Name: automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Los autores reconocen con gratitud a los pacientes y sus familias que contribuyeron con biomateriales para este estudio. Las líneas de células utilizadas en el estudio eran de la colección NINDS con Rutgers (ND41865 como iPS-1) y el laboratorio del Dr. Tilo Kunath (iPS-2). Este trabajo cuenta con el apoyo en parte de la Fundación NOMIS (PH), RiMod-FTD, un Programa Conjunto de la UE - Investigación de Enfermedades Neurodegenerativas (JPND) (PH); La iniciativa DZNE I2A (AD); PD-Strat, un proyecto financiado por ERA-Net ERACoSysMed (PH) y la Iniciativa de Datos Fundamentales para la Enfermedad de Parkinson (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD es parte del programa PATH to PD de The Michael J. Fox Foundation. Los autores agradecen a Steven Finkbeiner y Melanie Cobb (Institutos Gladstone) por contribuir al establecimiento del protocolo manual de diferenciación de neuronas mDA y Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) por la asistencia en la configuración del análisis de crecimiento de neurite.

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	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases.">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li><li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease.">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li><li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions.">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647 (2015).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System.">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+derivation,+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li><li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells.">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling.">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PloS one. 8 (3), 59252 (2013).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li><li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology,+autophagy,+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons.">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death &amp; disease. 6, 1811 (2015).</li><li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2++Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation.">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li><li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Huntington's+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics,+Morphology,+and+Maturation.">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimerBank:+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification.">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, 792 (2010).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Introducimos un sistema automatizado de cultivo celular con capacidades de imagen integradas para la estandarización del cultivo hiPSC y la diferenciación neuronal. Debido a la mínima intervención del usuario, la variación experimental es baja asegurando la reproducibilidad de los fenotipos celulares durante la diferenciación. El programador basado en calendario admite la organización y la paralelización de experimentos y permite un alto grado de flexibilidad en el momento en que se llevan a cabo los experimentos. Los métodos existentes se pueden adaptar fácilmente y se puede aumentar el espectro de métodos disponibles. Además, se puede utilizar un gran número de formatos de placa de ensayo que añaden flexibilidad a este sistema. El sistema mínimo que consiste en una incubadora deCO2, un brazo robótico, un citómetro de celdas de campo brillante y una estación de manipulación de líquidos forma la unidad básica necesaria para la cultura y diferenciación hiPSC, con costos asequibles para los laboratorios de investigación académica. La combinación del sistema automatizado de cultivo celular con un sistema automatizado de almacenamiento de -20 oC para el almacenamiento de compuestos, bibliotecas RNAi o bibliotecas CRISPR/Cas9, y la integración de un microscopio de alto contenido/alto rendimiento permiten la ejecución de exámenes fenotípicos.
En el estudio actual, el sistema automatizado de cultivo celular utilizó puntas desechables y los medios de cultivo se reabastecieron manualmente en el depósito, limitando así el uso de la estación de manipulación de líquidos para cambios en los medios y otros procesos de cultivo especialmente durante la noche. Para eludir esta limitación, los métodos se pueden ajustar al uso de agujas en lugar de puntas desechables y, después de instalar conexiones de tubos entre las líneas de medios y bolsas de medios almacenadas en una nevera, los depósitos de medios se pueden rellenar automáticamente con medios frescos precalentados por los elementos del calentador. Esto reduciría las interferencias del usuario causadas por el llenado manual de puntas, medios de cultivo e intercambios de reservorios.
