Name: automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Yazarlar minnetle bu çalışma için biyomalzeme katkıda bulunan hasta ve ailelerini kabul. Çalışmada kullanılan hücre hatları Rutgers ile NINDS koleksiyonundan (ND41865 iPS # 1 olarak) ve Dr Tilo Kunath (iPS # 2) laboratuarı ndan edildi. Bu çalışma kısmen NOMIS Foundation (PH), RiMod-FTD, AB Ortak Programı - Nörodejeneratif Hastalık Araştırma (JPND) (PH) tarafından desteklenmiştir; DZNE I2A girişimi (AD); PD-Strat, bir ERA-Net ERACoSysMed finanse edilen proje (PH) ve Parkinson Hastalığı için Temel Veri Girişimi (FOUNDIN-PD) (PH, EB). FOUNDIN-PD, Michael J. Fox Vakfı'nın PD'ye giden yolu programının bir parçasıdır. Yazarlar Steven Finkbeiner ve Melanie Cobb (Gladstone Enstitüleri) manuel mDA nöron farklılaşma protokolü ve Mahomi Suzuki (Yokogawa Electric Corporation) neurite outgrowth analiz kurulum yardım için kurulmasına katkıda bulunmak için teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases.">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li><li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease.">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177 (2019).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+single+genes+to+gene+networks:+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease.">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li><li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions.">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li><li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system.">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647 (2015).</li><li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System.">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755 (2015).</li><li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-throughput+derivation,+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li><li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells.">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Reinhardt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+expansion+using+only+small+molecules+of+human+neural+progenitors+for+neurodegenerative+disease+modeling.">Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling.</a> PloS one. 8 (3), 59252 (2013).</li><li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li><li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology,+autophagy,+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons.">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death &amp; disease. 6, 1811 (2015).</li><li>Korecka, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+Collapse+and+Altered+ER+Ca2++Control+in+Human+Parkinson+Disease+Patient+iPSC-Derived+Neurons+with+LRRK2+G2019S+Mutation.">Neurite Collapse and Altered ER Ca2+ Control in Human Parkinson Disease Patient iPSC-Derived Neurons with LRRK2 G2019S Mutation.</a> Stem cell reports. 12 (1), 29-41 (2019).</li><li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Huntington's+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics,+Morphology,+and+Maturation.">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimerBank:+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification.">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, 792 (2010).</li></ol>

Açıklayacak bir şeyimiz yok.

HiPSC kültürünün standardizasyonu ve nöronal farklılaşma için entegre görüntüleme yeteneklerine sahip otomatik bir hücre kültür sistemi sıyoruz. Minimal kullanıcı müdahalesi nedeniyle, deneysel varyasyon farklılaşma sırasında hücresel fenotiplerin tekrarlanabilirliğini sağlamak için düşüktür. Takvim tabanlı zamanlayıcı, deneylerin organizasyonunu ve paralelleştirilmesini destekler ve deneylerin gerçekleştirildiği anda yüksek derecede esneklik sağlar. Mevcut yöntemler kolayca uyarlanabilir ve mevcut yöntemlerin spektrumu artırılabilir. Ayrıca, bu sistemin esnekliğini ekleyerek çok sayıda sayma plakası biçimi kullanılabilir. CO2 kuluçka makinesi, robotik kol, parlak alan hücre sitometresi ve sıvı taşıma istasyonundan oluşan minimal sistem, akademik araştırma laboratuvarlarına uygun maliyetlerle hiPSC kültürü ve farklılaşması için gerekli temel birimi oluşturur. Otomatik hücre kültür sisteminin bileşiklerin, RNAi kütüphanelerinin veya CRISPR/Cas9 kütüphanelerinin depolanması için otomatik -20 °C depolama sistemiyle birleştirilmesi ve yüksek içerikli/yüksek iş itimatmikroskobunun entegrasyonu fenotipik taramaların gerçekleştirilmesini sağlar.
