, einem Roboterarm, einem Hellfeldzellzytometer und einer Flüssigkeitsbehandlungsstation bildet die Basiseinheit, die für die HiPSC-Kultur und Differenzierung benötigt wird, mit erschwinglichen Kosten für akademische Forschungslabors. Die Kombination des automatisierten Zellkultursystems mit einem automatisierten -20 °C-Speichersystem zur Lagerung von Compounds, RNAi-Bibliotheken oder CRISPR/Cas9-Bibliotheken sowie die Integration eines hochklassigen/hochdurchsatzfähigen Mikroskops ermöglichen die Durchführung von phänotypischen Screenings.
In der aktuellen Studie nutzte das automatisierte Zellkultursystem Einwegspitzen und die Kulturmedien wurden manuell in das Reservoir aufgefüllt, wodurch der Einsatz der Flüssigkeitsabfertigungsstation für Medienveränderungen und andere Kulturprozesse vor allem über Nacht eingeschränkt wurde. Um diese Einschränkung zu umgehen, können die Methoden anstelle von Einwegspitzen an den Nadeleinsatz angepasst werden, und nach der Installation von Rohrverbindungen zwischen Medienleitungen und mediengelagerten Medienbeuteln können Medienbehälter automatisch mit Frischmedien aufgefüllt werden, die mit Heizelementen vorgewärmt werden. Dies würde Benutzerstörungen reduzieren, die durch das manuelle Nachfüllen von Tipps, Kulturmedien und Reservoiraustausch verursacht werden.
Unser automatisiertes Zellkultursystem bietet mehrere Vorteile. Eines davon ist das Barcode-Tracking-System. Die im System geladenen Platten werden durch einen eindeutigen Barcode identifiziert, der vom System gelesen und gespeichert wird, so dass Proben während und nach der Ausführung der Methode nachverfolgt werden können. Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit, nutzerspezifische Projekte zu erstellen. Hier können im System geladene Kulturplatten einem bestimmten Projekt zugeordnet und in Batches gruppiert werden. Die Strukturierung in Chargen vereinfacht die Ausführung des gleichen Verfahrens auf alle Platten einer bestimmten Charge, da keine einzelnen Platten ausgewählt werden müssen. Zusätzlich ermöglicht ein Flüssigkeitsklassen-Editor die Einstellung der Pipettiergeschwindigkeit und -höhe sowie der Aspirations- und Dosierparameter für jeden Flüssigkeitstransferschritt. Jeder Prozess wird in Protokolldateien dokumentiert, so dass nachverfolgt werden kann, welche Aufgaben für eine bestimmte Kultur oder Assayplatte ausgeführt wurden.
Neuronen und andere Zelltypen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeleitet werden, sind nützliche In-vitro-Werkzeuge zur Untersuchung der Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen in bestimmten Patientenpopulationen (z. B. dopaminerge Neuronen für Parkinson-Erkrankungen), die die Möglichkeit für personalisierte Arzneimittelscreenings bieten. Das Culturing hiPSC ist sehr zeitintensiv und erfordert geschulte Mitarbeiter, komplexe Differenzierungsprotokolle auszuführen, die in der Regel auf die Produktion in geringem Maßstab beschränkt sind. Wir passten die feederfreie Kultur von hiPSC an eine automatisierte Kultur an und implementierten zwei neuronale Differenzierungsprotokolle, ein schnelles kortikales Neuronendifferenzierungsprotokoll auf Basis der NGN2-Überexpression unter einem Tet-on-Promotor10,11, und ein langfristiges, auf kleinem Molekül basierendes Protokoll zur Erzeugung von mittelhirndopaminergen (mDA) Neuronen13. Die einfache Übertragung und Reproduzierbarkeit manueller Kultur- und Differenzierungsprotokolle macht das automatisierte Kultursystem sehr nützlich. Human es iPSC, das im automatisierten Zellkultursystem kultiviert wurde, zeigte eine konsistente Stammzellmorphologie und exprimierte wichtige Pluripotenzmarker, die zwischen unabhängigen Experimenten reproduzierbar waren. Darüber hinaus begünstigte die Automatisierung des hiPSC-Kulturprotokolls die Kultur und Erweiterung einer größeren Anzahl von Zelllinien parallel. Automatisierte Konfluenzprüfungen, die über Nacht durchgeführt werden sollen, sparen Zeit, so dass das System tagsüber für nachgelagerte Prozessschritte frei bleibt, die im Labor durchgeführt werden (z. B. Ernte von Zellen oder manuelles Replatieren für Differenzierungen). Bei Erreichen des benutzerdefinierten Zusammenflussschwellenwerts werden Zellen durchdrungen und in extrazelluläre Matrix-beschichtete Platten auf dem Stapler des automatisierten Zellkultursystems wieder aufgelegt. Jede Passage runde dauert etwa 70 min und erzeugt vier 1-Well-Platten aus einer Elternplatte, was zu einer Kapazität von 20 Passagen an einem Tag führt.
