Name: automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner takknemlig pasientene og deres familier som bidro med biomateriale for denne studien. Cellelinjer som brukes i studien var fra NINDS samling med Rutgers (ND41865 som iPS # 1) og laboratoriet til Dr. Tilo Kunath (iPS # 2). Dette arbeidet støttes delvis av NOMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, et EU-felles program - Neurodegenerative Disease Research (JPND) (PH); DZNE I2A-initiativet (AD); PD-Strat, et ERA-Net ERACoSysMed-finansiert prosjekt (PH) og Foundational Data Initiative for Parkinsons Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD er en del av Michael J. Fox Foundations PATH to PD-program. Forfatterne takker Steven Finkbeiner og Melanie Cobb (Gladstone Institutes) for å ha bidratt til etableringen av den manuelle mDA neuron differensieringsprotokollen og Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) for hjelp i neurite outgrowth analyse oppsett.

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases.">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li><li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease.">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li><li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions.">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647 (2015).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System.">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+derivation,+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li><li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells.">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling.">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PloS one. 8 (3), 59252 (2013).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li><li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology,+autophagy,+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons.">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death &amp; disease. 6, 1811 (2015).</li><li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2++Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation.">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li><li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Huntington's+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics,+Morphology,+and+Maturation.">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimerBank:+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification.">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, 792 (2010).</li></ol>

Vi har ingenting å avsløre.

Vi introduserer et automatisert cellekultursystem med integrerte bildefunksjoner for standardisering av hiPSC-kultur og nevronal differensiering. På grunn av minimal brukerintervensjon er eksperimentell variasjon lav som sikrer reproduserbarhet av cellulære fenotyper under differensiering. Den kalenderbaserte planleggeren støtter organiseringen og parallelliseringen av eksperimenter og gir høy grad av fleksibilitet når eksperimentene utføres. Eksisterende metoder kan enkelt tilpasses og spekteret av tilgjengelige metoder kan økes. I tillegg kan et stort antall analyseplateformater brukes til å legge til fleksibiliteten til dette systemet. Det minimale systemet som består av en CO2 inkubator, en robotarm, et brightfield cellecytometer og en flytende håndteringsstasjon danner den grunnleggende enheten som trengs for hiPSC-kultur og differensiering, med rimelige kostnader til akademiske forskningslaboratorier. Kombinasjonen av det automatiserte cellekultursystemet med et automatisert -20 °C lagringssystem for lagring av forbindelser, RNAi-biblioteker eller CRISPR/Cas9-biblioteker, og integrering av et mikroskop med høy innhold/høy gjennomstrømning gjør det mulig å utføre fenotypiske screeninger.
I den nåværende studien brukte det automatiserte cellekultursystemet engangstips, og kulturmediene ble fylt på manuelt inn i reservoaret, og dermed begrenset bruken av væskehåndteringsstasjonen for medieendringer og andre kulturprosesser spesielt over natten. For å omgå denne begrensningen kan metodene justeres til nålebruk i stedet for engangsspisser, og etter å ha installert rørforbindelser mellom medielinjer og medieposer lagret i kjøleskap, kan mediereservoarer automatisk fylles med friske medier forhåndsvarmet av varmeelement. Dette vil redusere brukerforstyrrelser forårsaket av manuell påfylling av tips, kulturmedier og reservoarutveksling.
Vårt automatiserte cellekultursystem gir flere fordeler. Den ene er strekkodesporingssystemet. Platene som lastes i systemet identifiseres av en unik strekkode som leses og lagres av systemet som tillater sporing av prøver under og etter metodekjøring. En annen fordel er muligheten til å opprette brukerspesifikke prosjekter. Her kan kulturplater lastet i systemet tilordnes til et bestemt prosjekt og grupperes i grupper. Struktureringen i grupper forenkler utførelsen av samme prosedyre til alle plater av en bestemt batch siden ingen individuelle plater må velges. I tillegg gjør en redigeringsprogram for flytende klasse det mulig å justere pipetteringshastigheten og høyden, samt aspirasjons- og dispenseringsparametrene for hvert væskeoverføringstrinn. Hver prosess er dokumentert i loggfiler som tillater å spore hvilke oppgaver som er utført for en gitt kultur eller analyseplate.
