Name: automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Os autores reconhecem com gratidão os pacientes e seus familiares que contribuíram com o biomamaterial para este estudo. As linhas de células utilizadas no estudo foram da coleção NINDS com Rutgers (ND41865 como iPS#1) e do laboratório do Dr. Tilo Kunath (iPS#2). Este trabalho é apoiado em parte pela NoMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, um Programa Conjunto da UE - Pesquisa de Doenças Neurodegenerativas (JPND) (PH); A iniciativa DZNE I2A (AD); PD-Strat, um projeto financiado pela ERA-Net ERACoSysMed (PH) e a Foundational Data Initiative for Parkinson's Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). Foundin-PD faz parte do programa PATH to PD da Fundação Michael J. Fox. Os autores agradecem a Steven Finkbeiner e Melanie Cobb (Gladstone Institutes) por contribuírem para o estabelecimento do protocolo manual de diferenciação de neurônios mDA e Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) pela assistência na configuração de análise de crescimento de neurite.

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases.">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li><li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease.">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li><li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions.">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647 (2015).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System.">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+derivation,+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li><li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells.">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling.">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PloS one. 8 (3), 59252 (2013).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li><li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology,+autophagy,+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons.">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death &amp; disease. 6, 1811 (2015).</li><li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2++Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation.">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li><li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Huntington's+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics,+Morphology,+and+Maturation.">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimerBank:+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification.">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, 792 (2010).</li></ol>

Não temos nada para revelar.

Introduzimos um sistema automatizado de cultura celular com recursos integrados de imagem para a padronização da cultura hiPSC e diferenciação neuronal. Devido à mínima intervenção do usuário, a variação experimental é baixa garantindo a reprodutibilidade dos fenótipos celulares durante a diferenciação. O agendador baseado em calendário apoia a organização e a paraleloização dos experimentos e permite um alto grau de flexibilidade no momento em que os experimentos são realizados. Os métodos existentes podem ser facilmente adaptados e o espectro dos métodos disponíveis pode ser aumentado. Além disso, um grande número de formatos de placas de ensaio pode ser usado adicionando à flexibilidade deste sistema. O sistema mínimo composto por uma incubadora de CO2, um braço robótico, um citômetro celular de campo brilhante e uma estação de manuseio líquido forma a unidade básica necessária para a cultura e diferenciação hiPSC, com custos acessíveis para laboratórios de pesquisa acadêmica. A combinação do sistema automatizado de cultura celular com um sistema automatizado de armazenamento de -20 °C para armazenamento de compostos, bibliotecas RNAi ou bibliotecas CRISPR/Cas9, e a integração de um microscópio de alto teor/alto rendimento permitem a execução de triagens fenotípicas.
No presente estudo, o sistema automatizado de cultura celular utilizou pontas descartáveis e a mídia cultural foi reabastecida manualmente no reservatório, limitando assim o uso da estação de manuseio líquido para mudanças de mídia e outros processos culturais especialmente da noite para o dia. Para contornar essa limitação, os métodos podem ser ajustados ao uso de agulhas em vez de pontas descartáveis e, após a instalação de conexões de tubo entre linhas de mídia e sacos de mídia armazenados em uma geladeira, os reservatórios de mídia podem ser automaticamente recarregados com mídia fresca pré-aquecida por elementos aquecedores. Isso reduziria as interferências dos usuários causadas pelo reabastetamento manual de dicas, mídia de cultura e trocas de reservatórios.
Nosso sistema automatizado de cultura celular oferece várias vantagens. Um deles é o sistema de rastreamento de código de barras. As placas carregadas no sistema são identificadas por um código de barras único que é lido e salvo pelo sistema que permite o rastreamento de amostras durante e após a execução do método. Outra vantagem é a possibilidade de criar projetos específicos para usuários. Aqui, placas de cultura carregadas no sistema podem ser atribuídas a um projeto específico e agrupadas em lotes. A estruturação em lotes simplifica a execução do mesmo procedimento em todas as placas de um determinado lote, uma vez que nenhuma placa individual precisa ser selecionada. Além disso, um editor de classe líquida permite ajustar a velocidade e altura da tubulação, bem como a aspiração e os parâmetros de distribuição para cada etapa de transferência líquida. Cada processo é documentado em arquivos de log permitindo refazer quais tarefas foram executadas para uma determinada cultura ou placa de ensaio.