Die Automatisierung des NGN2-Differenzierungsprotokolls wurde erfolgreich durchgeführt und ermöglichte die Erzeugung einer homogenen Population neuronaler Zellen über verschiedene Passagen hinweg und vergleichbar mit manuellen Differenzierungen. Darüber hinaus würden die experimentellen Kosten für groß angelegte Screening-Studien mit mehreren Zelllinien oder Screening-Experimente mit Tausenden von Testbedingungen/-verbindungen durch schnelle Differenzierungen gesenkt. Kostengünstige und hochdurchsatzhohe Auslesungen einschließlich Live-Zell-Neuriten-Auswuchsmessungen können einfach entwickelt, implementiert und als phäotypische Auslesungen für die Krankheitsmodellierung verwendet werden, wie zuvorgezeigt 14,15,16. So haben wir das NGN2-Protokoll mit kleinen molekülabgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen (smNPC) weiter angepasst, die konstitutiv GFP überexprimieren. Die smNPC-Zellen bieten weitere Vorteile, darunter reduzierte Kosten mit Kulturmedien (ein Drittel der Kosten mit iPSC-Kultur) und Zeit, die für die Skalierung von Experimenten benötigt wird. Die Zellausbeute von smNPC ist 7 bis 10 Mal höher als die mit iPSC erhaltenen. Die differenzierenden Neuronen wurden erfolgreich überwacht und mehrere Tage lang mit einem vollautomatischen Bildgebungsverfahren ohne manuelle Antikörperfärbung oder chemische Kennzeichnung abgeglichen, was Kosten und Zeit für manuelle Verfahren, einschließlich der Bildgebung selbst, spart. Die aktuelle Abbildung von inneren 60 Brunnen einer 96-Well-Platte dauert etwa 16 min pro Platte, wenn 25 Felder pro Brunnen abgebildet sind, was bedeutet, dass die Daten für ein bildgebendes Screening für 1000 Verbindungen an einem Tag erfasst und analysiert werden könnten. In Zukunft könnte diese Auslesung in zusammengesetzten Screening-Studien zur Rettung von Neuriten-Auswuchsdefekten verwendet werden.