Nevroner og andre celletyper avledet fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) er nyttige in vitro-verktøy for å studere mekanismene for nevrodegenerative sykdommer i bestemte pasientpopulasjoner (f.eks. dopaminerge nevroner for Parkinsons sykdom) som gir mulighet for personlig legemiddelscreening. Culturing hiPSC er svært tidkrevende og krever trente mennesker til å utføre komplekse differensieringsprotokoller, vanligvis begrenset til lavskala produksjon. Vi tilpasset den materfrie kulturen i hiPSC til en automatisert kultur og implementerte to nevronale differensieringsprotokoller, en rask kortikal neuron differensieringsprotokoll basert på NGN2-overuttrykk under en tet-on promotor10,11og en langsiktig liten molekylbasert protokoll for generering av midbrain dopaminerge (mDA) nevroner13. Den enkle overføringen og reproduserbarheten til manuell kultur og differensieringsprotokoller gjør det automatiserte kultursystemet svært nyttig. Menneskelig iPSC dyrket i det automatiserte cellekultursystemet viste konsekvent stamcellemorfologi og uttrykte viktige pluripotensmarkører, reproduserbare mellom uavhengige eksperimenter. I tillegg favoriserte automatiseringen av hiPSC-kulturprotokollen kulturen og utvidelsen av et større antall cellelinjer parallelt. Automatiserte samløpet kontroller planlagt å bli utført over natten spart tid forlater systemet gratis i løpet av dagen for nedstrøms prosesstrinn utført når brukeren var i laboratoriet (f.eks høsting av celler eller manuell replating for differensiering). Når de når den brukerdefinerte samløpetsterskelen, blir cellene passasjer og omset til ekstracellulære matrisebelagte plater som er tilgjengelige på stableren til det automatiserte cellekultursystemet. Hver passasje runde tar ca 70 min og genererer fire 1-brønns plater fra en overordnet plate, noe som oversettes til en kapasitet på 20 passasjer på en dag.
Automatiseringen av NGN2 differensieringsprotokollen ble gjort med hell og tillot generering av en homogen populasjon av nevronale celler på tvers av forskjellige passasjer og sammenlignbar med manuelle differensieringer. Videre vil de eksperimentelle kostnadene for store screeningstudier som involverer flere cellelinjer eller screeningeksperimenter med tusenvis av testforhold / forbindelser bli redusert på grunn av raske differensieringer. Kostnadseffektive og høy gjennomstrømmingavlesninger, inkludert live-celle neurite utvekst målinger kan enkelt utvikles, implementeres og brukes som fenotypisk avlesninger for sykdom modellering, som vist tidligere14,15,16. Dermed tilpasset vi videre NGN2-protokollen ved hjelp av små molekylavledede nevrale forløperceller (smNPC) celler som utgjør over-express GFP. SmNPC-cellene gir ytterligere fordeler, inkludert reduserte kostnader med kulturmedier (en tredjedel av kostnaden med iPSC-kultur) og tid som kreves for å skalere opp eksperimenter. Celleavlingene fra smNPC er 7 til 10 ganger høyere enn det som oppnås med iPSC. Differensieringsnevronene ble vellykket overvåket og avbildet i flere dager ved hjelp av en helautomatisk bildebehandlingsprosess uten behov for manuelle antistoffflekker eller kjemisk merking, noe som sparer kostnader og tid som kreves for manuelle prosedyrer, inkludert avbildningen av seg selv. Den nåværende bildebehandling av indre 60 brønner av en 96-brønns plate tar rundt 16 min per plate når 25 felt per brønn er avbildet, noe som betyr at dataene for en bildebasert screening for 1000 forbindelser, kan anskaffes og analyseres på en dag. I fremtiden kan denne avlesningen brukes i sammensatte screeningstudier for redning av neuritt utvekstdefekter.