Nuestro sistema automatizado de cultivo celular ofrece varias ventajas. Uno es el sistema de rastreo de códigos de barras. Las placas cargadas en el sistema se identifican mediante un código de barras único que es leído y guardado por el sistema que permite el seguimiento de las muestras durante y después de la ejecución del método. Otra ventaja es la posibilidad de crear proyectos específicos para cada usuario. Aquí, las placas de referencia cultural cargadas en el sistema se pueden asignar a un proyecto específico y agruparse en lotes. La estructuración en lotes simplifica la ejecución del mismo procedimiento a todas las placas de un determinado lote, ya que no es necesario seleccionar placas individuales. Además, un editor de clases líquidas permite ajustar la velocidad y la altura del pipeteo, así como los parámetros de aspiración y dosificación para cada paso de transferencia de líquido. Cada proceso se documenta en archivos de registro que permiten volver a trazar qué tareas se han realizado para una referencia cultural o placa de ensayo determinada.
Las neuronas y otros tipos de células derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) son herramientas in vitro útiles para estudiar los mecanismos de las enfermedades neurodegenerativas en poblaciones específicas de pacientes (por ejemplo, neuronas dopaminérgicas para la enfermedad de Parkinson) que ofrecen la posibilidad de exámenes de drogas personalizados. El cultivo de hiPSC es muy intensivo en tiempo y exige que las personas capacitadas ejecuten protocolos complejos de diferenciación, generalmente limitados a la producción a baja escala. Adaptamos el cultivo libre de alimentadores de hiPSC a un cultivo automatizado e implementamos dos protocolos de diferenciación neuronal, un protocolo de diferenciación rápida de neuronas corticales basado en la sobreexpresión NGN2 bajo un promotor de tet-on10,11, y un protocolo a largo plazo basado en moléculas pequeñas para la generación de neuronas dopaminérgicas de cerebroinérgico medio (mDA)13. La transferencia directa y reproducibilidad de los protocolos manuales de cultura y diferenciación hace que el sistema de cultivo automatizado sea muy útil. El iPSC humano cultivado en el sistema automatizado de cultivo celular mostró una morfología constante de las células madre y expresó importantes marcadores de pluripotencia, reproducibles entre experimentos independientes. Además, la automatización del protocolo de cultivo hiPSC favoreció la cultura y la expansión de un mayor número de líneas celulares en paralelo. Comprobaciones automatizadas de confluencia programadas para realizarse durante la noche ahorrando tiempo dejando el sistema libre durante el día para los pasos del proceso descendente llevados a cabo cuando el usuario estaba en el laboratorio (por ejemplo, la cosecha de células o la replata manual para diferenciaciones). Al alcanzar el umbral de confluencia definido por el usuario, las células se distribuyen y se replatan en placas extracelulares recubiertas de matriz disponibles en el apilador del sistema automatizado de cultivo celular. Cada ronda de paso dura unos 70 minutos y genera cuatro placas de 1 pozo a partir de una placa principal, lo que se traduce en una capacidad de 20 pasajes en un día.
La automatización del protocolo de diferenciación NGN2 se realizó con éxito y permitió la generación de una población homogénea de células neuronales a través de diferentes pasajes y comparable a las diferenciaciones manuales. Además, los costos experimentales de los estudios de cribado a gran escala que implican múltiples líneas celulares o experimentos de cribado con miles de condiciones/compuestos de prueba se reducirían debido a las rápidas diferenciaciones. Las lecturas rentables y de alto rendimiento, incluidas las mediciones de crecimiento de neuritas en vivo, se pueden desarrollar, implementar y utilizar fácilmente como lecturas fenotípicas para el modelado de enfermedades, como se mostró anteriormente14,15,16. Por lo tanto, adaptamos aún más el protocolo NGN2 utilizando células precursoras neuronales derivadas de moléculas pequeñas (smNPC) que constituyen una GFP excesivamente expresiva. Las células smNPC ofrecen más ventajas, incluyendo costos reducidos con medios de cultivo (un tercio del costo con cultivo iPSC) y el tiempo necesario para ampliar los experimentos. Los rendimientos celulares de smNPC son 7 a 10 veces mayores que los obtenidos con iPSC. Las neuronas diferenciadoras fueron monitoreadas e imágenes con éxito durante varios días utilizando un proceso de imágenes totalmente automatizado sin la necesidad de tinciones manuales de anticuerpos o etiquetado químico, ahorrando costos y tiempo necesario para los procedimientos manuales, incluyendo la imagen por sí mismo. La imagen actual de los 60 pozos internos de una placa de 96 pozos tarda alrededor de 16 minutos por placa cuando se muestran 25 campos por pozo, lo que significa que los datos para una detección basada en imágenes para 1000 compuestos, podrían ser adquiridos y analizados en un día. En el futuro, esta lectura podría utilizarse en estudios de cribado compuestos para el rescate de defectos de crecimiento de neuritas.