Darüber hinaus zeigen wir auch die Übertragung eines manuellen Differenzierungsprotokolls zur Erzeugung von mittelhirndopaminergen (mDA) Neuronen aus iPSC. Dieses kleine molekülbasierte Differenzierungsprotokoll dauert 65 Tage und ist arbeitsintensiv wegen der mehrfachen Replatierungsschritte und häufigen Medienveränderungen, meist alle 2 Tage, was die Produktion von mDA-Neuronen auf wenige iPSC-Linien gleichzeitig beschränkt. Das automatisierte mDA-Differenzierungsprotokoll hat den großen Vorteil, dass die Differenzierung auf Dutzende von iPSC-Leitungen skaliert wird. Bis zu 30 Zelllinien könnten parallel unterschieden werden. Da die Differenzierung meist auf Medienveränderungen beruht, kann fast der gesamte Differenzierungsprozess ohne menschliche Eingriffe durchgeführt werden. Mit dem kalenderbasierten Scheduler des automatisierten Systems konnten wir die Medienänderungen entsprechend den Differenzierungsschritten planen. Eine Einschränkung der Arbeit mit einer so großen Anzahl von Zelllinien und Kulturplatten war die Unmöglichkeit, über Nacht Medienwechsel durchzuführen. Der Hauptgrund ist die Tatsache, dass unser System für die Verwendung von Einweg-Tipps und manuelle nachfüllen von Kulturmedien eingerichtet ist, die einen Benutzer im Labor benötigen, um diesen manuellen Schritt auszuführen. Um den Medienwechselprozess zu erleichtern, wurden im System geladene Platten einem Projekt zugeordnet und in Batches gruppiert. Die Chargengröße wurde dann an die Anzahl der Verfügbaren Einwegtipps und das Volumen der Kulturmedien angepasst. Wie bereits erwähnt, kann diese Einschränkung durch die Implementierung von wiederverwendbaren/waschbaren Nadeln und das automatisierte Nachfüllen von Medien leicht überwunden werden. Die automatisierte Passage/Replating von Zellen, wie für iPSC gezeigt, ist einer der Annehmlichkeiten, die unser automatisiertes Zellkultursystem bietet. Wir haben die automatisierte Replatierung von mDA-Neuronen am 25. Tag der Differenzierung getestet. Die Dissoziation von mDA-Neuronen erfordert jedoch eine längere (40 min) Inkubation mit dem Dissoziationsenzym als iPSC (8 min), wodurch der automatisierte Replating-Prozess auf mehr als 1 h pro Zelllinien verlängert wird. Infolgedessen wurde die automatische Replatierung von 30 Zelllinien am selben Tag unmöglich. Die Beschleunigung anderer Schritte beim automatisierten Replatieren (Transport von Platten, Pipettierung) und Anpassung des Systems an den Einsatz von Nadeln und Medienlinie, die eine Nachtarbeit ermöglicht, würde diese Einschränkung beheben. Trotz der Nachteile konnten wir das manuelle Protokoll erfolgreich auf eine automatisierte Differenzierung von mDA-Neuronen übertragen, die Kulturen mit erheblichen Mengen an MAP2 (Neuron) und TH (mDA Neuronen) positiven Zellen produzieren.
Die parallele Differenzierung Dutzender iPSC-Zelllinien ist von großem Interesse in Projekten, die die molekularen Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen, einschließlich der Parkinson-Krankheit, untersuchen. Es ist jedoch eine große Herausforderung, Aufgaben schneller mit weniger Fehlern und geringeren Kosten zu erledigen. Durch die Automatisierung der hier vorgestellten Protokolle (iPSC, smNPC und mDA neuron) konnten wir die Reproduzierbarkeit in unseren Projekten beschleunigen, reduzieren und die Reproduzierbarkeit erhöhen. Die Entwicklung von Projekten wie FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) mit Hunderten von Patientenzelllinien zeigt den Bedarf an automatisierten Kultur- und Differenzierungsprotokollen. Zu unseren Zukunftsperspektiven gehört die Übertragung manueller dreidimensionaler (3D) Zellkulturmodelle auf das automatisierte System. Geringfügige Anpassungen in den Plattendefinitionseinstellungen und die Verwendung von Adaptern ermöglichen die Verwendung von kommerziellen oder kundenspezifischen Platten und mikrofluidischen Kammern, die für die 3D-Kulturen erforderlich sind. Darüber hinaus wird die Implementierung eines automatisierten etikettenfreien Bildgebungsmodells es uns ermöglichen, das neuronale Wachstum in Echtzeit zu verfolgen und Veränderungen des Neuritenauswüchses, der Neuronenorganisation und des Zelltodes in ein besseres Verständnis der Krankheitsmechanismen zu übersetzen.

Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) sind sich selbst erneuernd und können sich in fast jedem adulten Zelltyp unterscheiden. Diese Eigenschaften machen hiPSC zu einem nützlichen Werkzeug für die Krankheitsmodellierung in der Grundlagenforschung und Arzneimittelentdeckung1. Human es psPSC behält den genetischen Hintergrund des Spenders bei, der die Ableitung krankheitsrelevanter Zelltypen ermöglicht, die am stärksten am Krankheitsverlauf betroffen sind/beteiligt sind, z. B. verschiedene neuronale Subtypen für neurodegenerative Erkrankungen2,3. Außerdem überwindet hiPSC einige der Grenzen tierischer und zellulärer Überexpressionsmodelle, indem es Krankheiten in einem menschlichen Kontext und physiologische Proteinexpressionsniveaus modelliert, und hat sich als wertvoller Vorteil bei der Modellierung von Krankheiten erwiesen, die von monogenen, komplexen und epigenetischen Erkrankungen bis hin zu spät auftretenden Krankheitenreichen 4.
Trotz dieser Vorteile und Möglichkeiten müssen noch einige Einschränkungen von hiPSC angegangen werden. Aktuelle hiPSC-Kultur- und Differenzierungsprotokolle sind nicht kosteneffektiv, schwer zu standardisieren und arbeitsintensiv. Manuelle Kulturschritte können aufgrund von Wachstumsunterschieden und spontaner Differenzierung von hiPSC zu einer hohen Variabilität der Erträge und Phänotypen führen. Daher müssen experimentierabhängige Variationen durch die Implementierung standardisierterer Handhabungstechniken und die Vereinfachung von Protokollen reduziert werden, die mit DerAutomation erreicht werden können5. Die Einführung automatisierter hiPSC-Kultur- und Differenzierungsprotokolle wird gemeinsame Standards für akademische und industrielle Forschungsprojekte festlegen und die Erstellung biologisch relevanter Krankheitsmodelle und reproduzierbarerer Ergebnisse ermöglichen.
Frühere Arbeiten haben versucht, die hiPSC Kulturen6,7,8 zu sanieren, aber ihre Protokolle wurden auf bestimmte Zellkulturplattenformate beschränkt, die vom System abhängig sind und nicht an verschiedene Assay-Formate angepasst sind. Solche Systeme sind nützlich bei der Füllstoffung von Zellen, aber möglicherweise nicht geeignet für die automatisierte Differenzierung in gewünschte Zelltypen, Krankheit Sphänotypisierung, und Screening-Zwecke. Darüber hinaus wurde eine groß angelegte automatisierte Plattform für Dieivation, hiPSC-Generierung und Differenzierung beschrieben9, aber in einem Maßstab, der nur durch Hochdurchsatzlabore erreicht werden kann, die sich der Herstellung von Linien widmen, die attraktiv erscheinen, aber für viele akademische Laboratorien unerschwinglich sein können.
Wir entwickelten ein vollautomatisches Zellkultursystem auf Basis einer Flüssigkeitsumschlagsstation in einer HOCHeffizienten Partikelluft (HEPA)-gefilterten Umgebung in Verbindung mit einem großflästigen CO2-Inkubator, einem Hellfeld-Bildzytometer und einem Roboterarm für den Plattentransport. Diese Komponenten bilden die Grundlage für eine stabile und reproduzierbare HiPSC-Kultur und Differenzierung. Ergänzt haben wir das System durch ein automatisiertes -20 °C-Speichersystem für die Compound- oder Virenspeicherung und eine hochgeschwindigkeits-Spinnscheibe konfokale Live-Zell-Imager. Es wurden maßgeschneiderte Protokolle erstellt, die automatisiertes Zellsäen, Medienwechsel, Konfluenzprüfungen, Zellerweiterung und Diessayplattengenerierung mit Probenbehandlung und Plattenbildgebung ermöglichen, wodurch das System mit Hochgehalts-/Hochdurchsatz-Screenings kompatibel ist. Das automatisierte Zellkultur- und Bildgebungssystem wird über die Steuerungssoftware und die maßgeschneiderte grafische Benutzeroberfläche (GUI) betrieben. Die GUI ermöglicht es Benutzern, CSV-Dateien zu importieren, die zelllinienspezifische Parameter enthalten, die für die Methodenausführung erforderlich sind. Darüber hinaus ermöglicht die GUI die Planung zahlreicher Experimente in beliebiger Reihenfolge mithilfe der integrierten Kalenderansicht, wodurch die volle Kontrolle über die Zeit ermöglicht wird, zu der jede Methode gestartet wird.