Mevcut çalışmada, otomatik hücre kültürü sistemi tek kullanımlık ipuçları kullanılan ve kültür medya rezervuar içine elle doldurulmuş, böylece medya değişiklikleri ve özellikle bir gecede diğer kültür süreçleri için sıvı işleme istasyonu kullanımını sınırlayan. Bu sınırlamayı aşmak için, yöntemler tek kullanımlık ipuçları yerine iğne kullanımına ayarlanabilir ve ortam hatları ile buzdolabında saklanan ortam torbaları arasında tüp bağlantıları yükledikten sonra, ortam rezervuarları ısıtıcı elemanları tarafından önceden ısıtılan taze ortamla otomatik olarak doldurulabilir. Bu, ipuçlarının, kültür ortamının ve rezervuar alışverişinin manuel olarak doldurulmasından kaynaklanan kullanıcı girişimlerini azaltacaktır.
Otomatik hücre kültürü sistemimiz çeşitli avantajlar sunar. Biri barkod takip sistemi. Sisteme yüklenen plakalar, yöntem infazı sırasında ve sonrasında numunelerin izlenmesine olanak tanıyan sistem tarafından okunan ve kaydedilen benzersiz bir barkod ile tanımlanır. Bir diğer avantajı da kullanıcıya özel projeler oluşturma olanağıdır. Burada, sisteme yüklenen kültür plakaları belirli bir projeye atanabilir ve gruplar halinde gruplandırılabilir. Toplu olarak yapılandırılmak, tek tek plakaların seçilmesine gerek olmadığından, belirli bir toplu işlemin tüm plakalarına aynı işlemin uygulanmasını kolaylaştırır. Ayrıca, bir sıvı sınıf düzenleyici borulama hızı ve yüksekliği yanı sıra aspirasyon ve her sıvı transfer adımı için dağıtım parametrelerini ayarlamak için izin verir. Her işlem, belirli bir kültür veya deneme plakası için hangi görevlerin gerçekleştirildiği retrace izin günlük dosyalarında belgelenir.
Nöronlar ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden türetilen diğer hücre tipleri (hiPSC) kişiselleştirilmiş ilaç taramaları için imkanı sunan belirli hasta popülasyonlarında nörodejeneratif hastalıkların mekanizmaları (örneğin Parkinson hastalığı için dopaminerjik nöronlar) çalışma için in vitro araçlar yararlıdır. HiPSC'nin culturing çok zaman yoğun ve genellikle düşük ölçekli üretim ile sınırlı karmaşık farklılaşma protokolleri yürütmek için eğitimli insanlar gerektirir. HiPSC'nin besleyicisiz kültürünü otomatik bir kültüre uyarladık ve iki nöronal farklılaşma protokolü uyguladık, bir tet-on organizatörü 10altındaNGN2 aşırı ekspresyonuna dayalı hızlı bir kortikal nöron farklılaşma protokolü10,11, ve orta beyinli dopaminerjik (mDA) nöronların üretimi için uzun vadeli küçük molekül tabanlı protokol13. Manuel kültürün ve farklılaşma protokollerinin basit aktarımı ve tekrarlanabilirliği otomatik kültür sistemini çok kullanışlı hale getirir. Otomatik hücre kültür sisteminde kültüre giren insan iPSC tutarlı kök hücre morfolojisi gösterdi ve bağımsız deneyler arasında tekrarlanabilir önemli pluripotency belirteçleri ifade etti. Buna ek olarak, hiPSC kültür protokolünün otomasyonu, paralel olarak daha fazla sayıda hücre hattının kültürünü ve genişlemesini tercih etti. Kullanıcı laboratuvardayken gerçekleştirilen akış aşağı işlem adımları için (örn. hücrelerin hasat edilmesi veya farklılaştırmalar için manuel rekaplama) için gün boyunca sistemden tasarruf sağlayan bir gecede yapılması planlanan otomatik birleştirme kontrolleri. Kullanıcı tarafından tanımlanan birleştirme eşiğine ulaşılırken, hücreler otomatik hücre kültür sisteminin istifleyicisinde bulunan hücre dışı matris kaplı plakalara dönüştürülür ve doldurulır. Her pasaj yuvarlak yaklaşık 70 dakika sürer ve bir ana plaka, bir gün içinde 20 pasajlar kapasitesi anlamına gelir dört 1-iyi plakalar üretir.