Además, también demostramos la transferencia de un protocolo de diferenciación manual para generar neuronas dopaminérgicas de cerebro medio (mDA) a partir de iPSC. Este pequeño protocolo de diferenciación basado en moléculas toma 65 días y es laborioso debido a los múltiples pasos de replata y cambios frecuentes en los medios, principalmente cada 2 días, lo que limita la producción de neuronas mDA a pocas líneas iPSC al mismo tiempo. El protocolo automatizado de diferenciación mDA tiene la gran ventaja de ampliar la diferenciación a docenas de líneas iPSC. Se pueden diferenciar en paralelo hasta 30 líneas celulares. Dado que la diferenciación se basa principalmente en los cambios en los medios, casi todo el proceso de diferenciación se puede llevar a cabo sin interferencias humanas. Usando el programador basado en calendario del sistema automatizado, podríamos planificar los cambios de medios de acuerdo con los pasos de diferenciación. Una limitación de trabajar con un número tan grande de líneas celulares y placas de cultivo fue la imposibilidad de realizar cambios en los medios de comunicación durante la noche. La razón principal es el hecho de que nuestro sistema está configurado para el uso de puntas desechables y el llenado manual de medios de cultivo que requieren un usuario en el laboratorio para ejecutar este paso manual. Para facilitar el proceso de modificación de medios, las placas cargadas en el sistema se asignaron a un proyecto y se agruparon en lotes. El tamaño del lote se adaptó entonces al número de puntas desechables y al volumen de medios de cultivo disponibles. Como se mencionó anteriormente, esta limitación se puede superar fácilmente mediante la implementación de agujas reutilizables / lavables y el llenado automatizado de medios. El transeúnte/replating automatizado de células, como se muestra para iPSC, es una de las comodidades que ofrece nuestro sistema automatizado de cultivo celular. Hemos probado el replating automatizado de las neuronas mDA en el día 25 de diferenciación. Sin embargo, la disociación de las neuronas mDA requiere una incubación más larga (40 min) con la enzima de disociación que iPSC (8 min) extendiendo el proceso de replating automatizado a más de 1 h por línea celular. Como consecuencia, el replatado automatizado de 30 líneas celulares en el mismo día se hizo imposible. Acelerar otros pasos durante el replating automatizado (transporte de placas, pipeteo) y adaptar el sistema al uso de agujas y líneas de medios que haga posible un trabajo nocturno resolvería esta limitación. A pesar de los inconvenientes, podríamos transferir con éxito el protocolo manual a una diferenciación automatizada de las neuronas mDA que producen cultivos con cantidades sustanciales de células positivas MAP2 (neuronas) y TH (mDA).
Diferenciar docenas de líneas celulares iPSC en paralelo es de gran interés en proyectos que investigan los mecanismos moleculares de las enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, completar tareas más rápido con menos errores y a costos reducidos es un gran desafío. Debido a la automatización de los protocolos presentados aquí (iPSC, smNPC y mDA neurona), podríamos acelerar, reducir los costos y aumentar la reproducibilidad en nuestros proyectos. El desarrollo de proyectos como FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) que involucran cientos de líneas celulares para pacientes muestra la necesidad de protocolos automatizados de cultivo y diferenciación. Nuestras perspectivas futuras incluyen la transferencia de modelos manuales de cultivo celular 3 dimensional (3D) al sistema automatizado. Las adaptaciones menores en los ajustes de definición de placas y el uso de adaptadores permitirán el uso de placas comerciales o a medida y cámaras microfluídicas necesarias para los cultivos 3D. Además, la implementación de un modelo automatizado de imágenes sin etiquetas nos permitirá realizar un seguimiento del crecimiento neuronal en tiempo real y traducir los cambios en el crecimiento de la neurita, la organización de las neuronas y la muerte celular en una mejor comprensión de los mecanismos de la enfermedad.

Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) se autonuevan y pueden diferenciarse en casi cualquier tipo de célula adulta. Estas características hacen de hiPSC una herramienta útil para el modelado de enfermedades en la investigación básica y el descubrimiento de fármacos1. El iPSC humano conserva los antecedentes genéticos del donante que permiten derivar los tipos de células relevantes para la enfermedad que son más afectados /implicados en el curso de la enfermedad, por ejemplo, diferentes subtipos neuronales para enfermedades neurodegenerativas2,3. Además, hiPSC supera algunas de las limitaciones de los modelos de sobreexpresión animal y celular modelando enfermedades en un contexto humano y niveles de expresión de proteínas fisiológicas, y ha demostrado ser un valioso activo en el modelado de enfermedades que van desde trastornos monogénicos, complejos y epigenéticos, así como enfermedades de aparición tardía4.
A pesar de estos beneficios y oportunidades, todavía es necesario abordar varias limitaciones de la hiPSC. La cultura hiPSC actual y los protocolos de diferenciación no son rentables, difíciles de estandarizar y requieren mucho trabajo. Los pasos de cultivo manuales pueden dar lugar a una alta variabilidad en los rendimientos y fenotipos debido a las diferencias en el crecimiento y la diferenciación espontánea de hiPSC. Por lo tanto, la variación dependiente del experimentador debe reducirse mediante la implementación de técnicas de manipulación más estandarizadas y la simplificación de los protocolos que se pueden lograr mediante la automatización5. El establecimiento de protocolos automatizados de cultura y diferenciación de hiPSC establecerá estándares comunes para proyectos de investigación académica e industrial, y permitirá la generación de modelos de enfermedades biológicamente relevantes y resultados más reproducibles.
Trabajos anteriores han intentado la automatización de cultivos hiPSC6,7,8 pero sus protocolos se han restringido a formatos de placa de cultivo celular específicos dependientes del sistema y carentes de adaptabilidad a diferentes formatos de ensayo. Estos sistemas son útiles en el volumen de células, pero pueden no ser adecuados para la diferenciación automatizada en los tipos celulares deseados, fenotipado de enfermedad, y propósitos de cribado. Además, se ha descrito una plataforma automatizada a gran escala para la derivación, generación de hiPSC y diferenciación9 pero a una escala que sólo puede lograrse mediante laboratorios de alto rendimiento dedicados a la producción de líneas que parecen atractivas pero que pueden ser inasequibles para muchos laboratorios académicos.
Desarrollamos un sistema de cultivo celular totalmente automatizado basado en una estación de manipulación de líquidos en un entorno filtrado por aire de partículas de alta eficiencia (HEPA) en combinación con una incubadora deCO2 de gran capacidad, un citómetro de imágenes de campo brillante y un brazo robótico para el transporte de placas. Estos componentes proporcionan la base para el cultivo y diferenciación hiPSC estable y reproducible. Complementamos el sistema con un sistema automatizado de almacenamiento de -20 oC para el almacenamiento compuesto o de virus y un imager de celda en vivo confocal de disco giratorio de alta velocidad. Se generaron protocolos personalizados que permitieron la siembra automática de células, los cambios de medios, las comprobaciones de confluencia, la expansión celular y la generación de placas de ensayo con tratamiento de muestras e imágenes de placas, lo que hace que el sistema sea compatible con exámenes de alto contenido/alto rendimiento. El sistema automatizado de cultivo celular e imágenes se opera mediante el software de control y la interfaz gráfica de usuario (GUI) personalizada. La GUI permite a los usuarios importar archivos CSV que contienen parámetros específicos de línea de celda necesarios para la ejecución de métodos. Además, la GUI permite programar numerosos experimentos en cualquier secuencia utilizando la vista de calendario integrada, lo que permite un control total del tiempo en que se inicia cada método.
Nuestro sistema automatizado de cultivo celular utiliza velocidades de pipeteo estandarizadas, tiempos de paso, umbrales de confluencia, densidades de siembra y volúmenes medios con la flexibilidad de cultivar células en una variedad de formatos de placa (formato de placa de 96, 48, 24, 12, 6 o 1 pozo). Hemos adaptado un protocolo de diferenciación a corto plazo publicado recientemente para convertir hiPSC en neuronas que pueden producir neuronas positivas TUBB3 en 6 días10,11. También establecimos la diferenciación automatizada y la toma de imágenes de células precursoras neuronales de moléculas pequeñas (smNPC) en neuronas que expresan constitutivamente la GFP bajo EF1a promotor12 e iPSC en neuronas dopaminérgicas de cerebro medio (mDA), adaptando un protocolo de inhibición de doble SMAD publicado anteriormente13 que produce neuronas mDA en 65 días.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287</td>
			<td>1 to 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Oct3/4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>1 to 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti- TUBB3</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>1 to 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-BRN2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-TH</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-74421</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei counterstaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechest 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1 to 8,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent TapeStation system</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>4200</td>
			<td>Automated electrophoresis 
			for DNA and RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated -20 &#176;C storage system</td>
			<td>Hamilton Storage 
			Technologies</td>
			<td>Sample Access Manager 
			(SAM -20C, 3200 series)</td>
			<td>Storage of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode reader</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>Barcode Reader Orbit</td>
			<td>Barcode scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield cell cytomat</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Confluence check and 
			cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Automated confocal 
			microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for cell cultures</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 24 C, CU</td>
			<td>12 stackers pitch 28 mm, 
			12 stackers pitch 23 mm 
			(total of 456 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for thawing samples</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 2-LIN, 60 DU 
			(Drying Unit)</td>
			<td>2 stackers pitch 28 mm 
			(total of 42 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Hood Flow Star UV</td>
			<td>Modified by Hamilton 
			Robotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling station</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Microlab Star</td>
			<td>Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml 
			and 96 Channel MPH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>188211APE</td>
			<td>Media/reagents reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water system</td>
			<td>Veolia Water</td>
			<td>ELGA PURELAB Classic</td>
			<td>Provides pure water for 
			needle wash station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Real-Time 
			PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>QSTUDIO12KOA</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Rackrunner</td>
			<td>Transport of plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turn table</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Turn Table</td>