Neurônios e outros tipos de células derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) são ferramentas in vitro úteis para estudar os mecanismos de doenças neurodegenerativas em populações específicas de pacientes (por exemplo, neurônios dopaminérgicos para doença de Parkinson) oferecendo a possibilidade de exames medicamentosos personalizados. A culturing hiPSC é muito intensiva e exige pessoas treinadas para executar protocolos complexos de diferenciação, geralmente limitados à produção em baixa escala. Adaptamos a cultura livre de alimentadores do hiPSC a uma cultura automatizada e implementamos dois protocolos de diferenciação neuronal, um protocolo rápido de diferenciação de neurônios corticais baseado na superexpressão NGN2 sob um promotor tet-on10,11, e um protocolo de longo prazo baseado em pequenas moléculas para geração de neurônios dopaminérgicos de cérebro médio (mDA)13. A transferência direta e a reprodutibilidade dos protocolos manuais de cultura e diferenciação torna o sistema de cultura automatizado muito útil. O iPSC humano cultivado no sistema de cultura celular automatizada mostrou morfologia consistente de células-tronco e expressou importantes marcadores de pluripotência, reprodutíveis entre experimentos independentes. Além disso, a automação do protocolo de cultura hiPSC favoreceu a cultura e a expansão de um número maior de linhas celulares em paralelo. Verificações automatizadas de confluência programadas para serem realizadas durante a noite economizam tempo deixando o sistema livre durante o dia para etapas de processo a jusante realizadas quando o usuário estava em laboratório (por exemplo, colheita de células ou replação manual para diferenciações). Ao atingir o limiar de confluência definido pelo usuário, as células são passaged e replated em placas extracelulares revestidas de matriz disponíveis no empilhador do sistema automatizado de cultura celular. Cada rodada de passagem leva cerca de 70 minutos e gera quatro placas de 1 poço a partir de uma placa-mãe, o que se traduz em uma capacidade de 20 passagens em um dia.
A automação do protocolo de diferenciação NGN2 foi feita com sucesso e permitiu a geração de uma população homogênea de células neuronais em diferentes passagens e comparável a diferenciações manuais. Além disso, os custos experimentais para estudos de triagem em larga escala envolvendo múltiplas linhas celulares ou experimentos de triagem com milhares de condições/compostos de teste seriam reduzidos devido a rápidas diferenciações. Leituras econômicas e de alto rendimento, incluindo medidas de crescimento de neurite de células vivas, podem ser facilmente desenvolvidas, implementadas e usadas como leituras fenotípicas para modelagem de doenças, como mostrado anteriormente14,15,16. Assim, adaptamos ainda mais o protocolo NGN2 usando células precursoras neurais derivadas de pequenas moléculas (smNPC) que constitutivamente super-expressam GFP. As células smNPC oferecem outras vantagens, incluindo custos reduzidos com mídia de cultura (um terço do custo com cultura iPSC) e tempo necessário para ampliar os experimentos. Os rendimentos celulares do smNPC são 7 a 10 vezes maiores do que os obtidos com iPSC. Os neurônios diferenciados foram monitorados e imagens com sucesso por vários dias usando um processo de imagem totalmente automatizado sem a necessidade de manchas manuais de anticorpos ou rotulagem química, economizando custos e tempo necessários para procedimentos manuais, incluindo a imagem por si só. A imagem atual de 60 poços internos de uma placa de 96 poços leva cerca de 16 minutos por placa quando 25 campos por poço são imagens, o que significa que os dados para uma triagem baseada em imagem para 1000 compostos, poderiam ser adquiridos e analisados em um dia. No futuro, essa leitura poderia ser usada em estudos de triagem composta para o resgate de defeitos de crescimento de neurite.
