Name: automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Författarna erkänner tacksamt de patienter och deras familjer som bidragit biomaterial för denna studie. Celler linjer som används i studien var från NINDS samling med Rutgers (ND41865 som iPS # 1) och labbet av Dr Tilo Kunath (iPS # 2). Detta arbete stöds delvis av NOMIS-stiftelsen (PH), RiMod-FTD, ett EU-gemensamt program - Neurodegenerativ sjukdomsforskning (JPND) (PH); DZNE I2A-initiativet (AD); PD-Strat, ett ERA-Net ERACoSysMed finansierat projekt (PH) och Foundational Data Initiative for Parkinson's Disease (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD är en del av Michael J. Fox Foundations PATH to PD-program. Författarna tackar Steven Finkbeiner och Melanie Cobb (Gladstone Institutes) för att bidra till inrättandet av den manuella mDA neuron differentiering protokoll och Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) för hjälp i neurite utväxt analys setup.

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases.">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li><li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease.">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li><li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions.">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647 (2015).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System.">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+derivation,+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li><li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells.">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling.">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PloS one. 8 (3), 59252 (2013).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li><li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology,+autophagy,+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons.">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death &amp; disease. 6, 1811 (2015).</li><li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2++Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation.">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li><li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Huntington's+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics,+Morphology,+and+Maturation.">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimerBank:+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification.">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, 792 (2010).</li></ol>

Vi har inget att avslöja.

Vi introducerar ett automatiserat cellkultursystem med integrerad bildframställning kapacitet för standardisering av hiPSC kultur och neuronal differentiering. På grund av minimala användaren ingripande, experimentell variation är låg säkerställa reproducerbarhet av cellulära fenotyper under differentiering. Den kalenderbaserade schemaläggaren stöder organisering och parallellisering av experiment och tillåter en hög grad av flexibilitet vid vilken tidpunkt experimenten utförs. Befintliga metoder kan enkelt anpassas och spektrumet av tillgängliga metoder kan ökas. Dessutom kan ett stort antal assay plate format användas lägga till flexibiliteten i detta system. Det minimala systemet som består av en CO 2-inkubator, en robotarm, en cellcytmeter i brightfield och en vätskehanteringsstation utgör den grundläggande enhet som behövs för hiPSC-kultur och differentiering, med överkomliga kostnader för akademiska forskningslaboratorier. Kombinationen av det automatiserade cellodlingssystemet med ett automatiserat -20 °C-lagringssystem för lagring av föreningar, RNAi-bibliotek eller CRISPR/Cas9-bibliotek, och integrering av ett mikroskop med hög innehåll/hög genomströmning möjliggör utförande av fenotypiska screenings.
I den aktuella studien använde det automatiserade cellodlingssystemet engångstips och odlingsmedierna återfylldes manuellt i reservoaren, vilket begränsar användningen av vätskehanteringsstationen för medieförändringar och andra odlingsprocesser speciellt över en natt. För att kringgå denna begränsning kan metoderna justeras till nålanvändning istället för engångsspetsar och, efter installation av röranslutningar mellan medielinjer och mediapåsar som lagras i ett kylskåp, kan mediareservoarer automatiskt fyllas på med färska medier förvärmda av värmeelement. Detta skulle minska användarnas störningar som orsakas av manuell påfyllning av tips, kulturmedia och reservoarutbyten.
Vårt automatiserade cellodlingssystem ger flera fördelar. En är streckkodsspårningssystemet. Plattorna lastas i systemet identifieras genom en unik streckkod som läses och sparas av systemet tillåter spårning av prover under och efter metodkörning. En annan fördel är möjligheten att skapa användarspecifika projekt. Här kan kulturplattor som laddas i systemet tilldelas till ett visst projekt och grupperas i batchar. Struktureringen i omgångar förenklar utförandet av samma procedur till alla plattor av en viss sats eftersom inga enskilda plattor behöver väljas. Dessutom tillåter en flytande klass redaktör att justera pipetting hastighet och höjd samt aspiration och dispensering parametrar för varje flytande överföring steg. Varje process dokumenteras i loggfiler gör det möjligt att spåra vilka uppgifter som har utförts för en viss kultur eller analysplåt.