NGN2 farklılaşma protokolünün otomasyonu başarılı bir şekilde yapıldı ve farklı pasajlar arasında homojen nöronal hücre popülasyonunun oluşmasına ve manuel farklılaşmalarla karşılaştırılabilir bir popülasyonun oluşmasına olanak sağladı. Ayrıca, birden fazla hücre hattı veya binlerce test koşulları/bileşikiçeren tarama deneylerini içeren büyük ölçekli tarama çalışmalarının deneysel maliyetleri, hızlı farklılaşmalar nedeniyle azalacaktır. Canlı hücre neurite outgrowth ölçümleri de dahil olmak üzere maliyet-etkin ve yüksek iş çıkışlı okumalar kolayca geliştirilebilir, uygulanabilir ve hastalık modelleme için henotypic okumalar olarak kullanılabilir, daha önce gösterildiği gibi14,15,16. Böylece NGN2 protokolünü, gfp'yi aşırı ifade eden küçük molekül türemiş nöral öncül (smNPC) hücreleri kullanarak da uyarladık. SmNPC hücreleri, kültür medyasıyla daha az maliyet (iPSC kültürüne sahip maliyetin üçte biri) ve deneyleri ölçeklendirmek için gereken süre dahil olmak üzere daha fazla avantaj sunar. SMNPC'den alınan hücre verimleri iPSC ile elde edilenden 7 ila 10 kat daha yüksektir. Ayırt edici nöronlar, manuel antikor boyamalarına veya kimyasal etiketlemeye ihtiyaç duymadan tam otomatik görüntüleme işlemi kullanılarak birkaç gün boyunca başarıyla izlendi ve görüntülendi, maliyetlerden ve tek başına görüntüleme de dahil olmak üzere manuel işlemler için gereken zamandan tasarruf edildi. 96 kuyulu bir plakanın iç 60 kuyunun mevcut görüntülemesi, kuyu başına 25 alan görüntülendiğinde plaka başına yaklaşık 16 dakika sürer, bu da 1000 bileşik için görüntüleme tabanlı tarama verilerinin bir günde elde edilip analiz edilebildiği anlamına gelir. Gelecekte, bu okuma nötrit büyüme kusurları nın kurtarılması için bileşik tarama çalışmalarında kullanılabilir.
Ayrıca, biz de iPSC orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronlar üretmek için manuel bir diferansiyasyon protokolü transferi göstermektedir. Bu küçük molekül tabanlı farklılaşma protokolü 65 gün sürer ve birden fazla replating adımları ve sık medya değişiklikleri nedeniyle emek yoğun, çoğunlukla her 2 gün, aynı anda birkaç iPSC hatları için mDA nöronların üretimini sınırlar. Otomatik mDA farklılaştırma protokolü, düzinelerce iPSC satırına farklılaşmayı ölçeklendirme nin büyük avantajına sahiptir. 30 hücre hattına kadar paralel olarak ayırt edilebilir. Farklılaşma çoğunlukla medya değişikliklerine dayandığı için, neredeyse tüm farklılaşma süreci insan müdahalesi olmadan yürütülebilir. Otomatik sistemin takvim tabanlı zamanlayıcısı'nı kullanarak, ortam değişikliklerini farklılaşma adımlarına göre planlayabiliriz. Bu kadar çok sayıda hücre hattı ve kültür plakasıyla çalışmanın bir sınırlaması, bir gecede medya değişiklikleri gerçekleştirmek imkansızlıktı. Bunun temel nedeni, sistemimizin tek kullanımlık ipuçları nı kullanmak ve bu manuel adımı yürütmek için laboratuvarda bir kullanıcıgerektiren kültür ortamının manuel olarak doldurulması için kurulmuş olmasıdır. Ortam değiştirme işlemini kolaylaştırmak için, sisteme yüklenen plakalar bir projeye atanmış ve gruplar halinde gruplandırIlmiştir. Toplu iş boyutu daha sonra tek kullanımlık ipuçları ve mevcut kültür ortamının hacmi sayısına uyarlanmıştır. Yukarıda da belirtildiği gibi, bu sınırlama kolayca yeniden kullanılabilir / yıkanabilir iğneler ve medya otomatik dolum uygulanması ile aşılabilir. iPSC için gösterildiği gibi, hücrelerin otomatik geçişi/rekaplaması, otomatik hücre kültür sistemimiztarafından sunulan kolaylıklardan biridir. MDA nöronlarının otomatik rekaplamasını 25. Ancak, mDA nöronların ayrışması iPSC (8 dk) daha dissociation enzimi ile daha uzun (40 dk) kuluçka gerektirir hücre hatları başına 1 saat daha fazla otomatik replating süreci uzanan. Sonuç olarak, aynı gün içinde 30 hücre hattının otomatik rekaplaması imkansız hale geldi. Otomatik rekaplama (plakaların taşınması, pipetleme) sırasında diğer adımların hızlandırılmasını hızlandırmak ve sistemin bir gecede çalışmayı mümkün kılan iğne ve medya hattının kullanımına uyarlanması bu sınırlamayı çözecektir. Sakıncalarına rağmen, manuel protokolü önemli miktarda MAP2 (nöron) ve TH (mDA nöron) pozitif hücrelerle kültür üreten mDA nöronların otomatik bir farklılaşmasına başarıyla aktarabildik.