Videre demonstrerer vi også overføringen av en manuell differensieringsprotokoll for generering av midbrain dopaminerge (mDA) nevroner fra iPSC. Denne lille molekylbaserte differensieringsprotokollen tar 65 dager og er arbeidsintensiv på grunn av flere replating trinn og hyppige medieendringer, for det meste hver 2 dager, noe som begrenser produksjonen av mDA nevroner til få iPSC-linjer samtidig. Den automatiserte mDA differensieringsprotokollen har den store fordelen av å skalere opp differensieringen til dusinvis av iPSC-linjer. Opptil 30 cellelinjer kan differensieres parallelt. Siden differensieringen for det meste er basert på medieendringer, kan nesten hele differensieringsprosessen utføres uten menneskelig innblanding. Ved hjelp av den kalenderbaserte planleggeren for det automatiserte systemet, kan vi planlegge medieendringene i henhold til differensieringstrinnene. En begrensning av å jobbe med et så stort antall cellelinjer og kulturplater var umuligheten til å utføre over nattens medieendringer. Hovedårsaken er at systemet vårt er satt opp for bruk av engangstips og manuell påfylling av kulturmedier som krever at en bruker i laboratoriet utfører dette manuelle trinnet. For å forenkle medieendringsprosessen ble plater lastet inn i systemet tilordnet til et prosjekt og gruppert i grupper. Batchstørrelsen ble deretter tilpasset antall engangstips og volum av kulturmedier tilgjengelig. Som beskrevet ovenfor, kan denne begrensningen lett overvinnes ved implementering av gjenbrukbare / vaskbare nåler og automatisert påfylling av medier. Automatisert passaging / replating av celler, som vist for iPSC, er en av bekvemmelighetene som tilbys av vårt automatiserte cellekultursystem. Vi har testet den automatiserte replating av mDA nevroner på dag 25 av differensiering. Dissosiasjonen av mDA-nevroner krever imidlertid lengre (40 min) inkubasjon med dissosiasjonsenzymet enn iPSC (8 min) som utvider den automatiserte replatingsprosessen til mer enn 1 time per cellelinjer. Som en konsekvens ble den automatiserte omplatingen av 30 cellelinjer på samme dag umulig. Påstålelse av andre trinn under automatisert omplating (transport av plater, pipettering) og tilpasning av systemet til bruk av nåler og medielinje som gjør et overnattingsarbeid mulig, ville løse denne begrensningen. Til tross for ulempene, kunne vi med hell overføre den manuelle protokollen til en automatisert differensiering av mDA-nevroner som produserer kulturer med betydelige mengder MAP2 (neuron) og TH (mDA nevroner) positive celler.
Differensiering dusinvis av iPSC cellelinjer parallelt er av stor interesse for prosjekter som undersøker molekylære mekanismer av nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom. Men å fullføre oppgaver raskere med færre feil og til reduserte kostnader er en stor utfordring. På grunn av automatisering av protokollene som presenteres her (iPSC, smNPC og mDA neuron), kunne vi fremskynde, redusere kostnadene og øke reproduserbarheten i våre prosjekter. Utviklingen av prosjekter som FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) som involverer hundrevis av pasientcellelinjer viser behov for automatisert kultur og differensieringsprotokoller. Våre fremtidige perspektiver inkluderer overføring av manuelle 3-dimensjonale (3D) cellekulturmodeller til det automatiserte systemet. Mindre tilpasninger i platedefinisjonsinnstillingene og bruk av adaptere vil tillate bruk av kommersielle eller skreddersydde plater og mikrofluidiske kamre som kreves for 3D-kulturene. Videre vil implementeringen av en automatisert etikettfri bildemodell tillate oss å spore den nevronale veksten i sanntid og oversette endringer i neurittvekst, nevronorganisasjon og celledød til bedre forståelse av sykdomsmekanismene.

Humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) er selvfornyende og kan differensiere i nesten alle voksne celletyper. Disse egenskapene gjør hiPSC til et nyttig verktøy for sykdomsmodellering i grunnleggende forskning og narkotikaoppdagelse1. Human iPSC beholder donorgenetisk bakgrunn som gjør det mulig å utlede sykdomsrelevante celletyper som er mest berørt / involvert i sykdomsforløpet, for eksempel forskjellige nevronale undertyper for nevrodegenerativesykdommer 2,3. HiPSC overvinner også noen av begrensningene i dyre- og cellulære overuttrykksmodeller ved å modellere sykdommer i menneskelig sammenheng og fysiologiske proteinuttrykksnivåer, og har vist seg å være en verdifull ressurs i modellering av sykdommer som spenner fra monogene, komplekse og epigenetiske lidelser, samt sene sykdommer4.