Unser automatisiertes Zellkultursystem verwendet standardisierte Pipettiergeschwindigkeiten, Passaging-Zeiten, Konfluenzschwellen, Sädichten und mittlere Volumina mit der Flexibilität, Zellen in einer Vielzahl von Plattenformaten (96-, 48-, 24-, 12-, 6- oder 1-Well-Plattenformat) zu befestigen. Wir haben ein kürzlich veröffentlichtes Kurzzeitdifferenzierungsprotokoll zur Umwandlung von HiPSC in Neuronen angepasst, die TUBB3-positive Neuronen in 6 Tagen10,11ergeben können. Wir etablierten auch die automatisierte Differenzierung und Bildgebung von kleinen neuronalen Vorläuferzellen (smNPC) in Neuronen, die GFP unter EF1a-Promotor12 und iPSC konstitutiv in mittelhirndopaminergen (mDA) Neuronen exzieren, und adaptieren ein zuvor veröffentlichtes Dual-SMAD-Hemmungsprotokoll13, das innerhalb von 65 Tagen mDA-Neuronen ergibt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287</td>
			<td>1 to 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Oct3/4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>1 to 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti- TUBB3</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>1 to 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-BRN2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-TH</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-74421</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei counterstaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechest 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1 to 8,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent TapeStation system</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>4200</td>
			<td>Automated electrophoresis 
			for DNA and RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated -20 &#176;C storage system</td>
			<td>Hamilton Storage 
			Technologies</td>
			<td>Sample Access Manager 
			(SAM -20C, 3200 series)</td>
			<td>Storage of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode reader</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>Barcode Reader Orbit</td>
			<td>Barcode scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield cell cytomat</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Confluence check and 
			cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Automated confocal 
			microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for cell cultures</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 24 C, CU</td>
			<td>12 stackers pitch 28 mm, 
			12 stackers pitch 23 mm 
			(total of 456 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for thawing samples</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 2-LIN, 60 DU 
			(Drying Unit)</td>
			<td>2 stackers pitch 28 mm 
			(total of 42 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Hood Flow Star UV</td>
			<td>Modified by Hamilton 
			Robotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling station</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Microlab Star</td>
			<td>Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml 
			and 96 Channel MPH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>188211APE</td>
			<td>Media/reagents reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water system</td>
			<td>Veolia Water</td>
			<td>ELGA PURELAB Classic</td>
			<td>Provides pure water for 
			needle wash station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Real-Time 
			PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>QSTUDIO12KOA</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Rackrunner</td>
			<td>Transport of plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turn table</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Turn Table</td>
			<td>Adjust plate orientiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterruptible power supply</td>
			<td>APC</td>
			<td>Smart UPS RT Unit, 
			10000 VA Power supply</td>
			<td>Backup power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO-pipettes</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4500</td>
			<td>Electronic pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4453545</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well culture plate (84 cm2)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td>Nunc OmniTray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates (9.6 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate (3.9 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate (0.32 cm2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005558</td>
			<td>CellCarrier-96 Black plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 50-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235987</td>
			<td>50-uL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 300-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235985</td>
			<td>300-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 1000-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235939</td>
			<td>1000-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 5-mL</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>184022</td>
			<td>5-mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 15-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>15-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 50-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>50-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene cryogenic 2.0 mL vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V5007</td>
			<td>Cryovials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_hEF1a_rtTA3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61472</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61474</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sequence (forward)</td>
			<td>Sequence (reverse)</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 (ID 4505967a1)</td>
			<td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td>
			<td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG (ID 153945815c3)</td>
			<td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td>
			<td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REX1 (ID 89179322c1)</td>
			<td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td>
			<td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2 (ID 87578393c1)</td>
			<td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>
			<td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN2 (ID 380254475c1)</td>
			<td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td>
			<td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUX2 (ID 291045458c2)</td>
			<td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td>
			<td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td>