Além disso, demonstramos também a transferência de um protocolo de diferenciação manual para geração de neurônios dopaminérgicos de cérebro médio (mDA) a partir do iPSC. Este pequeno protocolo de diferenciação baseado em moléculas leva 65 dias e é intensivo em mão-de-obra por causa das múltiplas etapas de replação e mudanças frequentes na mídia, principalmente a cada 2 dias, o que limita a produção de neurônios mDA a poucas linhas iPSC ao mesmo tempo. O protocolo automatizado de diferenciação mDA tem a grande vantagem de aumentar a diferenciação para dezenas de linhas iPSC. Até 30 linhas celulares poderiam ser diferenciadas em paralelo. Como a diferenciação é baseada principalmente em mudanças de mídia, quase todo o processo de diferenciação pode ser conduzido sem interferência humana. Usando o programador baseado em calendário do sistema automatizado, poderíamos planejar as mudanças de mídia de acordo com as etapas de diferenciação. Uma limitação de trabalhar com um número tão grande de linhas celulares e placas de cultura foi a impossibilidade de realizar alterações na mídia durante a noite. A principal razão é o fato de que nosso sistema está configurado para usar dicas descartáveis e recarga manual de mídias culturais que exigem que um usuário em laboratório execute esta etapa manual. Para facilitar o processo de troca de mídia, as placas carregadas no sistema foram atribuídas a um projeto e agrupadas em lotes. O tamanho do lote foi então adaptado ao número de dicas descartáveis e volume de mídia de cultura disponível. Como discutido acima, essa limitação pode ser facilmente superada pela implementação de agulhas reutilizáveis/laváveis e recarga automatizada de mídia. A troca/replação automatizada de células, como mostrado para iPSC, é uma das conveniências oferecidas pelo nosso sistema automatizado de cultura celular. Testamos a replação automatizada de neurônios mDA no dia 25 de diferenciação. No entanto, a dissociação dos neurônios mDA requer uma incubação mais longa (40 minutos) com a enzima dissociação do que o iPSC (8 min) estendendo o processo automatizado de replação para mais de 1 h por linhas celulares. Como consequência, a replação automatizada de 30 linhas celulares no mesmo dia tornou-se impossível. Acelerar outras etapas durante a replação automatizada (transporte de placas, pipetting) e adaptar o sistema ao uso de agulhas e linha de mídia que torna possível um trabalho noturno resolveria essa limitação. Apesar das desvantagens, poderíamos transferir com sucesso o protocolo manual para uma diferenciação automatizada de neurônios mDA produzindo culturas com quantidades substanciais de células positivas MAP2 (neurônio) e TH (neurônios mDA).
Diferenciar dezenas de linhas celulares iPSC em paralelo é de grande interesse em projetos que investiguem os mecanismos moleculares de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson. No entanto, concluir tarefas mais rapidamente com menos erros e a custos reduzidos é um grande desafio. Devido à automação dos protocolos aqui apresentados (iPSC, smNPC e neurônio mDA), poderíamos acelerar, reduzir os custos e aumentar a reprodutibilidade em nossos projetos. O desenvolvimento de projetos como o FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) envolvendo centenas de linhas celulares de pacientes mostra necessidade de protocolos automatizados de cultura e diferenciação. Nossas perspectivas futuras incluem a transferência de modelos manuais de cultura celular 3D (3D) para o sistema automatizado. Pequenas adaptações nas configurações de definição da placa e o uso de adaptadores permitirão o uso de placas comerciais ou personalizadas e câmaras microfluídicas necessárias para as culturas 3D. Além disso, a implementação de um modelo automatizado de imagem sem rótulos nos permitirá acompanhar o crescimento neuronal em tempo real e traduzir mudanças no crescimento do neurite, organização dos neurônios e morte celular em uma melhor compreensão dos mecanismos da doença.

As células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) são auto-renovadas e podem se diferenciar em quase qualquer tipo de célula adulta. Essas características fazem do hiPSC uma ferramenta útil para modelagem de doenças em pesquisa básica e descoberta de medicamentos1. O iPSC humano mantém o fundo genético do doador que permite a deriva de tipos celulares relevantes para doenças que são mais afetados/envolvidos no curso da doença, por exemplo, diferentes subtipos neuronais para doenças neurodegenerativas2,3. Além disso, o hiPSC supera algumas das limitações dos modelos de superexpressão animal e celular, modelando doenças em um contexto humano e níveis de expressão fisiológica de proteína, e provou ser um ativo valioso na modelagem de doenças que vão desde distúrbios monogênicos, complexos e epigenéticos, bem como doenças de início tardio4.