Til tross for disse fordelene og mulighetene, må flere begrensninger av hiPSC fortsatt tas opp. Nåværende hiPSC-kultur- og differensieringsprotokoller er ikke kostnadseffektive, vanskelige å standardisere og er arbeidsintensive. Manuelle kulturtrinn kan føre til høy variasjon i utbytter og fenotyper på grunn av forskjeller i vekst og spontan differensiering av hiPSC. Derfor må eksperimenteringsavhengig variasjon reduseres ved å implementere mer standardiserte håndteringsteknikker og forenkle protokoller som kan oppnås ved hjelp av automatisering5. Etableringen av automatisert hiPSC kultur og differensiering protokoller vil sette felles standarder for både akademiske og industrielle forskningsprosjekter, og tillate generering av biologisk relevante sykdomsmodeller og mer reproduserbare resultater.
Tidligere arbeid har forsøkt automatisering av hiPSCkulturer 6,7,8 menderes protokoller har vært begrenset til bestemte celle kultur plate formater avhengig av systemet og mangler tilpasningsevne til ulike analyseformater. Slike systemer er nyttige i sveising av celler, men kan ikke være egnet for automatisert differensiering i ønskede celletyper, sykdomphenotyping og screeningformål. I tillegg har en storskala automatisert plattform for fibroblastavledning, hiPSC-generering og differensiering blittbeskrevet 9, men på en skala som bare kan oppnås ved høy gjennomstrømningslaboratorier dedikert til produksjon av linjer som virker attraktive, men kan være uoverkommelige for mange akademiske laboratorier.
Vi utviklet et helautomatisk cellekultursystem basert på en væskehåndteringsstasjon i et høyeffektivt partikkelluft (HEPA)-filtrert miljø sammen med en storkapasitets CO 2-inkubator, et brightfield imaging cytometer og en robotarm for platetransport. Disse komponentene gir grunnlag for stabil og reproduserbar hiPSC-kultur og differensiering. Vi supplerte systemet med et automatisert -20 ° C lagringssystem for sammensatt eller viruslagring og en høyhastighets spinnende disk confocal live-cell imager. Skreddersydde protokoller ble generert slik at automatisert cellesåing, medieendringer, samløpet sjekker, celleutvidelse og analyseplategenerering med prøvebehandling og plateavbildning, noe som gjør systemet kompatibelt med høyinnhold / høy gjennomstrømningsscreening. Det automatiserte cellekultur- og bildesystemet drives ved hjelp av kontrollerende programvare og det skreddersydde grafiske brukergrensesnittet (GUI). Gui lar brukerne importere CSV-filer som inneholder cellelinjespesifikke parametere som trengs for metodekjøring. I tillegg gjør GUI det mulig å planlegge mange eksperimenter i en hvilken som helst rekkefølge ved hjelp av den innebygde kalendervisningen, slik at full kontroll over tiden når hver metode starter.
Vårt automatiserte cellekultursystem bruker standardiserte pipetteringshastigheter, passagingstider, samløpetsterskler, såetettheter og middels volumer med fleksibilitet til kulturceller i en rekke plateformater (96-, 48-, 24-, 12-, 6- eller 1-brønns plateformat). Vi tilpasset en nylig publisert kortsiktig differensieringsprotokoll for å konvertere hiPSC til nevroner som kan gi TUBB3 positive nevroner i 6 dager10,11. Vi etablerte også den automatiserte differensiasjonen og avbildningen av små molekylnerale forløperceller (smNPC) til nevroner som uttrykker GFP under EF1a promoter12 og iPSC i midbrain dopaminerge (mDA) nevroner, og tilpasser en tidligere publisert dual-SMAD hemmingsprotokoll13 som gir mDA nevroner innen 65 dager.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287</td>
			<td>1 to 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Oct3/4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>1 to 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti- TUBB3</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>1 to 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-BRN2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-TH</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-74421</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei counterstaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechest 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1 to 8,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent TapeStation system</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>4200</td>
			<td>Automated electrophoresis 
			for DNA and RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated -20 &#176;C storage system</td>
			<td>Hamilton Storage 
			Technologies</td>
			<td>Sample Access Manager 
			(SAM -20C, 3200 series)</td>
			<td>Storage of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode reader</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>Barcode Reader Orbit</td>
			<td>Barcode scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield cell cytomat</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Confluence check and 
			cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Automated confocal 
			microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for cell cultures</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 24 C, CU</td>
			<td>12 stackers pitch 28 mm, 
			12 stackers pitch 23 mm 
			(total of 456 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for thawing samples</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 2-LIN, 60 DU 
			(Drying Unit)</td>
			<td>2 stackers pitch 28 mm 
			(total of 42 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Hood Flow Star UV</td>
			<td>Modified by Hamilton 
			Robotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling station</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Microlab Star</td>
			<td>Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml 
			and 96 Channel MPH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>188211APE</td>
			<td>Media/reagents reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water system</td>
			<td>Veolia Water</td>
			<td>ELGA PURELAB Classic</td>
			<td>Provides pure water for 
			needle wash station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Real-Time 
			PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>QSTUDIO12KOA</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Rackrunner</td>
			<td>Transport of plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turn table</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Turn Table</td>
			<td>Adjust plate orientiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterruptible power supply</td>
			<td>APC</td>
			<td>Smart UPS RT Unit, 
			10000 VA Power supply</td>
			<td>Backup power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO-pipettes</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4500</td>
			<td>Electronic pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4453545</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well culture plate (84 cm2)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td>Nunc OmniTray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates (9.6 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate (3.9 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate (0.32 cm2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005558</td>
			<td>CellCarrier-96 Black plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 50-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235987</td>
			<td>50-uL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 300-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235985</td>
			<td>300-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 1000-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235939</td>
			<td>1000-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 5-mL</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>184022</td>