Düzinelerce iPSC hücre hattını paralel olarak ayırt etmek, Parkinson hastalığı da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların moleküler mekanizmalarını araştıran projelerde büyük ilgi görüyor. Ancak, görevleri daha az hata ve daha düşük maliyetlerle daha hızlı tamamlamak büyük bir sorundur. Burada sunulan protokollerin otomasyonu (iPSC, smNPC ve mDA nöron) sayesinde, projelerimizde hızlanabilir, maliyetleri azaltabilir ve tekrarlanabilirliği artırabiliriz. FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/) gibi yüzlerce hasta hücre hattını içeren projelerin geliştirilmesi, otomatik kültür ve farklılaşma protokollerine duyulan ihtiyacı göstermektedir. Gelecekteki bakış açılarımız manuel 3 boyutlu (3D) hücre kültürü modellerinin otomatik sisteme aktarılmasını içerir. Plaka tanım ayarlarındaki küçük uyarlamalar ve adaptörlerin kullanımı, 3B kültürler için gerekli olan ticari veya özel yapım plakaların ve mikroakışkan odaların kullanılmasına olanak sağlayacaktır. Ayrıca, otomatik bir etiketsiz görüntüleme modelinin uygulanması bize gerçek zamanlı olarak nöronal büyüme izlemek ve neurite outgrowth değişiklikleri çevirmek sağlayacak, nöron organizasyon ve hücre ölümü hastalık mekanizmaları daha iyi anlaşılması içine.

İnsan indüklenen pluripotent kök hücreler (hiPSC) kendi kendini yenileyen ve hemen hemen her yetişkin hücre tipinde ayırt edebilirsiniz. Bu özellikler hiPSC temel araştırma ve ilaç keşif1hastalık modelleme için yararlı bir araç olun. İnsan iPSC en çok etkilenen / hastalık ders dahil hastalık ile ilgili hücre tipleri türetilmesi sağlayan donör genetik arka plan korur, örneğin, nörodejeneratif hastalıklar için farklı nöronal alt tipleri2,3. Ayrıca, hiPSC bir insan bağlamında ve fizyolojik protein ekspresyonu düzeyleri hastalıkları modelleyerek hayvan ve hücresel aşırı ekspresyon modellerinin bazı sınırlamalar üstesinden gelir ve monojenik arasında değişen hastalıkların modelleme değerli bir varlık olduğu kanıtlanmıştır, karmaşık ve epigenetik bozukluklar yanı sıra geç başlangıçlı hastalıklar4.
Bu avantajlara ve fırsatlara rağmen, hiPSC'nin çeşitli sınırlamalarının hala ele alınması gerekmektedir. Mevcut hiPSC kültürü ve farklılaşma protokolleri uygun maliyetli değildir, standartlaştırılması zordur ve emek yoğundur. Manuel kültür adımları, büyüme deki farklılıklar ve hiPSC'nin spontan farklılaşması nedeniyle verimve fenotiplerde yüksek değişkenliğe neden olabilir. Bu nedenle, daha standart işleme teknikleri uygulanarak ve otomasyon5kullanılarak elde edilebilen protokolleri basitleştirerek deneyciye bağımlı varyasyonun azaltılması gerekmektedir. Otomatik hiPSC kültürünün ve farklılaşma protokollerinin oluşturulması hem akademik hem de endüstriyel araştırma projeleri için ortak standartlar belirleyecek ve biyolojik olarak ilgili hastalık modellerinin ve daha tekrarlanabilir sonuçların oluşturulmasına olanak sağlayacaktır.