			<td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td>
			<td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td>
			<td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td>
			<td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH</td>
			<td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td>
			<td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td>
			<td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Housekeeping genes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td>
			<td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAZ1</td>
			<td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td>
			<td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLPO</td>
			<td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td>
			<td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPL13A</td>
			<td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td>
			<td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Use concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 - 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC culture medium 
			(Essential 8 Flex medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - NGN2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.909 mL (50 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331093</td>
			<td>484.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL ( 2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>0.25 mL (2.5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - SRM medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.5 mL (55 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>409.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement 
			(serum replacement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>75 mL (15%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - N2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>475 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL(1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline (dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate 
			magnesium (AA2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>64 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic factor-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMA)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833-10MG</td>
			<td>0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>420220-10MG</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13197</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid (AA1)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189 (LDN)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11802</td>
			<td>100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (Purm)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Hedgehog/Shh (C24II) 
			N-Terminus (SHH)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1845-SH</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542 (SB)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13031</td>
			<td>10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor type &#223;3 
			(TGF&#223;3)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>243-B3</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10005583</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell dissociation reagent 
			(StemPro Accutase)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11575020</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation and cDNA kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Rneasy MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Trizol lysis buffer (RNA 
			lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080-085</td>
			<td>SuperScript III Reverse 
			Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Framework (CCF) 
			(Graphical user interface, GUI)</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>User interface for the automated system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellPathFinder software 
			(image analysis software 1)</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellPathfinder HCS Software</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager Measurement System</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>Included with 
			CellVoyager 7000</td>
			<td>Microscope controlling 
			software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus software 
			(image analysis software 2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloud based qPCR app</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Themo Fisher cloud</td>
			<td>Analysis software for 
			qRT-PCR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus software</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>VENUS Two Dynamic 
			Schedular 5.1 Software</td>
			<td>Controlling software for the 
			automated system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring

Manuelle Kultur- und Differenzierungsprotokolle für humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC) sind schwer zu standardisieren, weisen eine hohe Variabilität auf und neigen zu spontaner Differenzierung in unerwünschte Zelltypen. Die Methoden sind arbeitsintensiv und nicht leicht für groß angelegte Experimente geeignet. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir ein automatisiertes Zellkultursystem, das an ein Bildgebungssystem mit hohem Durchsatz gekoppelt ist, und implementierten Protokolle zur Aufrechterhaltung mehrerer hiPSC-Leitungen in paralleler und neuronaler Differenzierung. Wir beschreiben die Automatisierung eines kurzfristigen Differenzierungsprotokolls mit Neurogenin-2 (NGN2) Überexpression, um innerhalb von 6-u20128 Tagen von hiPSC abgeleitete kortikale Neuronen zu erzeugen, und die Implementierung eines Langzeitdifferenzierungsprotokolls zur Erzeugung von hiPSC-abgeleiteten Midbrain-Neuronen (mDA) innerhalb von 65 Tagen. Außerdem haben wir den NGN2-Ansatz auf einen kleinen molekülabgeleiteten neuronalen Vorläuferzellen (smNPC) angewendet, der mit dem GFP-Lentivirus transduziert wurde, und einen automatisierten Neuriten-Auswuchs-Assay mit Live-Zell etabliert. Wir präsentieren ein automatisiertes System mit Protokollen, die für die routinemäßige hiPSC-Kultur und Differenzierung in kortikale und dopaminerge Neuronen geeignet sind. Unsere Plattform eignet sich für langfristige Freisprechkultur und High-Content/High-Throughput-HiPSC-basierte Verbindung, RNAi und CRISPR/Cas9 Screenings, um neuartige Krankheitsmechanismen und Arzneimittelziele zu identifizieren.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Wir zeigen die Automatisierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellkulturen (hiPSC) und neuronalen Differenzierungen, die mit automatisierter Bildgebung und Analyse kompatibel sind.