Nervceller och andra celltyper som härrör från humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) är användbara in vitro-verktyg för att studera mekanismerna för neurodegenerativa sjukdomar i specifika patientpopulationer (t.ex. dopaminerga nervceller för Parkinsons sjukdom) som erbjuder möjlighet till personliga läkemedelsscreening. Culturing hiPSC är mycket tidsintensiv och kräver utbildade människor att utföra komplexa differentieringsprotokoll, vanligtvis begränsad till låg skala produktion. Vi anpassade den matarfria kulturen av hiPSC till en automatiserad kultur och genomfört två neuronal differentiering protokoll, en snabb när nervceller differentiering protokoll baserat på NGN2 över-uttryck under en tet-onpromotorn 10,11, och en långsiktig liten molekyl-baserade protokoll för generering av midbrainergic dopamin (mDA) nervceller13. Den enkla överföringen och reproducerbarheten av manuell kultur och differentieringsprotokoll gör det automatiserade kultursystemet mycket användbart. Mänskliga iPSC odlade i det automatiserade cellen kultur systemet visade konsekvent stamcell morfologi och uttryckte viktiga pluripotency markörer, reproducerbara mellan oberoende experiment. Dessutom gynnade automatiseringen av hiPSC-kulturprotokollet kulturen och expansionen av ett större antal cellinjer parallellt. Automatiserade konfluencykontroller som planeras utföras över natten sparad tid som lämnar systemet fritt under dagen för nedströms processsteg som utfördes när användaren var i laboratoriet (t.ex. skörd av celler eller manuell omplatning för differentiering). På att nå den användardefinierade sammanflödet tröskeln, celler är passaged och replated i extracellulära matris-belagda plattor som finns på staplaren av automatiserade cellodling systemet. Varje passagerunda tar ca 70 min och genererar fyra 1-brunns plattor från en förälder platta, vilket översätts till en kapacitet på 20 passager på en dag.
Automatiseringen av NGN2 differentiering protokollet gjordes framgångsrikt och tillåts generering av en homogen population av neuronala celler över olika passager och jämförbar med manuella differentieringar. Dessutom skulle de experimentella kostnaderna för storskaliga screeningstudier med flera cellinjer eller screeningexperiment med tusentals testförhållanden/föreningar minska på grund av snabba differentieringar. Kostnadseffektiva och hög-genomströmning avläsningar inklusive live-cell neurit utväxt mätningar kan enkelt utvecklas, genomföras och användas som fenotypiska avläsningar för sjukdom modellering, som visas tidigare14,15,16. Således anpassade vi ytterligare NGN2-protokollet med hjälp av små molekyl härledda neurala föregångare (smNPC) celler som utgördativt över-express GFP. SmNPC-cellerna ger ytterligare fördelar, inklusive minskade kostnader med odlingsmedier (en tredjedel av kostnaden med iPSC-kulturen) och tid som krävs för att skala upp experiment. Cellen avkastning från smNPC är 7 till 10 gånger högre än den som erhålls med iPSC. De differentierande nervcellerna övervakades framgångsrikt och avbildades i flera dagar med hjälp av en helt automatiserad bildbehandlingsprocess utan behov av manuella antikroppsfärgningar eller kemisk märkning, vilket sparar kostnader och tid som krävs för manuella procedurer, inklusive avbildning av sig själv. Den nuvarande avbildningen av inre 60 brunnar av en 96-brunnsplatta tar cirka 16 min per platta när 25 fält per brunn avbildas, vilket innebär att data för en bildbehandling-baserad screening för 1000 föreningar, skulle kunna förvärvas och analyseras på en dag. I framtiden kan denna avläsning användas i sammansatta screeningstudier för räddning av neuritutväxtdefekter.