			<td>5-mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 15-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>15-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 50-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>50-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene cryogenic 2.0 mL vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V5007</td>
			<td>Cryovials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_hEF1a_rtTA3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61472</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61474</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sequence (forward)</td>
			<td>Sequence (reverse)</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 (ID 4505967a1)</td>
			<td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td>
			<td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG (ID 153945815c3)</td>
			<td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td>
			<td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REX1 (ID 89179322c1)</td>
			<td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td>
			<td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2 (ID 87578393c1)</td>
			<td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>
			<td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN2 (ID 380254475c1)</td>
			<td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td>
			<td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUX2 (ID 291045458c2)</td>
			<td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td>
			<td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td>
			<td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td>
			<td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td>
			<td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td>
			<td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH</td>
			<td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td>
			<td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td>
			<td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Housekeeping genes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td>
			<td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAZ1</td>
			<td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td>
			<td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLPO</td>
			<td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td>
			<td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPL13A</td>
			<td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td>
			<td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Use concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 - 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC culture medium 
			(Essential 8 Flex medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - NGN2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.909 mL (50 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331093</td>
			<td>484.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL ( 2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>0.25 mL (2.5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - SRM medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.5 mL (55 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>409.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement 
			(serum replacement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>75 mL (15%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - N2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>475 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL(1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline (dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate 
			magnesium (AA2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>64 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic factor-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMA)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833-10MG</td>
			<td>0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>420220-10MG</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13197</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid (AA1)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189 (LDN)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11802</td>
			<td>100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (Purm)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Hedgehog/Shh (C24II) 
			N-Terminus (SHH)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1845-SH</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542 (SB)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13031</td>
			<td>10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor type &#223;3 
			(TGF&#223;3)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>243-B3</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10005583</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell dissociation reagent 
			(StemPro Accutase)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11575020</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation and cDNA kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Rneasy MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Trizol lysis buffer (RNA 
			lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080-085</td>
			<td>SuperScript III Reverse 
			Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Framework (CCF) 
			(Graphical user interface, GUI)</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>User interface for the automated system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellPathFinder software 
			(image analysis software 1)</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellPathfinder HCS Software</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager Measurement System</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>Included with 
			CellVoyager 7000</td>
			<td>Microscope controlling 
			software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus software 
			(image analysis software 2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloud based qPCR app</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Themo Fisher cloud</td>
			<td>Analysis software for 
			qRT-PCR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus software</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>VENUS Two Dynamic 
			Schedular 5.1 Software</td>
			<td>Controlling software for the 
			automated system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring

Manuell kultur og differensieringsprotokoller for humane induserte pluripotente stamceller (hiPSC) er vanskelige å standardisere, vise høy variasjon og er utsatt for spontan differensiering i uønskede celletyper. Metodene er arbeidskrevende og er ikke lett mottagelige for store eksperimenter. For å overvinne disse begrensningene utviklet vi et automatisert cellekultursystem koblet til et bildesystem med høy gjennomstrømning og implementerte protokoller for å opprettholde flere hiPSC-linjer parallelt og nevronal differensiering. Vi beskriver automatiseringen av en kortsiktig differensieringsprotokoll ved hjelp av Neurogenin-2 (NGN2) overuttrykk for å produsere hiPSC-avledede kortikale nevroner innen 6\u20128 dager, og implementeringen av en langsiktig differensieringsprotokoll for å generere hiPSC-avledede midbrain dopaminerge (mDA) nevroner innen 65 dager. Vi brukte også NGN2-tilnærmingen på en liten molekylavledet nevrale forløperceller (smNPC) transdusert med GFP lentivirus og etablerte en live-celle automatisert neuritt utvekstanalyse. Vi presenterer et automatisert system med protokoller egnet for rutinemessig hiPSC kultur og differensiering i kortikale og dopaminerge nevroner. Vår plattform er egnet for langsiktig håndfri kultur og høy-innhold / høy gjennomstrømning hiPSC-baserte sammensatte, RNAi og CRISPR / Cas9 screenings for å identifisere nye sykdomsmekanismer og narkotikamål.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Vi viser automatisering av menneskelige induserte pluripotente stamcellekulturer (hiPSC) og nevronal differensieringer som er kompatible med automatisert bildebehandling og analyse.

