Name: automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

著者らは、この研究のために生体材料を寄稿した患者とその家族を感謝して認めている。研究で使用された細胞株は、ラトガース(ND41865をiPS#1としてND41865)とティロ・クナト博士(iPS#2)の研究室でNINDSコレクションからでした。この研究は、NOMIS財団(PH)、RiMod-FTD、EU共同プログラム - 神経変性疾患研究(JPND)(PH)によって部分的にサポートされています。DZNE I2Aイニシアチブ(AD);PD-Strat、ERA-Net ERACoSysMed資金提供プロジェクト(PH)とパーキンソン病のための基礎データイニシアチブ(FOUNDIN-PD)(PH、EB)。ファウンディン-PDは、マイケル・J・フォックス財団のPDプログラムへのパスの一部です。著者らは、マニュアルmDAニューロン分化プロトコルの確立に貢献してくれたスティーブン・フィンクビーナーとメラニー・コブ(グラッドストーン研究所)と、ノイライトアウトグロース分析のセットアップに関する支援を求めた鈴木まみ(横川電機)に感謝する。

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases.">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li><li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology,+autophagy,+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons.">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death &amp; disease. 6, 1811 (2015).</li><li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2++Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation.">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li><li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Huntington's+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics,+Morphology,+and+Maturation.">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. 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開示するものは何もありません。

hiPSC培養と神経分化の標準化のための統合画像化機能を備えた自動細胞培養システムを導入します。ユーザーの介入が最小限であるため、実験変動は低く、分化中の細胞型の再現性を保証します。カレンダーベースのスケジューラは、実験の編成と並列化をサポートし、実験を行う時に高い柔軟性を可能にします。既存の方法は容易に合わせることができ、利用可能な方法のスペクトルを高めることができる。さらに、多数のアッセイプレートフォーマットを使用することができ、このシステムの柔軟性を高めることができます。CO2インキュベーター、ロボットアーム、明視野細胞サイトメーター、液体ハンドリングステーションからなる最小システムは、hiPSC培養と分化に必要な基本ユニットを形成し、学術研究所へのコストを手頃な価格で形成します。化合物の貯蔵のための自動化された-20 °Cの貯蔵システム、RNAiライブラリまたはCRISPR/Cas9ライブラリとの自動細胞培養システムの組み合わせ、および高含有/ハイスループットの顕微鏡の統合は、表向きスクリーニングの実行を可能にする。
現在の研究では、自動化された細胞培養システムは使い捨てチップを使用し、培養培地を手動でリフィルしてリバーザーに補充し、特に一晩での媒体変更やその他の培養プロセスのための液体取り扱いステーションの使用を制限した。この制限を回避するために、方法は使い捨ての先端の代わりに針の使用法に調整することができ、そして、冷蔵庫に保管された媒体ラインとメディアバッグ間のチューブ接続を取り付けた後、メディア貯留器はヒーター要素によって事前に温めた新鮮な媒体で自動的に補充することができる。これにより、チップ、培養メディア、貯水池交換の手動補充によるユーザーの干渉が軽減されます。
当社の自動細胞培養システムには、いくつかの利点があります。1つはバーコード追跡システムです。システムにロードされたプレートは、システムによって読み取られ、保存され、メソッドの実行中および実行後にサンプルを追跡できる一意のバーコードによって識別されます。もう 1 つの利点は、ユーザー固有のプロジェクトを作成する可能性です。ここでは、システムにロードされた培養プレートを特定のプロジェクトに割り当て、バッチでグループ化することができます。バッチでの構造化は、個々のプレートを選択する必要がないため、特定のバッチのすべてのプレートに対して同じ手順の実行を簡素化します。さらに、液体クラスエディタは、ピペットの速度と高さだけでなく、各液体転送ステップの吸引と分配パラメータを調整することができます。すべてのプロセスは、特定のカルチャまたはアッセイプレートに対して実行されたタスクを追跡できるように、ログ ファイルに記録されます。
ヒト人工多能性幹細胞に由来するニューロンや他の細胞型(hiPSC)は、特定の患者集団(パーキンソン病のドーパミン作動性ニューロンなど)における神経変性疾患のメカニズムを研究するためのインビトロツールとして有用であり、個別の薬物スクリーニングの可能性を提供する。hiPSCの培養は非常に時間のかかるものであり、訓練を受けた人々は複雑な分化プロトコルを実行することを要求します。我々は、hiPSCのフィーダーフリー培養を自動化培養に適応させ、2つのニューロン分化プロトコル、テトオンプロモーター10、11の下でNGN2過剰発現に基づく急速な皮質ニューロン分化プロトコル、および中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの生成のための長期的な低分子ベースのプロトコルを実装した。手動培養と分化プロトコルの簡単な転送と再現性により、自動化された培養システムは非常に便利です。自動細胞培養システムで培養したヒトiPSCは、一貫した幹細胞形態を示し、独立実験の間で再現可能な重要な多能性マーカーを発現した。さらに、hiPSC培養プロトコルの自動化は、より多くの細胞株の培養と拡張を並行して好んだ。夜間に実施予定の自動合流性チェックは、ユーザーが研究室にいたときに行われる下流プロセスステップ(例えば、分化のための細胞の収穫または手動再めっき)のために、日中にシステムを空き状態にしておく時間を節約しました。ユーザー定義の合流閾値に達すると、細胞は継代され、自動化された細胞培養システムのスタッカー上で利用可能な細胞外マトリックスコーティングされたプレートに再入れ替えられます。各通路のラウンドは約70分を取り、1つの親の版から4つの1ウェルの版を生成し、1日に20の通路の容量に変換する。