Vidare visar vi också överföring av en manuell differentiering protokoll för att generera midbrain dopaminergic (mDA) nervceller från iPSC. Denna lilla molekyl-baserade differentiering protokoll tar 65 dagar och är arbetsintensiva på grund av de flera replating steg och täta förändringar media, mestadels var 2 dagar, vilket begränsar produktionen av mDA nervceller till några iPSC linjer samtidigt. Den automatiserade mDA differentiering protokollet har den stora fördelen att skala upp differentiering till dussintals iPSC linjer. Upp till kunde 30 cellinjer göras åtskillnad mellan parallellt. Eftersom differentieringen till största delen baseras på medieförändringar, kan nästan hela differentieringsprocessen genomföras utan mänsklig inblandning. Med hjälp av den kalenderbaserade schemaläggaren av det automatiserade systemet skulle vi kunna planera medieändringarna enligt differentieringsstegen. En begränsning av att arbeta med ett så stort antal cellinjer och kulturplattor var omöjligheten att utföra över natten medieförändringar. Den främsta orsaken är det faktum att vårt system är inrättat för att använda disponibel tips och manuell påfyllning av kultur media kräver en användare i laboratoriet för att utföra denna manuella steg. För att underlätta media förändringsprocessen, var plattor lastas i systemet tilldelats ett projekt och grupperade i omgångar. Satsstorleken anpassades sedan till antalet disponibla tips och volym av odlingsmedia som fanns tillgängliga. Som diskuterats ovan, kan denna begränsning enkelt övervinnas genom genomförandet av återanvändbara / tvättbara nålar och automatiserad påfyllning av media. Automatiserad passaging / omplatning av celler, som visas för iPSC, är en av de bekvämligheter som erbjuds av vårt automatiserade cellodlingssystem. Vi har testat den automatiserade omplatning av mDA nervceller på dag 25 av differentiering. Dissociation av mDA nervceller kräver dock längre (40 min) inkubation med dissociation enzymet än iPSC (8 min) utvidga automatiserade replating processen till mer än 1 h per cellinjer. Som en följd blev den automatiserade omplatningen av 30 cellinjer samma dag omöjlig. Påskynda andra steg under automatiserad omplatning (transport av plattor, pipettering) och anpassa systemet till användning av nålar och media linje som gör en övernattning arbete möjligt skulle lösa denna begränsning. Trots nackdelarna, vi kunde framgångsrikt överföra det manuella protokollet till en automatiserad differentiering av mDA nervceller producera kulturer med betydande mängder AV MAP2 (neuron) och TH (mDA nervceller) positiva celler.
Att differentiera dussintals iPSC-cellinjer parallellt är av stort intresse i projekt som undersöker de molekylära mekanismerna för neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom. Men att slutföra uppgifter snabbare med färre fel och till minskade kostnader är dock en stor utmaning. På grund av automatiseringen av de protokoll som presenteras här (iPSC, smNPC och mDA neuron), kunde vi påskynda, minska kostnaderna och öka reproducerbarheten i våra projekt. Utvecklingen av projekt som FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) som omfattar hundratals patient cellinjer visar behov av automatiserad kultur och differentiering protokoll. Våra framtida perspektiv inkluderar överföring av manuell 3 dimensionella (3D) cellkultur modeller till det automatiserade systemet. Mindre anpassningar i inställningarna för plattdefinition och användning av adaptrar kommer att möjliggöra användning av kommersiella eller specialtillverkade plattor och mikrofluidiska kammare som krävs för 3D-kulturerna. Dessutom kommer genomförandet av en automatiserad etikettfri bildmodell gör det möjligt för oss att spåra den neuronala tillväxten i realtid och översätta förändringar i neuritutväxt, neuron organisation och celldöd till bättre förståelse av sjukdomen mekanismer.

Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) är självförnyande och kan differentiera i nästan alla vuxna celltyp. Dessa egenskaper gör hiPSC ett användbart verktyg för sjukdomsmodellering inom grundforskning och läkemedelsupptäckt1. Human iPSC behåller givaren genetisk bakgrund som tillåter härleda sjukdomsrelevanta celltyper som är mest drabbade / involverade i sjukdomsförloppet, till exempel, olika neuronala subtyper för neurodegenerativa sjukdomar2,3. Också, hiPSC övervinner några av de begränsningar av djur-och cellulära över-uttryck modeller genom modellering av sjukdomar i ett mänskligt sammanhang och fysiologiska proteinuttryck nivåer, och har visat sig vara en värdefull tillgång i modellering av sjukdomar som sträcker sig från monogena, komplexa och epigenetiska störningar samt sent sjukdomstillstånd4.