Automatisert produksjon av humane induserte pluripotente stamcelleavledede kortikale og dopaminerge nevroner med integrert live-celle overvåking

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Det overordnede målet med denne studien er å vise hvordan man implementerer automatiserte prosedyrer for å kultere og differensiere menneskelige IPS-celler i nevronale avstamninger, samt deres automatiserte bildebehandling. Standardiserte automatiserte prosedyrer tillater lav eksperimentell variasjon samtidig som de sikrer høy fenotypisk reproduserbarhet. I tillegg kan systemet tilpasses utviklingen av nye protokoller.Å demonstrere prosedyrene vil være Joachim Tager og Elisangela Bressan, post-docs fra laboratoriet vårt. Klikk ressursinstrumentprosessvisning i det grafiske brukergrensesnittet til det automatiserte systemet, og velg ressursinstrumentprosessen. Klikk kjør instrumentprosessen og kjør hepa-hette- og omlastingsprosessene.Velg ressursene som skal lastes, åpne døren og last cellekulturplatene og engangsspissene i de aktuelle posisjonene som angitt av popup-bildene. Deretter dekontaminere døren med 70% etanol før du lukker og kjører dekontamineringsprosessen. Systemet vil bli sterilisert av UV-stråling i 30 minutter.For å laste platene med kulturmedium eller dissosiasjonsreagens, utfør hepa hestetrinnet og åpne døren til væskehåndteringsstasjonen. Etter dekontaminering med 70% etanol, plasser reservoarene på dekk til tildelt posisjon og de-lid dem. Lukk døren til væskehåndteringsstasjonen, og kjør deretter InitHepaHood ressursinstrumentprosessen for å slå av HEPA-hetten.Hvis du vil utføre en automatisert kulturmetode, klikker du legg til prosesstrinn i kalendervisningen i det grafiske brukergrensesnittet og velger cellelinjen som skal brukes i eksperimentet. Bruk veiviseren til å velge prosjektet og merke den satsvise jobben som skal brukes. Klikk pilhodet mot høyre, og naviger til neste side i veiviseren for å velge prosesstrinnet som skal utføres.På den siste siden i veiviseren planlegger du eksperimentet og angir de riktige parameterne detaljer variabler som er nødvendige for å kjøre metoden. Klikk deretter OK. Etter å ha lastet et 50 milliliter rør med den menneskelige IPS-cellesuspensjonen, laster du belagte kulturplater for å motta cellene på hyllen og utføre såing av plater fra rørmetoden. For å telle cellene i Brightfield imaging cytometer, lager du automatisk en 384-brønns telleplate med cellefjæring på dekk og bruker robotarmen til å overføre 384-brønntellingsplaten fra decket til Brightfield imaging cytometer.Etter telling vil systemet returnere platen til sin opprinnelige posisjon og overføre en belagt kultur eller analyseplate fra hyllen til pipetteringsdekket. Systemet vil da så cellene i det brukerdefinerte nummeret og volumene som passer for platen og blandes ved pipettering. Etter såing vil platen bli flyttet til shakeren på dekk i 10 sekunder ved 500 omdreininger per minutt for celledistribusjon før den overføres til karbondioksidinkubatoren.For å vurdere den automatiserte samløpet, utfør sjekkkonfluensmetoden og velg en batch som inneholder minst én kulturplate og ingen analyseplater. I delen parameterdetaljer angir du iPSCf_2020 for bildeanskaffelse i bildeanalyseinnstillingene. Systemet vil da overføre den første platen fra inkubatoren til Brightfield imaging cytometer og bilde celle samløpet.Hvis du vil endre cellekultur eller analyseplatemedier, utfører du medieendringen av kulturplater-metoden og velger en batch som bare inneholder kulturplater. Systemet vil overføre platene til dekk og vippe platene for å tillate aspirasjon av supernatant. Det supernatante vil bli kassert til avfallsinnsamlingsmodulen og kast spissene og 12 milliliter friskt medium vil bli lagt til hver plate.Systemet vil deretter re-lokke platene og returnere platene til cellekulturinkubatoren. Alternativt, for å endre medium av