Apesar desses benefícios e oportunidades, várias limitações do hiPSC ainda precisam ser abordadas. Os atuais protocolos de cultura e diferenciação hiPSC não são econômicos, difíceis de padronizar e são intensivos em mão-de-obra. As etapas manuais de cultura podem resultar em alta variabilidade nos rendimentos e fenótipos devido a diferenças de crescimento e diferenciação espontânea do hiPSC. Portanto, a variação dependente de experimentadores precisa ser reduzida através da implementação de técnicas de manuseio mais padronizadas e da simplificação de protocolos que podem ser alcançados usando a automação5. O estabelecimento de protocolos automatizados de cultura e diferenciação hiPSC estabelecerá padrões comuns para projetos de pesquisa acadêmica e industrial, além de permitir a geração de modelos de doenças biologicamente relevantes e resultados mais reprodutíveis.
Trabalhos anteriores tentaram automação das culturas hiPSC6,7,8, mas seus protocolos foram restritos a formatos específicos de placas de cultura celular dependentes do sistema e sem adaptabilidade a diferentes formatos de ensaio. Tais sistemas são úteis na maior parte das células, mas podem não ser adequados para diferenciação automatizada em tipos de células desejadas, fenotipagem de doenças e fins de triagem. Além disso, uma plataforma automatizada em larga escala para derivação de fibroblasto, geração de hiPSC e diferenciação foi descrita9, mas em uma escala que só pode ser alcançada por laboratórios de alto rendimento dedicados à produção de linhas que parecem atraentes, mas podem ser inacessíveis para muitos laboratórios acadêmicos.
Desenvolvemos um sistema de cultura celular totalmente automatizado baseado em uma estação de manuseio líquido em um ambiente filtrado de Particulado de Alta Eficiência (HEPA) em conjunto com uma incubadora co2 de grande capacidade, um citómetro de imagem de campo brilhante e um braço robótico para transporte de placas. Esses componentes fornecem a base para a cultura e diferenciação hiPSC estáveis e reprodutíveis. Complementamos o sistema com um sistema automatizado de armazenamento de -20 °C para armazenamento composto ou vírus e um imager de células ao vivo confocal de disco de alta velocidade. Protocolos personalizados foram gerados permitindo semeadura automatizada de células, alterações de mídia, verificações de confluência, expansão celular e geração de placas de ensaio com tratamento amostral e imagem de placa, tornando o sistema compatível com triagens de alto conteúdo/alto rendimento. O sistema automatizado de cultura celular e imagem é operado usando o software de controle e a interface gráfica de usuário (GUI) feita sob medida. A GUI permite que os usuários importem arquivos CSV contendo parâmetros específicos da linha celular necessários para a execução do método. Além disso, a GUI permite agendar inúmeros experimentos em qualquer sequência usando a visão de calendário incorporado, permitindo assim o controle total do tempo quando cada método é iniciado.
Nosso sistema automatizado de cultura celular utiliza velocidades padronizadas de pipetação, tempos de passagem, limiares de confluência, densidades de semeadura e volumes médios com a flexibilidade para cultivar células em uma variedade de formatos de placas (formato de placa de 96, 48, 24, 12, 6 ou 1-bem). Adaptamos um protocolo de diferenciação de curto prazo recentemente publicado para converter hiPSC em neurônios que podem produzir neurônios positivos TUBB3 em 6 dias10,11. Também estabelecemos a diferenciação automatizada e a imagem de células precursoras neurais de pequenas moléculas (smNPC) em neurônios que expressam constitutivamente o GFP sob o EF1a promoter12 e o iPSC em neurônios dopaminérgicos de cérebro médio (mDA), adaptando um protocolo de inibição dual-SMAD publicado anteriormenteque produz neurônios mDA dentro de 65 dias.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287</td>
			<td>1 to 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Oct3/4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>1 to 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti- TUBB3</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>1 to 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-BRN2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-TH</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-74421</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei counterstaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechest 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1 to 8,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent TapeStation system</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>4200</td>
			<td>Automated electrophoresis 
			for DNA and RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated -20 &#176;C storage system</td>
			<td>Hamilton Storage 
			Technologies</td>
			<td>Sample Access Manager 
			(SAM -20C, 3200 series)</td>
			<td>Storage of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode reader</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>Barcode Reader Orbit</td>
			<td>Barcode scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield cell cytomat</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Confluence check and 
			cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Automated confocal 
			microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for cell cultures</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 24 C, CU</td>
			<td>12 stackers pitch 28 mm, 
			12 stackers pitch 23 mm 
			(total of 456 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for thawing samples</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 2-LIN, 60 DU 
			(Drying Unit)</td>
			<td>2 stackers pitch 28 mm 
			(total of 42 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Hood Flow Star UV</td>
			<td>Modified by Hamilton 
			Robotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling station</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Microlab Star</td>