Trots dessa fördelar och möjligheter måste flera begränsningar av hiPSC fortfarande åtgärdas. Nuvarande hiPSC kultur och differentiering protokoll är inte kostnadseffektiva, svårt att standardisera och är arbetsintensiva. Manuell kultur steg kan resultera i hög variation i avkastningen och fenotyper på grund av skillnader i tillväxt och spontan differentiering av hiPSC. Därför behöver experimenterberoende variation minskas genom att man implementerar mer standardiserade hanteringstekniker och förenklar protokoll som kan uppnås med hjälp av automatisering5. Inrättandet av automatiserade hiPSC-kultur- och differentieringsprotokoll kommer att fastställa gemensamma standarder för både akademiska och industriella forskningsprojekt, och möjliggöra generering av biologiskt relevanta sjukdomsmodeller och mer reproducerbara resultat.
Tidigare arbete har försökt automatisering av hiPSC kulturer6,7,8 men deras protokoll har begränsats till specifika cellkultur plattan format beroende av systemet och saknar anpassningsförmåga till olika analysformat. Sådana system är användbara i sammanslagningen av celler men kanske inte är lämpliga för automatiserad differentiering till önskad celltyper, sjukdom fenotypning, och screening ändamål. Dessutom har en storskalig automatiserad plattform för fibroblast härledning, hiPSC generation och differentiering beskrivits9 men på en skala som endast kan uppnås genom hög genomströmning laboratorier tillägnad produktion av linjer som verkar attraktiva men kan vara dyra för många akademiska laboratorier.
Vi utvecklade ett helt automatiserat cellodlingssystem baserat på en vätskehanteringsstation i en HEPA-filtrerad miljö (High-Efficiency Particulate Air) i samband med en CO2-inkubator med stor kapacitet, en ljusfältsbildande cytometer och en robotarm för plåttransport. Dessa komponenter ger grunden för stabil och reproducerbar hiPSC-kultur och differentiering. Vi kompletterade systemet med ett automatiserat -20 °C-lagringssystem för lagring av föreningar eller virus och en höghastighetsspinnande disk confocal live-cell imager. Skräddarsydda protokoll genererades så att automatiserade cell seeding, media förändringar, konfluency kontroller, cell expansion och analysplåt generation med provbehandling och plattan bildbehandling, vilket gör systemet kompatibelt med hög halt/hög genomströmning screenings. Det automatiserade cellodlings- och bildhanteringssystemet drivs med hjälp av den kontrollerande programvaran och det skräddarsydda grafiska användargränssnittet (GUI). Gui:t tillåter användare att importera CSV-filer som innehåller cellinjespecifika parametrar som behövs för metodkörning. Dessutom aktiveras GUI för att schemalägga ett flertal experiment i valfri sekvens med hjälp av den inbyggda kalendervyn vilket möjliggör full kontroll över tiden när varje metod startar.
Vårt automatiserade cellodlingssystem använder standardiserade pipetthastigheter, passagingtider, confluencytrösklar, sådddensiteter och medelvolymer med flexibiliteten att odla celler i en mängd olika plåtformat (96-, 48-, 24-, 12-, 6- eller 1-brunnsplåtformat). Vi anpassade en nyligen publicerad kortvarig differentiering protokoll för att omvandla hiPSC till nervceller som kan ge TUBB3 positiva nervceller i 6 dagar10,11. Vi etablerade också den automatiserade differentiering och bildbehandling av små molekyl neurala prekursorceller (smNPC) i nervceller som utgör uttrycker GFP under EF1a promotorn12 och iPSC i midbrain dopaminergic (mDA) nervceller, anpassa en tidigare publicerad dual-SMAD hämning protokoll13 som ger mDA nervceller inom 65 dagar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287</td>
			<td>1 to 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Oct3/4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>1 to 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti- TUBB3</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>1 to 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-BRN2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-TH</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-74421</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei counterstaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechest 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1 to 8,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent TapeStation system</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>4200</td>
			<td>Automated electrophoresis 
			for DNA and RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated -20 &#176;C storage system</td>
			<td>Hamilton Storage 
			Technologies</td>
			<td>Sample Access Manager 
			(SAM -20C, 3200 series)</td>
			<td>Storage of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode reader</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>Barcode Reader Orbit</td>
			<td>Barcode scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield cell cytomat</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Confluence check and 
			cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Automated confocal 
			microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for cell cultures</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 24 C, CU</td>
			<td>12 stackers pitch 28 mm, 
			12 stackers pitch 23 mm 
			(total of 456 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for thawing samples</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 2-LIN, 60 DU 
			(Drying Unit)</td>
			<td>2 stackers pitch 28 mm 
			(total of 42 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Hood Flow Star UV</td>
			<td>Modified by Hamilton 
			Robotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling station</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Microlab Star</td>
			<td>Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml 
			and 96 Channel MPH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>188211APE</td>
			<td>Media/reagents reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water system</td>
			<td>Veolia Water</td>
			<td>ELGA PURELAB Classic</td>
			<td>Provides pure water for 
			needle wash station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Real-Time 
			PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>QSTUDIO12KOA</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Rackrunner</td>
			<td>Transport of plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turn table</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Turn Table</td>
			<td>Adjust plate orientiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterruptible power supply</td>
			<td>APC</td>
			<td>Smart UPS RT Unit, 
			10000 VA Power supply</td>
			<td>Backup power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO-pipettes</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4500</td>
			<td>Electronic pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4453545</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well culture plate (84 cm2)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td>Nunc OmniTray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates (9.6 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate (3.9 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate (0.32 cm2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005558</td>
			<td>CellCarrier-96 Black plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 50-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235987</td>
			<td>50-uL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 300-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235985</td>
			<td>300-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 1000-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235939</td>
			<td>1000-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 5-mL</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>184022</td>