analyseplater, utføre media endring av analyseplater metode. Hvis du vil subcultivate cellene, utfører du subcultivation av tilhengerceller metoden og velg batch som inneholder kulturplater som trenger subcultivation.Etter å ha kastet mediet, vil systemet vaske cellene en gang med åtte milliliter PBS per plate før du legger til åtte milliliter på 0,5 millimolar EDTA til cellene. Etter åtte minutter på dekk med vippealternativ, vil EDTA bli erstattet med 12 milliliter friskt medium per plate. Systemet vil riste platene på 2000 omdreininger per minutt i ett minutt for å løsne koloniene før de triturerer cellene med fem sykluser med pipettering for å bryte opp koloniene i 50 til 80 mikron klumper.Cellene vil da bli overført til et 50 milliliter rør på dekk før de seeding dem i en en-til-syv splitt ratio. For automatisert høyt innhold, høy gjennomstrømning celleavbildning, utføre bildemetoden og velge en batch som inneholder minst én analyseplate og ingen kulturplater. Systemet vil deretter overføre en analyseplate til det automatiserte konfokale mikroskopet for bildebehandling.Pass på at du velger riktig batch- og plate-ID-er mens du utfører de nødvendige prosesstrinnene. HiPSC-kulturene bør overvåkes daglig for vekst og analyseres for deres prosentandel av samløpet i Brightfield imaging cytometer. Etter passaging og manuell eller automatisert systemkultur, cellene viser en typisk stamcelle og pluripotency markør uttrykk.Nevroner differensiert i det automatiserte kultursystemet viser en lignende morfologi og nevronal nettverksorganisasjon til nevroner dyrket manuelt. Etter seks dager med differensiering er automatisk differensierte kortikale nevroner positive for nevronspesifikke klasse III beta-tubulin og øvre kortikale lagmarkøruttrykk. Etter åtte dager uttrykte cellene også mikrotubule-assosiert protein 2, nevrale celleadhesjonsmolekylet og synapsin I, samt kortikale nevronmarkører.Svært lavt eller ingen uttrykk for disse markørene observeres i hiPSC. Dette systemet kan også brukes til å etablere en levende celle automatisert neuritt utvekst analyse som gjør at neurite lengder kan måles over 11 dager med differensiering uten manuell inngripen. Ved hjelp av det automatiserte kultursystemet til å utføre mellomstore endringer over en 65-dagers kulturperiode forenkler hiPSC differensiering i midbrain dopaminerge nevroner med forventet cellulær organisasjon og morfologi.I tillegg til neurite utvekst, andre automatiserte fenotypiske analyser som er relevante for å studere nevrodegenerasjon, for eksempel TDP-43 translokasjon RNA foci og alfa-synuclein fibril opptak, kan utforskes ved hjelp av denne høye gjennomstrømningen, høyt innhold format.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Velge og isolere kolonier av menneskeskapte pluripotent stamceller omprogrammert fra voksne Fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Menneskelige Somatiske celler i Utførte pluripotent stamceller (iPSCs) Bruke retrovirale Vector med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Utarbeidelse av mus embryonale fibroblast celler Egnet for dyrking humane embryonale og Induced pluripotent stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Rask og effektiv produksjon av nerveceller fra menneskelige pluripotente stamceller i en Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: En Differensiering Protokoll fra mater-frie menneskeskapte pluripotent stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelig indusert pluripotent stamceller fra menneskelige somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternative Kulturer til human pluripotent Stem Cell produksjon, vedlikehold, og Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Derivasjon og karakterisering av et transgen fritt menneskeskapte pluripotent Stem Cell Line og Omgjøring til Definerte Klinisk-grade betingelser

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...