			<td>Adjust plate orientiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterruptible power supply</td>
			<td>APC</td>
			<td>Smart UPS RT Unit, 
			10000 VA Power supply</td>
			<td>Backup power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO-pipettes</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4500</td>
			<td>Electronic pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4453545</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well culture plate (84 cm2)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td>Nunc OmniTray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates (9.6 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate (3.9 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate (0.32 cm2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005558</td>
			<td>CellCarrier-96 Black plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 50-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235987</td>
			<td>50-uL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 300-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235985</td>
			<td>300-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 1000-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235939</td>
			<td>1000-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 5-mL</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>184022</td>
			<td>5-mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 15-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>15-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 50-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>50-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene cryogenic 2.0 mL vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V5007</td>
			<td>Cryovials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_hEF1a_rtTA3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61472</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61474</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sequence (forward)</td>
			<td>Sequence (reverse)</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 (ID 4505967a1)</td>
			<td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td>
			<td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG (ID 153945815c3)</td>
			<td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td>
			<td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REX1 (ID 89179322c1)</td>
			<td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td>
			<td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2 (ID 87578393c1)</td>
			<td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>
			<td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN2 (ID 380254475c1)</td>
			<td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td>
			<td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUX2 (ID 291045458c2)</td>
			<td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td>
			<td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td>
			<td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td>
			<td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td>
			<td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td>
			<td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH</td>
			<td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td>
			<td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td>
			<td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Housekeeping genes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td>
			<td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAZ1</td>
			<td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td>
			<td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLPO</td>
			<td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td>
			<td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPL13A</td>
			<td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td>
			<td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Use concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 - 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC culture medium 
			(Essential 8 Flex medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - NGN2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.909 mL (50 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331093</td>
			<td>484.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL ( 2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>0.25 mL (2.5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - SRM medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.5 mL (55 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>409.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement 
			(serum replacement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>75 mL (15%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - N2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>475 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL(1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline (dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate 
			magnesium (AA2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>64 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic factor-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMA)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833-10MG</td>
			<td>0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>420220-10MG</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13197</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid (AA1)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189 (LDN)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11802</td>
			<td>100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (Purm)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Hedgehog/Shh (C24II) 
			N-Terminus (SHH)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1845-SH</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542 (SB)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13031</td>
			<td>10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor type &#223;3 
			(TGF&#223;3)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>243-B3</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10005583</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell dissociation reagent 
			(StemPro Accutase)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11575020</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation and cDNA kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Rneasy MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Trizol lysis buffer (RNA 
			lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080-085</td>
			<td>SuperScript III Reverse 
			Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Framework (CCF) 
			(Graphical user interface, GUI)</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>User interface for the automated system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellPathFinder software 
			(image analysis software 1)</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellPathfinder HCS Software</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager Measurement System</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>Included with 
			CellVoyager 7000</td>
			<td>Microscope controlling 
			software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus software 
			(image analysis software 2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloud based qPCR app</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Themo Fisher cloud</td>
			<td>Analysis software for 
			qRT-PCR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus software</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>VENUS Two Dynamic 
			Schedular 5.1 Software</td>
			<td>Controlling software for the 
			automated system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring

El cultivo manual y los protocolos de diferenciación para células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) son difíciles de estandarizar, muestran una alta variabilidad y son propensos a la diferenciación espontánea en tipos de células no deseadas. Los métodos requieren mucha mano de obra y no son fácilmente susceptibles a experimentos a gran escala. Para superar estas limitaciones, desarrollamos un sistema automatizado de cultivo celular acoplado a un sistema de imágenes de alto rendimiento e implementamos protocolos para mantener múltiples líneas hiPSC en diferenciación paralela y neuronal. Describimos la automatización de un protocolo de diferenciación a corto plazo utilizando Neurogenin-2 (NGN2) sobreexpresión para producir neuronas corticales derivadas de hiPSC en un plazo de 6 a 20128 días, y la implementación de un protocolo de diferenciación a largo plazo para generar neuronas dopaminérgicas medias (mDA) derivadas de hiPSC en un plazo de 65 días. Además, aplicamos el enfoque NGN2 a una pequeña célula precursora neuronal derivada de moléculas (smNPC) transducidas con lentivirus GFP y establecimos un ensayo automatizado de crecimiento de neuritas de células vivas. Presentamos un sistema automatizado con protocolos adecuados para el cultivo rutinario de hiPSC y la diferenciación en neuronas corticales y dopaminérgicas. Nuestra plataforma es adecuada para la cultura manos libres a largo plazo y las pruebas de detección de alto contenido/alto rendimiento basado en hiPSC, RNAi y CRISPR/Cas9 para identificar nuevos mecanismos de enfermedad y objetivos farmacológicos.