			<td>5-mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 15-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>15-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 50-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>50-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene cryogenic 2.0 mL vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V5007</td>
			<td>Cryovials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_hEF1a_rtTA3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61472</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61474</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sequence (forward)</td>
			<td>Sequence (reverse)</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 (ID 4505967a1)</td>
			<td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td>
			<td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG (ID 153945815c3)</td>
			<td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td>
			<td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REX1 (ID 89179322c1)</td>
			<td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td>
			<td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2 (ID 87578393c1)</td>
			<td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>
			<td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN2 (ID 380254475c1)</td>
			<td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td>
			<td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUX2 (ID 291045458c2)</td>
			<td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td>
			<td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td>
			<td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td>
			<td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td>
			<td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td>
			<td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH</td>
			<td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td>
			<td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td>
			<td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Housekeeping genes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td>
			<td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAZ1</td>
			<td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td>
			<td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLPO</td>
			<td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td>
			<td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPL13A</td>
			<td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td>
			<td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Use concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 - 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC culture medium 
			(Essential 8 Flex medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - NGN2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.909 mL (50 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331093</td>
			<td>484.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL ( 2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>0.25 mL (2.5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - SRM medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.5 mL (55 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>409.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement 
			(serum replacement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>75 mL (15%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - N2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>475 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL(1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline (dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate 
			magnesium (AA2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>64 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic factor-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMA)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833-10MG</td>
			<td>0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>420220-10MG</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13197</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid (AA1)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189 (LDN)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11802</td>
			<td>100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (Purm)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Hedgehog/Shh (C24II) 
			N-Terminus (SHH)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1845-SH</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542 (SB)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13031</td>
			<td>10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor type &#223;3 
			(TGF&#223;3)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>243-B3</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10005583</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell dissociation reagent 
			(StemPro Accutase)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11575020</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation and cDNA kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Rneasy MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Trizol lysis buffer (RNA 
			lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080-085</td>
			<td>SuperScript III Reverse 
			Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Framework (CCF) 
			(Graphical user interface, GUI)</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>User interface for the automated system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellPathFinder software 
			(image analysis software 1)</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellPathfinder HCS Software</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager Measurement System</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>Included with 
			CellVoyager 7000</td>
			<td>Microscope controlling 
			software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus software 
			(image analysis software 2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloud based qPCR app</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Themo Fisher cloud</td>
			<td>Analysis software for 
			qRT-PCR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus software</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>VENUS Two Dynamic 
			Schedular 5.1 Software</td>
			<td>Controlling software for the 
			automated system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring

Manuell kultur och differentiering protokoll för mänskliga inducerad pluripotenta stamceller (hiPSC) är svåra att standardisera, visa hög variation och är benägna att spontan differentiering till oönskade celltyper. Metoderna är arbetsintensiva och är inte lätt mottagliga för storskaliga experiment. För att övervinna dessa begränsningar, utvecklade vi en automatiserad cell kultur system kopplade till en hög genomströmning bildsystem och genomfört protokoll för att upprätthålla flera hiPSC linjer i parallella och neuronal differentiering. Vi beskriver automatisering av en kortvarig differentiering protokoll med hjälp av Neurogenin-2 (NGN2) över-uttryck för att producera hiPSC-härledda när nervceller inom 6\u20128 dagar, och genomförandet av en långsiktig differentiering protokoll för att generera hiPSC-härledda midbrain dopaminerga (mDA) nervceller inom 65 dagar. Också, Vi tillämpade NGN2 strategi för en liten molekyl-härledda neurala prekursorceller (smNPC) transduced med GFP lentivirus och etablerade en levande-cell automatiserad neurit utväxt assay. Vi presenterar ett automatiserat system med protokoll som lämpar sig för rutinmässig hiPSC kultur och differentiering till när och dopaminerga nervceller. Vår plattform är lämplig för långsiktig handsfree-kultur och hög halt/hög genomströmning hiPSC-baserad förening, RNAi och CRISPR/Cas9-visningar för att identifiera nya sjukdomsmekanismer och läkemedelsmål.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Vi visar automatisering av mänskliga inducerad pluripotenta stamceller (hiPSC) kulturer och neuronal differentieringstal kompatibel med automatiserad bildbehandling och analys.