			<td>Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml 
			and 96 Channel MPH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>188211APE</td>
			<td>Media/reagents reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water system</td>
			<td>Veolia Water</td>
			<td>ELGA PURELAB Classic</td>
			<td>Provides pure water for 
			needle wash station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Real-Time 
			PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>QSTUDIO12KOA</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Rackrunner</td>
			<td>Transport of plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turn table</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Turn Table</td>
			<td>Adjust plate orientiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterruptible power supply</td>
			<td>APC</td>
			<td>Smart UPS RT Unit, 
			10000 VA Power supply</td>
			<td>Backup power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO-pipettes</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4500</td>
			<td>Electronic pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4453545</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well culture plate (84 cm2)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td>Nunc OmniTray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates (9.6 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate (3.9 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate (0.32 cm2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005558</td>
			<td>CellCarrier-96 Black plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 50-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235987</td>
			<td>50-uL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 300-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235985</td>
			<td>300-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 1000-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235939</td>
			<td>1000-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 5-mL</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>184022</td>
			<td>5-mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 15-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>15-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 50-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>50-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene cryogenic 2.0 mL vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V5007</td>
			<td>Cryovials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_hEF1a_rtTA3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61472</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61474</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sequence (forward)</td>
			<td>Sequence (reverse)</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 (ID 4505967a1)</td>
			<td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td>
			<td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG (ID 153945815c3)</td>
			<td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td>
			<td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REX1 (ID 89179322c1)</td>
			<td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td>
			<td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2 (ID 87578393c1)</td>
			<td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>
			<td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN2 (ID 380254475c1)</td>
			<td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td>
			<td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUX2 (ID 291045458c2)</td>
			<td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td>
			<td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td>
			<td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td>
			<td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td>
			<td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td>
			<td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH</td>
			<td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td>
			<td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td>
			<td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Housekeeping genes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td>
			<td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAZ1</td>
			<td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td>
			<td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLPO</td>
			<td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td>
			<td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPL13A</td>
			<td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td>
			<td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Use concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 - 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC culture medium 
			(Essential 8 Flex medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - NGN2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.909 mL (50 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331093</td>
			<td>484.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL ( 2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>0.25 mL (2.5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - SRM medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.5 mL (55 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>409.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement 
			(serum replacement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>75 mL (15%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - N2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>475 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL(1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline (dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate 
			magnesium (AA2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>64 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic factor-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMA)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833-10MG</td>