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Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Mostramos la automatización de cultivos de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y diferenciaciones neuronales compatibles con imágenes y análisis automatizados.

Producción automatizada de neuronas corticales y dopaminérgicas derivadas de células madre no inducidas por humanos con monitoreo integrado de células vivas

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

El objetivo general de este estudio es mostrar cómo implementar procedimientos automatizados para cultivar y diferenciar las células IPS humanas en linajes neuronales, así como sus imágenes automatizadas. Los procedimientos automatizados estandarizados permiten una baja variación experimental al tiempo que garantizan una alta reproducibilidad fenotípica. Además, el sistema se puede adaptar para el desarrollo de nuevos protocolos.Demostrando los procedimientos serán Joachim Tager y Elisangela Bressan, post-docs de nuestro laboratorio. En la interfaz gráfica de usuario del sistema automatizado, haga clic en la vista de proceso del instrumento de recursos y seleccione el proceso del instrumento de recursos. Haga clic en Ejecutar proceso de instrumento y ejecute el capó HEPA y los procesos de recarga.Seleccione los recursos que desea cargar, abra la puerta y cargue las placas de cultivo celular y las puntas desechables en las posiciones adecuadas según lo indicado por las imágenes emergentes. A continuación, descontaminar la puerta con 70%etanol antes de cerrar y ejecutar el proceso de descontaminación. El sistema será esterilizado por radiación UV durante 30 minutos.Para cargar las placas con medio de cultivo o reactivo de disociación, ejecute el paso de la campana HEPA de ejecución y abra la puerta de la estación de manipulación de líquidos. Después de la descontaminación con 70%etanol, coloque los depósitos en la cubierta a la posición asignada y des-lid ellos. Cierre la puerta de la estación de manipulación de líquidos y, a continuación, ejecute el proceso del instrumento de recursos InitHepaHood para apagar la campana HEPA.Para ejecutar un método de referencia cultural automatizado, en la vista de calendario de la interfaz gráfica de usuario, haga clic en Agregar paso de proceso y seleccione la línea de celda que se utilizará en el experimento. Utilice el asistente para seleccionar el proyecto y marcar el lote que se va a utilizar. Haga clic en la punta de flecha hacia la derecha y vaya a la página siguiente del asistente para seleccionar el paso de proceso que se va a ejecutar.En la última página del asistente, programe el experimento y establezca las variables de detalles de parámetros adecuadas necesarias para ejecutar el método. A continuación, haga clic en Aceptar. Después de cargar un tubo de 50 mililitros con la suspensión humana de la célula IPS, placas de cultivo recubiertas de carga para recibir las células en el estante y ejecutar la siembra de placas desde el método de tubos. Para contar las células en el citómetro de imágenes Brightfield, prepare automáticamente una placa de conteo de 384 pozos con suspensión celular en la cubierta y utilice el brazo robótico para transferir la placa de conteo de 384 pozos de la cubierta al citómetro de imagen Brightfield.Después de contar, el sistema devolverá la placa a su posición original y transferirá un cultivo recubierto o una placa de ensayo desde el estante a la cubierta de pipeteo. A continuación, el sistema sembrará las celdas en el número definido por el usuario y los volúmenes adecuados para la placa y se mezclarán por pipeteo. Después de la siembra, la placa se moverá al agitador en la cubierta durante 10 segundos a 500 revoluciones por minuto para la distribución celular antes de ser transferida a la incubadora de dióxido de carbono.Para evaluar la confluencia automatizada, ejecute el método de confluencia check y seleccione un lote que contenga al menos una placa de cultivo y ninguna placa de ensayo. En la sección de detalles de parámetros, especifique iPSCf_2020 para la adquisición de imágenes en la configuración de análisis de imágenes. A continuación, el sistema transferirá la primera placa de la incubadora al citómetro de imagen Brightfield e imágenes de la confluencia celular.Para cambiar el cultivo de celdas o los medios de la placa de ensayo, ejecute el método de cambio de medios de placas de cultivo y seleccione un lote que contenga solo placas de cultivo. El sistema transferirá las placas a la cubierta e inclinará las placas para permitir la aspiración del