Automatiserad produktion av humant inducerat Pluripotent Stamcell-derived kortikal och dopaminerga nervceller med integrerad Live-Cell Övervakning

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Det övergripande målet med denna studie är att visa hur man genomför automatiserade förfaranden för odling och differentiering mänskliga IPS-celler i neuronala härstamningar, liksom deras automatiserade bildbehandling. Standardiserade automatiserade förfaranden tillåter låg experimentell variation samtidigt som hög fenotypisk reproducerbarhet säkerställs. Dessutom kan systemet anpassas för utveckling av nya protokoll.Demonstrerar procedurerna blir Joachim Tager och Elisangela Bressan, post-docs från vårt labb. Klicka på Resursinstrumentprocessvyn och välj resursinstrumentprocessen i det automatiserade systemets grafiska användargränssnitt. Klicka på Kör instrument processen och kör kör HEPA huva och omlastning processer.Välj de resurser som ska laddas, öppna dörren och ladda cellkulturens plåtar och engångstips i lämpliga positioner som de popup-bilderna anger. Dekontaminera sedan dörren med 70%etanol innan du stänger och kör saneringsprocessen. Systemet kommer att steriliseras av UV-strålning i 30 minuter.För att ladda plattorna med odlingsmedium eller dissociationsreagens, utför kör HEPA huvsteg och öppna dörren till vätskehanteringsstationen. Efter sanering med 70%etanol, placera reservoarerna på däck till ansett läge och de-lock dem. Stäng dörren till vätskehanteringsstationen, kör sedan initHepaHood resursinstrument processen för att stänga ner HEPA huven.Om du vill köra en automatiserad kulturmetod klickar du i kalendervyn för det grafiska användargränssnittet på Lägg till processsteg och markerar den cellinje som ska användas i experimentet. Använd guiden för att markera projektet och markera den batch som ska användas. Klicka på höger motstående pilspets och navigera till nästa sida i guiden för att välja det processsteg som ska utföras.I den sista sidan i guiden, schemalägga experimentet och ställa in lämpliga parametrar detaljer variabler som är nödvändiga för att köra metoden. Klicka sedan på OK. Efter lastning en 50 milliliter rör med den mänskliga IPS cellfjädringen, lasta belagda odlingsplattor för att ta emot cellerna på hyllan och verkställa sådd av plattor från rör metod. För att räkna cellerna i Brightfield imaging cytometer, automatiskt förbereda en 384-brunn räkna platta med cell suspension på däck och använda robotarmen för att överföra 384-brunn räkna plattan från däcket till Brightfield bildbehandling cytometer.Efter räkning kommer systemet att återföra plattan till sitt ursprungliga läge och överföra en bestruken kultur eller analysplatta från hyllan till pipetteringsdäck. Systemet kommer då att så cellerna i det användardefinierade antalet och volymer som lämpar sig för plattan och blanda genom pipettering. Efter sådd kommer plattan att flyttas till på däcksskaknare i 10 sekunder vid 500 varv per minut för cellfördelning innan den överförs till koldioxidinkubatorn.För att bedöma den automatiserade sammanflödet, utför metoden kontrollera sammanflödet och välj en sats som innehåller minst en odlingsplatta och inga analysplattor. I avsnittet om parametersdetalj in iPSCf_2020 för bildanskaffning i inställningarna för bildtagningsanalys. Systemet kommer sedan att överföra den första plattan från inkubatorn till Brightfield imaging cytometer och bild cellen sammanflödet.För att ändra cellodling eller assay plate media, utför metoden media byte av kulturplattor och välj ett parti som innehåller endast odlingsplattor. Systemet kommer att överföra plattorna till däck och luta plattorna för att möjliggöra strävan av supernatanten. Supernatanten kommer att kasseras till avfallsuppsamlingsmodulen och kasta spetsarna och 12 milliliter färskt medium kommer att läggas till varje platta.Systemet kommer sedan att åter lock plattorna och returnera plattorna till cellkulturen inkubatorn. Alternativt, för att ändra medium av analys