			<td>0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>420220-10MG</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13197</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid (AA1)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189 (LDN)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11802</td>
			<td>100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (Purm)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Hedgehog/Shh (C24II) 
			N-Terminus (SHH)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1845-SH</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542 (SB)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13031</td>
			<td>10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor type &#223;3 
			(TGF&#223;3)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>243-B3</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10005583</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell dissociation reagent 
			(StemPro Accutase)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11575020</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation and cDNA kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Rneasy MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Trizol lysis buffer (RNA 
			lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080-085</td>
			<td>SuperScript III Reverse 
			Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Framework (CCF) 
			(Graphical user interface, GUI)</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>User interface for the automated system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellPathFinder software 
			(image analysis software 1)</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellPathfinder HCS Software</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager Measurement System</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>Included with 
			CellVoyager 7000</td>
			<td>Microscope controlling 
			software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus software 
			(image analysis software 2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloud based qPCR app</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Themo Fisher cloud</td>
			<td>Analysis software for 
			qRT-PCR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus software</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>VENUS Two Dynamic 
			Schedular 5.1 Software</td>
			<td>Controlling software for the 
			automated system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring

A cultura manual e os protocolos de diferenciação para células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) são difíceis de padronizar, mostram alta variabilidade e são propensos à diferenciação espontânea em tipos de células indesejadas. Os métodos são intensivos em mão-de-obra e não são facilmente favoráveis a experimentos em larga escala. Para superar essas limitações, desenvolvemos um sistema automatizado de cultura celular acoplado a um sistema de imagem de alto rendimento e implementamos protocolos para manter múltiplas linhas hiPSC em diferenciação paralela e neuronal. Descrevemos a automação de um protocolo de diferenciação de curto prazo usando a superexpressão neurogenin-2 (NGN2) para produzir neurônios corticais derivados do hiPSC dentro de 6\u20128 dias, e a implementação de um protocolo de diferenciação de longo prazo para gerar neurônios dopaminérgicos do cérebro médio derivados do cérebro (mDA) derivados de hiPSC dentro de 65 dias. Além disso, aplicamos a abordagem NGN2 a uma pequena célula precursora neural derivada de moléculas (smNPC) transduzidas com lentivírus GFP e estabelecemos um ensaio de crescimento de neurite automatizado de células vivas. Apresentamos um sistema automatizado com protocolos adequados para a cultura hiPSC de rotina e diferenciação em neurônios corticais e dopaminérgicos. Nossa plataforma é adequada para cultura viva-voz de longo prazo e alto teor/alta taxa de hiPSC com base em hiPSC, exibições RNAi e CRISPR/Cas9 para identificar novos mecanismos de doença e alvos de drogas.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Mostramos a automação das culturas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) e diferenciações neuronais compatíveis com imagens e análises automatizadas.

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

O objetivo geral deste estudo é mostrar como implementar procedimentos automatizados para a cultura e diferenciação de células IPS humanas em linhagens neuronais, bem como suas imagens automatizadas. Procedimentos automatizados padronizados permitem baixa variação experimental, garantindo alta reprodutibilidade fenotípica. Além disso, o sistema pode ser adaptado para o desenvolvimento de novos protocolos.Os procedimentos serão Joachim Tager e Elisangela Bressan, pós-doutores do nosso laboratório. Na interface gráfica do usuário do sistema automatizado, clique na visualização do processo de instrumento de recurso e selecione o processo de instrumento de recurso. Clique no processo de instrumento de execução e execute os processos hepa e recarga executados.Selecione os recursos a serem carregados, abra a porta e carregue as placas de cultura celular e as pontas descartáveis nas posições apropriadas, conforme indicado pelas imagens popup. Em seguida, descontaminar a porta com 70% de etanol antes de fechar e executar o processo de descontaminação. O sistema será esterilizado por radiação UV por 30 minutos.Para carregar as placas com meio de cultura ou reagente de dissociação, execute a etapa do capô hepa e abra a porta da estação de manuseio líquido. Após a descontaminação com 70% de etanol, coloque os reservatórios no convés para a posição atribuída e descobrilá-los. Feche a porta da estação de manuseio de líquidos e execute o processo de instrumento de recurso InitHepaHood para desligar o capô HEPA.Para executar um método de cultura automatizado, na visualização