Önceki çalışma hiPSC kültürlerin otomasyon çalıştı6,7,8 ama protokolleri sisteme bağlı belirli hücre kültürü plaka biçimleri ile sınırlı ve farklı test biçimlerine adaptasyon yoksun. Bu tür sistemler hücrelerin şişirilmesinde yararlıdır, ancak istenilen hücre tipleri, hastalık fenotipleme ve tarama amaçlarına otomatik farklılaşma için uygun olmayabilir. Ayrıca, fibroblast türevi, hiPSC üretimi ve farklılaşması için büyük ölçekli bir otomatik platform9 tarif edilmiştir ama sadece çekici görünüyor ama birçok akademik laboratuvarlar için karşılanamaz olabilir hatların üretimine adanmış yüksek iş gücü laboratuvarları tarafından elde edilebilir bir ölçekte.
Yüksek Verimli Partikül Hava (HEPA) filtreli bir ortamda, büyük kapasiteli CO2 kuluçka makinesi, parlak alan görüntüleme sitometresi ve plaka taşıma için robotik bir kol ile birlikte sıvı taşıma istasyonuna dayalı tam otomatik bir hücre kültür sistemi geliştirdik. Bu bileşenler kararlı ve tekrarlanabilir hiPSC kültürü ve farklılaşması için temel sağlar. Sistemi bileşik veya virüs depolama için otomatik -20 °C depolama sistemi ve yüksek hızlı dönen disk konfokal canlı hücre görüntüleyicisi ile tamamladık. Özel yapım protokoller otomatik hücre tohumlama, medya değişiklikleri, birleştirme kontrolleri, hücre genişletme ve numune tedavisi ve plaka görüntüleme ile test plakası üretimi, sistem yüksek içerik / yüksek iş letimatları ile uyumlu hale izin oluşturuldu. Otomatik hücre kültürü ve görüntüleme sistemi, kontrol yazılımı ve özel yapım grafik kullanıcı arabirimi (GUI) kullanılarak işletilmektedir. GUI, kullanıcıların yöntem yürütülmesi için gereken hücre satırına özgü parametreleri içeren CSV dosyalarını almalarına olanak tanır. Ayrıca GUI, yerleşik takvim görünümünü kullanarak herhangi bir dizide çok sayıda deneme zamanlamasını sağlayarak her yöntemin başladığı zaman tam denetimini sağlar.
Otomatik hücre kültür sistemimiz, çeşitli plaka formatlarında (96-, 48-, 24-, 12-, 6- veya 1-well plaka formatında) kültür hücrelerine esneklik ile standartlaştırılmış pipetleme hızları, geçiş süreleri, birleştirme eşikleri, tohumlama yoğunlukları ve orta hacimler kullanır. Biz 6 gün içinde TUBB3 pozitif nöronlar verebilir nöronlar içine hiPSC dönüştürmek için yeni yayınlanan kısa vadeli farklılaşma protokolü uyarlanmış10,11. Ayrıca, ef1a promotörü12 ve iPSC altında GFP'yi orta beyinli dopaminerjik (mDA) nöronlara dönüştüren ve 65 gün içinde mDA nöronlarını veren daha önce yayınlanmış çift SMAD inhibisyonu protokol13'ü uyarlayan nöronlara (smNPC) otomatik farklılaşma ve görüntüleme yi kurduk.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SSEA4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16287</td>
			<td>1 to 33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Oct3/4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab19857</td>
			<td>1 to 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti- TUBB3</td>
			<td>R &#38; D</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>1 to 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-BRN2</td>
			<td>NEB</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neuron markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-TH</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>12137</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-74421</td>
			<td>1 to 750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11032</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>1 to 2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei counterstaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechest 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1 to 8,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent TapeStation system</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>4200</td>
			<td>Automated electrophoresis 
			for DNA and RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated -20 &#176;C storage system</td>
			<td>Hamilton Storage 
			Technologies</td>
			<td>Sample Access Manager 
			(SAM -20C, 3200 series)</td>
			<td>Storage of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode reader</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>Barcode Reader Orbit</td>
			<td>Barcode scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield cell cytomat</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>Celigo</td>
			<td>Confluence check and 
			cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellVoyager 7000</td>
			<td>Automated confocal 
			microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for cell cultures</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 24 C, CU</td>
			<td>12 stackers pitch 28 mm, 
			12 stackers pitch 23 mm 
			(total of 456 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytomat for thawing samples</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cytomat 2-LIN, 60 DU 
			(Drying Unit)</td>
			<td>2 stackers pitch 28 mm 
			(total of 42 plates)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPA filters</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Hood Flow Star UV</td>
			<td>Modified by Hamilton 
			Robotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid handling station</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Microlab Star</td>
			<td>Channels: 8x 1-ml, 4x 5 ml 
			and 96 Channel MPH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media reservoir</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>188211APE</td>
			<td>Media/reagents reservoir</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water system</td>
			<td>Veolia Water</td>
			<td>ELGA PURELAB Classic</td>
			<td>Provides pure water for 
			needle wash station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Real-Time 
			PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>QSTUDIO12KOA</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Rackrunner</td>
			<td>Transport of plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turn table</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Turn Table</td>
			<td>Adjust plate orientiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterruptible power supply</td>
			<td>APC</td>
			<td>Smart UPS RT Unit, 
			10000 VA Power supply</td>
			<td>Backup power supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIAFLO-pipettes</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4500</td>
			<td>Electronic pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4453545</td>
			<td>Real-time PCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well culture plate (84 cm2)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td>Nunc OmniTray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates (9.6 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657160</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plate (3.9 cm2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td>TC treated with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well culture plate (0.32 cm2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005558</td>