NGN2分化プロトコルの自動化は正常に行われ、異なる通路を越えてニューロン細胞の均質な集団の生成を可能にし、手動分化に匹敵する。さらに、複数の細胞株を含む大規模スクリーニング研究や、数千の試験条件/化合物を用いたスクリーニング実験の実験にかかる実験費用は、急激な分化により削減される。ライブ細胞神経突起伸長測定を含む費用対効果が高く、高スループットの読み出しは、前述の14、15、16のように、疾患モデリングのための表現型読み出しとして容易に開発、実装、使用することができる。このように、GFPを構成的に過剰発現する低分子由来神経前駆体(smNPC)細胞を用いてNGN2プロトコルをさらに適応させました。smNPC細胞は、培養培地によるコスト削減(iPSC培養によるコストの3分の1)や、実験のスケールアップに必要な時間など、さらなる利点を提供します。smNPCからの細胞収量は、iPSCで得られたものより7〜10倍高い。分化ニューロンは、手動での抗体染色や化学標識を必要とせずに完全に自動化されたイメージングプロセスを使用して数日間、正常に監視およびイメージングを行い、単独でのイメージングを含む手動手順に必要なコストと時間を節約しました。96ウェルプレートの内部60ウェルの現在のイメージングは、ウェルあたり25のフィールドがイメージングされるとプレートあたり約16分かかり、これは1000化合物のイメージングベーススクリーニングのデータを1日で取得して分析できることを意味します。将来的には、この読み出しは、神経突起の成長欠陥の救助のための複合スクリーニング研究に使用される可能性があります。
また、iPSCから中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンを生成するための手動分化プロトコルの伝達も実証する。この低分子ベースの分化プロトコルは65日かかり、多くの再めっきステップと頻繁なメディアの変更のために、mDAニューロンの産生を同時に少数のiPSCラインに制限する2日ごとに、労働集約的です。自動化された mDA 分化プロトコルには、数十の iPSC 回線への分化を拡大するという大きな利点があります。最大 30 個のセル ラインを並列で区別できます。分化は主にメディアの変化に基づいているため、人間の干渉なしにほぼ全ての分化プロセスを行うことができます。自動化システムのカレンダーベースのスケジューラを使用して、差別化手順に従ってメディアの変更を計画することができました。このような多数の細胞株や培養プレートを用いて作業する1つの制限は、一晩の培地変更を行うことが不可能であった。主な理由は、私たちのシステムは、使い捨てのヒントを使用し、この手動ステップを実行するために実験室のユーザーを必要とする培養メディアの手動補充を使用するために設定されているという事実です。メディア変更プロセスを容易にするために、システムにロードされたプレートはプロジェクトに割り当てられ、バッチでグループ化されました。その後、バッチサイズは、使い捨てのヒントの数と利用可能な培養培地の量に適応しました。前述のように、この制限は、再利用可能/洗える針の実装とメディアの自動補充によって簡単に克服することができます。iPSCに示すように、細胞の自動通過/再めっきは、当社の自動細胞培養システムが提供する利便性の1つです。分化の25日目にmDAニューロンの自動再めっきをテストしました。しかし、mDAニューロンの解離には、iPSC(8分)よりも解離酵素によるインキュベーションが長く(40分)必要であり、自動再めっき処理を細胞株当たり1h以上に延長する。その結果、同じ日に30個の細胞株の自動再めっきが不可能になった。自動再めっき(プレートの輸送、ピペット)中の他のステップをスピードアップし、一晩の作業を可能にする針とメディアラインの使用にシステムを適応させることは、この制限を解決します。欠点にもかかわらず、MAP2(ニューロン)およびTH(mDAニューロン)陽性細胞の相当量を有する培養を産生するmDAニューロンの自動分化に手動プロトコルを正常に移すことができた。
数十個のiPSC細胞株を並行して分化することは、パーキンソン病を含む神経変性疾患の分子メカニズムを調査するプロジェクトで大きな関心を持っています。ただし、エラーが少なく、コストを削減してタスクを迅速に完了することは、大きな課題です。ここで紹介するプロトコル(iPSC、smNPC、mDAニューロン)の自動化により、私たちはスピードアップし、コストを削減し、プロジェクトの再現性を高めることができました。何百もの患者細胞株を含むFOUNDIN-PD(https://www.foundinpd.org/wp/)のようなプロジェクトの開発は、自動化された培養および分化プロトコルの必要性を示している。今後の視点としては、手動3次元(3D)細胞培養モデルを自動化システムに移す。プレート定義設定とアダプタの使用にマイナーな適応と、3D培養に必要な商業用またはカスタムメイドのプレートとマイクロ流体室の使用が可能になります。さらに、自動ラベルフリーイメージングモデルの実装により、神経細胞の成長をリアルタイムで追跡し、神経突起の成長、ニューロン組織、細胞死の変化を疾患メカニズムのより良い理解に変換することができます。

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は自己更新であり、ほぼすべての成体細胞型で分化することができます。これらの特性は、hiPSCを基礎研究や創薬1における疾患モデリングのための有用なツールにする。ヒトiPSCは、疾患経過に最も影響を受ける/関与する疾患関連細胞型を導出することを可能にするドナー遺伝的背景を保持し、例えば、神経変性疾患2、3に対する異なる神経サブタイプである。また、hiPSCは、ヒトの文脈および生理学的タンパク質発現レベルで疾患をモデル化することにより、動物および細胞過発現モデルの限界を克服し、単因性、複雑、およびエピジェネティックな疾患、ならびに遅発性疾患に至るまでの疾患をモデル化する上で貴重な資産であることが証明されている。
これらの利点と機会にもかかわらず、hiPSCのいくつかの制限に対処する必要があります。現在のhiPSCの文化と分化プロトコルは費用対効果が高く、標準化が難しく、労力を要します。手動培養ステップは、hiPSCの成長と自発的な分化の違いにより、収率と型の変動性が高くなる可能性があります。したがって、自動化5を使用して達成できるより標準化された処理技術とプロトコルの簡素化を実装することによって、実験者依存の変動を減らす必要があります。自動化されたhiPSC培養と分化プロトコルの確立は、学術および産業研究プロジェクトの両方に共通の基準を設定し、生物学的に関連する疾患モデルとより再現可能な結果の生成を可能にする。