plattor, verkställa media byte av analys plattor metod. För att subcultivate cellerna, exekvera subcultivation av anhängare celler metod och välj partiet som innehåller odlingsplattor som behöver subcultivation.Efter att ha kastat mediet kommer systemet att tvätta cellerna en gång med åtta milliliter PBS per tallrik innan åtta milliliter på 0,5 millimolar EDTA till cellerna. Efter åtta minuter på däck med vinklingsalternativ kommer EDTA att ersättas med 12 milliliter färskt medium per platta. Systemet kommer att skaka plattorna vid 2, 000 varv per minut i en minut för att rubba kolonierna innan triturating cellerna med fem cykler av pipettering att bryta upp kolonierna i 50 till 80 mikron klumpar.Cellerna kommer sedan att överföras till en 50 milliliter rör på däck innan sådd dem i en-till-sju split ratio. För automatiserad hög halt, hög genomströmning cell avbildning, exekvera avbildningsmetod och välj en sats som innehåller minst en analysplatta och inga odlingsplattor. Systemet kommer sedan att överföra en analysplatta till det automatiserade konfokalmikroskopet för avbildning.Se till att välja rätt batch- och plåt-ID:na när du utför de nödvändiga processstegen. HiPSC-kulturerna bör övervakas dagligen för tillväxt och analyseras för deras procentuella andel av konfluency i Brightfield imaging cytometer. Efter passaging och manuell eller automatiserad systemkultur uppvisar cellerna en typisk stamcells- och pluripotencymarköruttryck.Nervceller differentierade i det automatiserade kultursystemet visar en liknande morfologi och neuronal nätverksorganisation till nervceller odlas manuellt. Efter sex dagar av differentiering, automatiskt differentierade när nervceller är positiva för neuron-specifika klass III beta-tubulin och övre när lagret markör uttryck. Efter åtta dagar uttryckte cellerna också mikrotubuli-associerade protein 2, neurala cellen vidhäftning molekyl, och synapsin I, samt kortikala neuron markörer.Mycket låg eller inget uttryck för dessa markörer observeras i hiPSC. Detta system kan också användas för att upprätta en levande cell automatiserad neurit utväxt assägelse som gör att neurit längder som skall mätas över 11 dagar av differentiering utan manuellt ingripande. Använda den automatiserade kultur systemet för att utföra medelstora förändringar under en 65-dagars kulturperiod underlättar hiPSC differentiering till midbrain dopaminerga nervceller med den förväntade cellulära organisationen och morfologi.Förutom neurit utväxten, andra automatiserade fenotypiska analyser relevanta för att studera neurodegeneration, till exempel, TDP-43 translokation RNA foci och alfa-synuklein fibril upptag, kan utforskas med hjälp av denna höga genomströmning, högt innehåll format.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera humana med Stemgent mänskliga TF lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfektering och Nucleofecting Human inducerade pluripotenta stamceller

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Välja och isolera Kolonier av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller omprogrammeras från vuxna fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering Mänskliga somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) Använda retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Beredning av mus Embryonala Fibroblastceller Lämplig för odling av humana embryonala och inducerade pluripotenta stamceller

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Snabb och effektiv generering av nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller i en Multititre Plate format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Alternativa kulturer för Human pluripotenta stamceller Produktion, underhåll, samt genetisk analys

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Härledning och karakterisering av en transgen fritt Human inducerade pluripotenta stamceller Line och Omvandling till Definierade Klinisk-grade Villkor

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...