do calendário da interface gráfica do usuário, clique em adicionar etapa de processo e selecione a linha celular a ser usada no experimento. Use o assistente para selecionar o projeto e marque o lote a ser usado. Clique na seta direita e navegue até a próxima página do assistente para selecionar a etapa do processo a ser executada.Na última página do assistente, agende o experimento e defina os parâmetros apropriados para detalhar as variáveis necessárias para a execução do método. Em seguida, clique em OK. Depois de carregar um tubo de 50 mililitros com a suspensão celular IPS humana, carregue placas de cultura revestidas para receber as células na prateleira e execute a semeadura de placas a partir do método de tubos. Para contar as células do cítmetro de imagem Brightfield, prepare automaticamente uma placa de contagem de 384 poços com suspensão celular no convés e use o braço robótico para transferir a placa de contagem de 384 poços do convés para o citómetro de imagem Brightfield.Após a contagem, o sistema devolverá a placa à sua posição original e transferirá uma cultura revestida ou placa de ensaio da prateleira para o deck de tubulação. Em seguida, o sistema semeará as células no número definido pelo usuário e volumes adequados para a placa e misturará por pipetação. Após a semeadura, a placa será movida para o agitador no convés por 10 segundos a 500 rotações por minuto para distribuição celular antes de ser transferida para a incubadora de dióxido de carbono.Para avaliar a confluência automatizada, execute o método de confluência de verificação e selecione um lote que contenha pelo menos uma placa de cultura e nenhuma placa de ensaio. Na seção de detalhes dos parâmetros, digite iPSCf_2020 para aquisição de imagens nas configurações de análise de imagem. Em seguida, o sistema transferirá a primeira placa da incubadora para o cítmetro de imagem Brightfield e a imagem da confluência celular.Para alterar a cultura celular ou a mídia de placas de ensaio, execute a mudança de mídia do método de placas de cultura e selecione um lote contendo apenas placas de cultura. O sistema transferirá as placas para o convés e inclinará as placas para permitir a aspiração do supernatante. O supernasário será descartado no módulo de coleta de resíduos e descartará as pontas e 12 mililitros de meio fresco serão adicionados a cada placa.Em seguida, o sistema recobrirá as placas e devolverá as placas à incubadora de cultura celular. Alternativamente, para alterar o meio das placas de ensaio, execute a mudança de mídia do método de placas de ensaio. Para subcultivar as células, execute a subcultivação do método de células aderentes e selecione o lote contendo as placas de cultura que precisam de subcultivação.Depois de descartar o meio, o sistema lavará as células uma vez com oito mililitros de PBS por placa antes de adicionar oito mililitros de 0,5 mililitros EDTA às células. Após oito minutos no convés com opção de inclinação, o EDTA será substituído por 12 mililitros de meio fresco por placa. O sistema vai agitar as placas a 2.000 revoluções por minuto durante um minuto para desalojar as colônias antes de triturar as células com cinco ciclos de tubulação para quebrar as colônias em 50 a 80 mícrons.As células serão então transferidas para um tubo de 50 mililitros no convés antes de semeá-las em uma proporção de uma a sete divisões. Para conteúdo automatizado de alto conteúdo, imagens de células de alto rendimento, execute o método de imagem e selecione um lote que contenha pelo menos uma placa de ensaio e nenhuma placa de cultura. Em seguida, o sistema transferirá uma placa de ensaio para o microscópio confocal automatizado para imagens.Certifique-se de selecionar os IDs de lote e placa corretos enquanto executa as etapas de processo necessárias. As culturas hiPSC devem ser monitoradas diariamente para o crescimento e analisadas por sua porcentagem de confluência no citômetro de imagem Brightfield. Após a passagem e a cultura manual ou automatizada do sistema, as células exibem uma expressão típica de marcador de células-tronco e pluripotência.Neurônios diferenciados no sistema de cultura automatizada demonstram uma organização de morfologia e rede neuronal semelhante aos neurônios cultivados manualmente. Após seis dias de diferenciação, os neurônios cortical automaticamente diferenciados são positivos para a beta-tubulina de classe III específica do neurônio e a expressão do marcador de camada cortical superior. Após oito dias, as células também expressaram proteína associada a microtúbulos 2, a molécula de adesão de células neurais e a sinapssina I, bem como marcadores de neurônio cortical.Muito baixo ou nenhuma expressão desses marcadores é observada em hiPSC. Este sistema também pode ser usado para estabelecer um ensaio de extensão de neurite automatizado de células vivas que permite que os comprimentos de neurite sejam medidos ao longo de 11 dias de diferenciação sem intervenção manual. O uso do sistema de cultura automatizado para realizar mudanças médias durante um período de cultura de 65 dias facilita a diferenciação hiPSC em neurônios dopaminérgicos de cérebro médio com a organização celular e morfologia esperadas.Além do crescimento do neurite, outros ensaios fenotípicos automatizados relevantes para estudar neurodegeneração, por exemplo, focos de RNA de translocação TDP-43 e captação fibril alfa-sinucleína, podem ser explorados usando este alto rendimento, alto formato de conteúdo.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos humanos com o Lentivirus TF Stemgent Humanos Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Biologia

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramação de células somáticas humanas em células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando vetor retroviral com GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Culturas alternativas para produção, manutenção e análise genética de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...