これまでの研究では、hiPSC培養6、7、8の自動化が試みられましたが、そのプロトコルはシステムに依存する特定の細胞培養プレートフォーマットに制限されており、異なるアッセイ形式への適応性が欠けています。このようなシステムは細胞の増量に有用であるが、所望の細胞タイプへの自動分化、疾患のフェノタイピング、およびスクリーニング目的には適さない場合がある。さらに、線維芽細胞誘導、hiPSC生成および分化のための大規模な自動化プラットフォームは9を説明したが、魅力的に見えるが、多くの学術研究所にとって手頃な価格であり得ないラインの生産に専念するハイスループットの実験室によってのみ達成することができる規模で。
高効率微粒子空気(HEPA)ろ過環境の液体ハンドリングステーションをベースにした、大容量CO2 インキュベーター、明視野イメージングサイトメーター、プレート輸送用ロボットアームを用いた完全自動細胞培養システムを開発しました。これらのコンポーネントは、安定した再現性のあるhiPSC培養と分化の基礎となります。化合物またはウイルス貯蔵用の自動-20°Cストレージシステムと高速スピニングディスク共焦点ライブセルイメージャーでシステムを補完しました。カスタムメイドのプロトコルを生成することで、サンプル処理とプレートイメージングによる自動細胞播種、メディア変更、合流性チェック、細胞拡張、アッセイプレート生成を可能にし、高コンテンツ/ハイスループットスクリーニングに対応したシステムを実現しました。自動細胞培養およびイメージングシステムは、制御ソフトウェアとカスタムメイドのグラフィカルユーザインタフェース(GUI)を使用して操作されます。GUI を使用すると、メソッドの実行に必要なセル行固有のパラメータを含む CSV ファイルをインポートできます。さらに、GUIは組み込みのカレンダービューを使用して、任意のシーケンスで多数の実験をスケジュールすることができ、各メソッドが開始される時間を完全に制御することができます。
当社の自動細胞培養システムでは、標準化されたピペット速度、通過時間、合流度の閾値、播種密度、および中量を使用して、様々なプレート形式(96、48-、24-、12-、6-または1ウェルプレート形式)で細胞を培養する柔軟性を備えています。我々は、hiPSCを6日間10、11でTUBB3陽性ニューロンを得ることができるニューロンに変換するための最近発表された短期分化プロトコルを適応させました。また、EF1aプロモーター12およびiPSCの下でGFPを構成的に発現するニューロンへの小分子神経前駆細胞(smNPC)の自動分化とイメージングを中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンに確立し、65日以内にmDAニューロンを生み出す以前に発表されたデュアルSMAD阻害プロトコル13を適応させた。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287</td>
			<td>1 to 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Oct3/4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>1 to 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti- TUBB3</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>1 to 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-BRN2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-TH</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-74421</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei counterstaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechest 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1 to 8,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent TapeStation system</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>4200</td>
			<td>Automated electrophoresis 
			for DNA and RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated -20 &#176;C storage system</td>
			<td>Hamilton Storage 
			Technologies</td>
			<td>Sample Access Manager 
			(SAM -20C, 3200 series)</td>
			<td>Storage of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode reader</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>Barcode Reader Orbit</td>
			<td>Barcode scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield cell cytomat</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Confluence check and 
			cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Automated confocal 
			microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for cell cultures</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 24 C, CU</td>
			<td>12 stackers pitch 28 mm, 
			12 stackers pitch 23 mm 
			(total of 456 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for thawing samples</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 2-LIN, 60 DU 
			(Drying Unit)</td>
			<td>2 stackers pitch 28 mm 
			(total of 42 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Hood Flow Star UV</td>