Automatisierte Produktion von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten kortikalen und dopaminergen Neuronen mit integrierter Live-Zell-Überwachung

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Das übergeordnete Ziel dieser Studie ist es, zu zeigen, wie automatisierte Verfahren zur Kultivierung und Differenzierung menschlicher IPS-Zellen in neuronale Abstammungen sowie deren automatisierte Bildgebung implementiert werden können. Standardisierte automatisierte Verfahren ermöglichen geringe experimentelle Variationen bei gleichzeitighoher phätotypischer Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus kann das System für die Entwicklung neuer Protokolle angepasst werden.Die Verfahren werden Joachim Tager und Elisangela Bressan, Post-Docs aus unserem Labor, demonstrieren. Klicken Sie in der grafischen Benutzeroberfläche des automatisierten Systems auf die Prozessansicht ressourceninstrument, und wählen Sie den Ressourceninstrumentenprozess aus. Klicken Sie auf Instrumentenprozess ausführen und führen Sie die HEPA-Haube und die Nachladeprozesse aus.Wählen Sie die zu ladenden Ressourcen aus, öffnen Sie die Tür und laden Sie die Zellkulturplatten und Einwegtipps in die entsprechenden Positionen, wie in den Popupbildern angegeben. Dann dekontaminieren Sie die Tür mit 70% Ethanol vor dem Schließen und führen Sie den Dekontaminationsprozess. Das System wird 30 Minuten lang durch UV-Strahlung sterilisiert.Um die Platten mit Kulturmedium oder Dissoziationsreagenz zu beladen, führen Sie den HEPA Haubenschritt aus und öffnen Sie die Tür der Flüssigkeitsabfertigungsstation. Nach der Dekontamination mit 70% Ethanol die Reservoirs auf dem Deck an die zugewiesene Position legen und entdeckeln. Schließen Sie die Tür der Flüssigkeitsabfertigungsstation, und führen Sie dann den InitHepaHood-Ressourceninstrument-Prozess aus, um die HEPA-Haube herunterzufahren.Um eine automatisierte Kulturmethode auszuführen, klicken Sie in der Kalenderansicht der grafischen Benutzeroberfläche auf Prozessschritt hinzufügen, und wählen Sie die Zellenlinie aus, die im Experiment verwendet werden soll. Verwenden Sie den Assistenten, um das Projekt auszuwählen und den zu verwendenden Stapel zu markieren. Klicken Sie auf die nach rechts gerichtete Pfeilspitze, und navigieren Sie zur nächsten Seite des Assistenten, um den auszuführenden Prozessschritt auszuwählen.Planen Sie auf der letzten Seite des Assistenten das Experiment, und legen Sie die entsprechenden Parameterdetails fest, die zum Ausführen der Methode erforderlich sind. Klicken Sie dann auf OK. Nach dem Beladen eines 50-Milliliter-Rohrs mit der menschlichen IPS-Zellsuspension, lastbeschichteten Kulturplatten für die Aufnahme der Zellen im Regal und die Aussaat von Platten aus Rohren Verfahren. Um die Zellen im Brightfield-Bildzytometer zu zählen, bereiten Sie automatisch eine 384-Well-Zählplatte mit Zellsuspension auf dem Deck vor und übertragen Sie mit dem Roboterarm die 384-Well-Zählplatte vom Deck auf das Brightfield-Bildzytometer.Nach dem Zählen bringt das System die Platte in ihre ursprüngliche Position zurück und überträgt eine beschichtete Kultur- oder Assayplatte vom Regal auf das Pipettierdeck. Das System sät dann die Zellen in der benutzerdefinierten Anzahl und Volumen, die für die Platte geeignet sind, und mischt durch Pipetten. Nach der Aussaat wird die Platte für 10 Sekunden bei 500 Umdrehungen pro Minute für die Zellverteilung auf den On-Deck-Shaker verschoben, bevor sie in den Kohlendioxid-Inkubator übertragen wird.Um den automatisierten Zusammenfluss zu bewerten, führen Sie die Check Confluency-Methode aus, und wählen Sie eine Charge aus, die mindestens eine Kulturplatte und keine Assayplatten enthält. Geben Sie im Detailbereich der Parameter iPSCf_2020 für die Bildaufnahme in die Einstellungen für die Bildanalyse ein. Das System