sobrenadante. El sobrenadante se desechará al módulo de recogida de residuos y desechará las puntas y se añadirán 12 mililitros de medio fresco a cada plato.A continuación, el sistema volverá a tapar las placas y devolverá las placas a la incubadora de cultivo celular. Alternativamente, para cambiar el medio de las placas de ensayo, ejecute el cambio de medios del método de placas de ensayo. Para subcultivar las celdas, ejecute la subcultivación del método de células adherentes y seleccione el lote que contiene las placas de cultivo que necesitan subcultivación.Después de desechar el medio, el sistema lavará las células una vez con ocho mililitros de PBS por placa antes de agregar ocho mililitros de EDTA milimétrica a las células. Después de ocho minutos en la cubierta con opción de inclinación, el EDTA será reemplazado por 12 mililitros de medio fresco por placa. El sistema sacudirá las placas a 2.000 revoluciones por minuto durante un minuto para desalojar las colonias antes de triturar las células con cinco ciclos de pipeteo para dividir las colonias en grupos de 50 a 80 micras.Las células se transferirán a un tubo de 50 mililitros en la cubierta antes de sembrarlas en una proporción de división de uno a siete. Para obtener un alto contenido automatizado, realice imágenes celulares de alto rendimiento, ejecute el método de creación de imágenes y seleccione un lote que contenga al menos una placa de ensayo y ninguna placa de cultivo. A continuación, el sistema transferirá una placa de ensayo al microscopio confocal automatizado para obtener imágenes.Asegúrese de seleccionar los ID de lote y placa correctos mientras realiza los pasos de proceso necesarios. Los cultivos hiPSC deben ser monitoreados diariamente para el crecimiento y analizados para su porcentaje de confluencia en el citómetro de imágenes de Brightfield. Después de la transferencia y la referencia cultural manual o automatizada del sistema, las células exhiben una expresión típica de la célula madre y del marcador de pluripotencia.Las neuronas diferenciadas en el sistema de cultivo automatizado demuestran una morfología similar y la organización de la red neuronal a las neuronas cultivadas manualmente. Después de seis días de diferenciación, las neuronas corticales diferenciadas automáticamente son positivas para la expresión de marcador de capa cortical de clase III específica de neuronas y. Después de ocho días, las células también expresaron la proteína asociada a los microtúbulos 2, la molécula de adhesión de células neuronales, y la sinapsis I, así como marcadores de neuronas corticales.La expresión muy baja o nula de estos marcadores se observa en hiPSC. Este sistema también se puede utilizar para establecer un ensayo automatizado de crecimiento de neurita de células vivas que permite medir longitudes de neurita durante 11 días de diferenciación sin intervención manual. El uso del sistema de cultivo automatizado para realizar cambios medios durante un período de cultivo de 65 días facilita la diferenciación de hiPSC en neuronas dopaminérgicas de cerebro medio con la organización celular y morfología esperadas.Además del crecimiento de la neurita, otros ensayos fenotípicos automatizados relevantes para estudiar la neurodegeneración, por ejemplo, los focos de ARN de translocación TDP-43 y la captación de fibría de alfa-sinucleína, se pueden explorar utilizando este formato de alto rendimiento y alto contenido.

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos humanos con los Lentivirus Stemgent Humanos TF Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

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Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfección y Nucleofecting Humanos células madre pluripotentes inducidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selección y aislamiento de las colonias de humanos células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos adultos Reprogramado

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

La reprogramación de células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando el vector retroviral con las buenas prácticas agrarias

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

La generación de cardiomiocitos humanos: Protocolo de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas Feeder libres

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Derivación y caracterización de un transgen libre Humano madre pluripotentes inducidas Línea Celular y Conversión en condiciones definidas de calidad clínica

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...