			<td>Modified by Hamilton 
			Robotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling station</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Microlab Star</td>
			<td>Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml 
			and 96 Channel MPH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>188211APE</td>
			<td>Media/reagents reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water system</td>
			<td>Veolia Water</td>
			<td>ELGA PURELAB Classic</td>
			<td>Provides pure water for 
			needle wash station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Real-Time 
			PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>QSTUDIO12KOA</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Rackrunner</td>
			<td>Transport of plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turn table</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Turn Table</td>
			<td>Adjust plate orientiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterruptible power supply</td>
			<td>APC</td>
			<td>Smart UPS RT Unit, 
			10000 VA Power supply</td>
			<td>Backup power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO-pipettes</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4500</td>
			<td>Electronic pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4453545</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well culture plate (84 cm2)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td>Nunc OmniTray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates (9.6 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate (3.9 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate (0.32 cm2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005558</td>
			<td>CellCarrier-96 Black plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 50-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235987</td>
			<td>50-uL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 300-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235985</td>
			<td>300-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 1000-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235939</td>
			<td>1000-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 5-mL</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>184022</td>
			<td>5-mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 15-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>15-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 50-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>50-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene cryogenic 2.0 mL vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V5007</td>
			<td>Cryovials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_hEF1a_rtTA3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61472</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61474</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sequence (forward)</td>
			<td>Sequence (reverse)</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 (ID 4505967a1)</td>
			<td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td>
			<td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG (ID 153945815c3)</td>