überträgt dann die erste Platte vom Inkubator auf das Brightfield-Bildzytometer und bildet den Zellzusammenfluss ab.Um die Zellkultur oder die Assayplattenmedien zu ändern, führen Sie die Methode des Medienwechsels von Kulturplatten aus, und wählen Sie einen Stapel aus, der nur Kulturplatten enthält. Das System überträgt die Platten auf das Deck und neigt die Platten, um die Aspiration des Überstandes zu ermöglichen. Der Überstand wird in das Abfallsammelmodul entsorgt und entsorgt die Spitzen und 12 Milliliter frisches Medium werden zu jeder Platte hinzugefügt.Das System wird dann die Platten neu deckeln und die Platten an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben. Alternativ, um Medium der Assay-Platten zu ändern, führen Medienwechsel der Assay-Platten-Methode. Um die Zellen zu subkultivieren, führen Sie die Subkultivierung der anhaftenden Zellen Methode und wählen Sie die Charge mit den Kulturplatten, die Subkultivierung benötigen.Nach dem Wegwerfen des Mediums wird das System die Zellen einmal mit acht Millilitern PBS pro Platte waschen, bevor es den Zellen acht Milliliter 0,5 Millimolar EDTA hinzufügt. Nach acht Minuten auf dem Deck mit Kippmöglichkeit wird die EDTA durch 12 Milliliter frisches Medium pro Platte ersetzt. Das System wird die Platten mit 2.000 Umdrehungen pro Minute für eine Minute schütteln, um die Kolonien zu vertreiben, bevor die Zellen mit fünf Zyklen der Pipetten, um die Kolonien in 50 bis 80 Mikron Klumpen aufzubrechen trituieren.Die Zellen werden dann in ein 50-Milliliter-Rohr auf dem Deck übertragen, bevor sie in einem Ein-zu-Sieben-Split-Verhältnis gesät werden. Für automatisierte hochgehaltige Zellabbildungen mit hohem Durchsatz führen Sie die Bildgebungsmethode aus und wählen Sie eine Charge aus, die mindestens eine Assayplatte und keine Kulturplatten enthält. Das System überträgt dann eine Assayplatte zur Bildgebung an das automatisierte konfokale Mikroskop.Achten Sie darauf, die richtigen Chargen- und Platten-IDs auszuwählen, während Sie die erforderlichen Prozessschritte ausführen. Die HiPSC-Kulturen sollten täglich auf Wachstum überwacht und auf ihren Anteil an der Konfluenz im Brightfield-Bildzytometer analysiert werden. Nach Passaging und manueller oder automatisierter Systemkultur weisen die Zellen eine typische Stammzell- und Pluripotenzmarkerexpression auf.Neuronen, die im automatisierten Kultursystem differenziert sind, zeigen eine ähnliche Morphologie und neuronale Netzwerkorganisation wie Neuronen, die manuell kultiviert werden. Nach sechs Tagen Der Differenzierung sind automatisch differenzierte kortikale Neuronen positiv für die neuronspezifische Beta-Tubulin- und oberen kortikalen Schichtmarker-Expression der Klasse III. Nach acht Tagen exprimierten die Zellen auch mikrotubuli-assoziiertes Protein 2, das Nervenzelladhäsionsmolekül, und Synapsin I, sowie kortikale Neuronenmarker.Sehr niedrige oder gar keine Expression dieser Marker wird in hiPSC beobachtet. Dieses System kann auch verwendet werden, um einen automatisierten Neuriten-Auswuchs-Assay für lebende Zellen zu etablieren, der es ermöglicht, Neuritenlängen über 11 Tage der Differenzierung ohne manuelle Simperat zu messen. Die Verwendung des automatisierten Kultursystems, um mittlere Veränderungen über einen 65-tägigen Kulturzeitraum durchzuführen, erleichtert die hiPSC-Differenzierung in dopaminerge Neuronen mit der erwarteten zellulären Organisation und Morphologie.Zusätzlich zum Neuritenwachstum können mit diesem hochdurchsatzhohen, hochgehaltigen Format weitere automatisierte phänotypische Assays untersucht werden, die für die Untersuchung der Neurodegeneration relevant sind, z. B. TDP-43-Translokations-RNA-Foci und Alpha-Synuclein-Fibrillenaufnahme.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Forschung

Biologie

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...