			<td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td>
			<td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REX1 (ID 89179322c1)</td>
			<td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td>
			<td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2 (ID 87578393c1)</td>
			<td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>
			<td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN2 (ID 380254475c1)</td>
			<td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td>
			<td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUX2 (ID 291045458c2)</td>
			<td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td>
			<td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td>
			<td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td>
			<td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td>
			<td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td>
			<td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH</td>
			<td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td>
			<td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td>
			<td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Housekeeping genes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td>
			<td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAZ1</td>
			<td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td>
			<td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLPO</td>
			<td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td>
			<td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPL13A</td>
			<td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td>
			<td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Use concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 - 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC culture medium 
			(Essential 8 Flex medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - NGN2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.909 mL (50 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331093</td>
			<td>484.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL ( 2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>0.25 mL (2.5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - SRM medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.5 mL (55 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>409.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement 
			(serum replacement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>75 mL (15%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - N2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>475 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL(1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline (dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate 
			magnesium (AA2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>64 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic factor-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMA)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833-10MG</td>
			<td>0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>420220-10MG</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13197</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid (AA1)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189 (LDN)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11802</td>
			<td>100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (Purm)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Hedgehog/Shh (C24II) 
			N-Terminus (SHH)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1845-SH</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542 (SB)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13031</td>
			<td>10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor type &#223;3 
			(TGF&#223;3)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>243-B3</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10005583</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell dissociation reagent 
			(StemPro Accutase)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11575020</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation and cDNA kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Rneasy MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Trizol lysis buffer (RNA 
			lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080-085</td>
			<td>SuperScript III Reverse 
			Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Framework (CCF) 
			(Graphical user interface, GUI)</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>User interface for the automated system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellPathFinder software 
			(image analysis software 1)</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellPathfinder HCS Software</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager Measurement System</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>Included with 
			CellVoyager 7000</td>
			<td>Microscope controlling 
			software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus software 
			(image analysis software 2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloud based qPCR app</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Themo Fisher cloud</td>
			<td>Analysis software for 
			qRT-PCR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus software</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>VENUS Two Dynamic 
			Schedular 5.1 Software</td>
			<td>Controlling software for the 
			automated system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の手動培養および分化プロトコルは、標準化が困難であり、高い変動性を示し、望ましくない細胞型への自発的分化を起こしやすい。この方法は労働集約的であり、大規模な実験に容易に適さない。これらの限界を克服するために、我々は、ハイスループットイメージングシステムに結合された自動化された細胞培養システムを開発し、複数のhiPSCラインを並列および神経分化で維持するためのプロトコルを実装した。ニューロゲニン-2(NGN2)過剰発現を用いた短期分化プロトコルの自動化により、6\u20128日以内にhiPSC由来の皮質ニューロンを産生し、65日以内にHiPSC由来の中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンを生成する長期分化プロトコルの実装について述べた。また、GFPレンチウイルスを導入した低分子由来神経前駆体細胞(smNPC)にNGN2アプローチを適用し、生細胞自動神経突起増殖アッセイを確立しました。我々は、日常的なhiPSC培養および皮質およびドーパミン作動性ニューロンへの分化に適したプロトコルを備えた自動化システムを提示する。当社のプラットフォームは、長期的なハンズフリー培養および高含有量/高スループットのhiPSCベースの化合物、RNAiおよびCRISPR/ Cas9スクリーニングに適しており、新しい疾患メカニズムおよび薬物標的を同定します。

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Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)培養の自動化と、自動イメージングと解析に対応した神経分化を示す。

ヒト人工多能性幹細胞由来皮質およびドーパミン作動性ニューロンの統合されたライブ細胞モニタリングによる自動生産

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

この研究の全体的な目標は、ヒトIPS細胞を神経系統に培養し、分化するための自動手順と、それらの自動イメージングを実装する方法を示す方法です。標準化された自動化されたプロシージャは高い平明な再現性を保障する間低い実験的な変化を可能にする。さらに、システムは新しいプロトコルの開発のために適応することができる。手順を実証するのは、ヨアヒム・タガーとエリザンジェラ・ブレッサン、私たちの研究室からのポストドキュメントです。自動化システムのグラフィック・ユーザー・インターフェースで、「リソース・インストゥルメント・プロセス・ビュー」をクリックし、リソース・インストゥルメント・プロセスを選択します。[計測器の実行] プロセスをクリックし、実行 HEPA フードとリロード プロセスを実行します。ロードするリソースを選択し、ドアを開けて、ポップアップ画像で示される適切な位置に細胞培養プレートと使い捨てのヒントをロードします。その後、閉じる前に70%エタノールでドアを除染し、除染プロセスを実行します。システムは30分間紫外線照射によって殺菌される。プレートに培養液または解離試薬をロードするには、実行HEPAフードステップを実行し、液体ハンドリングステーションのドアを開けます。70%エタノールで除染した後、デッキの貯蔵所を割り当てられた位置に置き、それらを取り外します。液体ハンドリングステーションのドアを閉め、InitHepaHoodリソース機器プロセスを実行してHEPAフードの電源を切ります。自動化されたカルチャ方式を実行するには、グラフィック ユーザー インターフェイスのカレンダー ビューで、[プロセス ステップの追加] をクリックし、実験で使用するセル行を選択します。ウィザードを使用してプロジェクトを選択し、使用するバッチをマークします。右向きの矢印をクリックし、ウィザードの次のページに移動して、実行するプロセスステップを選択します。ウィザードの最後のページで、実験をスケジュールし、メソッドの実行に必要な適切なパラメータ詳細変数を設定します。次に、[OK] をクリックします。ヒトIPS細胞懸濁液を用いて50ミリリットルのチューブをロードした後、棚に細胞を受け入れるための培養プレートをロードし、チューブ法からプレートの播種を実行する。ブライトフィールドイメージングサイトメーターの細胞をカウントするには、デッキにセルサスペンションを備えた384ウェルカウントプレートを自動的に準備し、ロボットアームを使用してデッキからブライトフィールドイメージングサイトメーターに384ウェルカウントプレートを転送します。カウント後、システムはプレートを元の位置に戻し、コーティングされた培養またはアッセイプレートを棚からピペットデッキに移します。システムは、プレートに適したユーザー定義の数とボリュームでセルをシードし、ピペット加工によって混合します。播種後、プレートは、二酸化炭素インキュベーターに移される前に、細胞分布のために毎分500回転で10秒間オンデッキシェーカーに移動されます。自動合流を評価するには、コンフルエンスのチェック方法を実行し、少なくとも1つの培養プレートとアッセイプレートを含むバッチを選択します。パラメータ詳細セクションで、撮像解析設定でiPSCf_2020を入力します。システムは、インキュベーターからブライトフィールドイメージングサイトメーターに最初のプレートを転送し、細胞合流を画像化します。細胞培養またはアッセイプレート培地を変更するには、培養プレートの媒体交換方法を実行し、培養プレートのみを含むバッチを選択する。システムはデッキに版を移し、上清の吸引を可能にするために版を傾ける。上清は、廃棄物回収モジュールに廃棄され、先端を廃棄し、新鮮な媒体の12ミリリットルは、各プレートに追加されます。システムは、プレートを再蓋し、細胞培養インキュベーターにプレートを返します。あるいは、アッセイプレートの媒体を変えるために、アッセイプレート法の媒体交換を行う。細胞をサブ栽培するには、接着細胞のサブ栽培方法を実行し、サブ栽培を必要とする培養プレートを含むバッチを選択する。培地を廃棄した後、システムは細胞に0.5ミリモルEDTAの8ミリリットルを加える前に、1皿あたり8ミリリットルのPBSで細胞を1回洗浄する。チルトオプション付きデッキで8分後、EDTAはプレートあたり12ミリリットルの新鮮な媒体に置き換えられます。システムは、50〜80ミクロンの塊にコロニーを分割するためにピペットの5サイクルで細胞を三tutuatsする前に、コロニーを取り除くために1分間2,000回転でプレートを揺らします。細胞は、1対7の分割比でそれらを播種する前に、デッキ上の50ミリリットルチューブに移されます。自動高含有量、高スループットのセルイメージングの場合は、イメージング方法を実行し、少なくとも1つのアッセイプレートと培養プレートを含むバッチを選択します。システムは、次に、アッセイプレートを自動共焦点顕微鏡に転送してイメージングします。必要なプロセスステップを実行している間は、正しいバッチ ID とプレート ID を選択してください。hiPSC培養は、成長のために毎日監視され、ブライトフィールドイメージングサイトメーターにおける合流率を分析する必要があります。通過および手動または自動化されたシステム培養の後、細胞は典型的な幹細胞および多能性マーカー発現を示す。自動培養系で分化されたニューロンは、手動で栽培されたニューロンと同様の形態およびニューロンネットワーク組織を示す。6日間の分化後、自動的に分化した皮質ニューロンは、ニューロン固有クラスIIIβ-チューブリンおよび上皮層マーカー発現に陽性である。8日後、細胞はまた、微小管関連タンパク質2、神経細胞接着分子、およびシナプシンI、ならびに皮質ニューロンマーカーを発現した。これらのマーカーの発現が非常に低いか、または全くhiPSCで観察されない。このシステムはまた、手動介入なしに11日間にわたって分化の神経突起長を測定することを可能にする生細胞の自動神経突起伸長アッセイを確立するために使用することができる。自動化された培養システムを使用して65日間の培養期間にわたって培地の変化を行うことは、期待される細胞組織および形態を有する中脳ドーパミン作動性ニューロンへのhiPSC分化を促進する。神経突起の成長に加えて、神経変性の研究に関連する他の自動表現型アッセイ、例えば、TDP-43転座RNA病巣およびα-シヌクレインフィブリル取り込み、この高スループット、高コンテンツフォーマットを用いて探索することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

ヒト多能性のための代替培養はセル生産、メンテナンス、および遺伝子解析幹

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...