			<td>CellCarrier-96 Black plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 50-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235987</td>
			<td>50-uL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 300-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235985</td>
			<td>300-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 1000-&#181;L</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>235939</td>
			<td>1000-&#181;L tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips, 5-mL</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>184022</td>
			<td>5-mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 15-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>15-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes, 50-mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>50-mL tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene cryogenic 2.0 mL vials</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V5007</td>
			<td>Cryovials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Notes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_hEF1a_rtTA3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61472</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>61474</td>
			<td>Kind gift from Ron Weiss</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 lentivirus</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>631983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sequence (forward)</td>
			<td>Sequence (reverse)</td>
			<td>Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC pluripotency</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4 (ID 4505967a1)</td>
			<td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td>
			<td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NANOG (ID 153945815c3)</td>
			<td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td>
			<td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REX1 (ID 89179322c1)</td>
			<td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td>
			<td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2 (ID 87578393c1)</td>
			<td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>
			<td>CATTGGCGCTTCGGACAAG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN2 (ID 380254475c1)</td>
			<td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT</td>
			<td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUX2 (ID 291045458c2)</td>
			<td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td>
			<td>TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCAM1 (ID 336285437c3)</td>
			<td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC</td>
			<td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYNAPSIN1 (ID 91984783c3)</td>
			<td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td>
			<td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td>
			<td>PrimerBank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH</td>
			<td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTGTA</td>
			<td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td>
			<td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Housekeeping genes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH</td>
			<td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td>
			<td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OAZ1</td>
			<td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td>
			<td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLPO</td>
			<td>CCTCATATCCGGGGGAATGTG</td>
			<td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPL13A</td>
			<td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td>
			<td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td>
			<td>NCBI primer-BLAST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td>Distributor</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Use concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix (Matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td>2 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 - 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine (PLO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3655</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC culture medium 
			(Essential 8 Flex medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - NGN2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.909 mL (50 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331093</td>
			<td>484.75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL ( 2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>0.25 mL (2.5 &#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (0.5%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - SRM medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>0.5 mL (55 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>409.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout serum replacement 
			(serum replacement)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>75 mL (15%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - N2 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>5 mL (2 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>475 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL(1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Differentiation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td>10 mL (2%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>485 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>5 mL (1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGN2 neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycyline (dox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891</td>
			<td>2.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate 
			magnesium (AA2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td>64 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrophic factor-3 (NT-3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (PMA)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8833-10MG</td>
			<td>0.5 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazovivin</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>420220-10MG</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mDA neurons - Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor 
			(BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (CHIR)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>4423/10</td>
			<td>3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13197</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 8B (FGF-8b)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-25</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor 
			(GDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid (AA1)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4403</td>
			<td>0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189 (LDN)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>11802</td>
			<td>100 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine (Purm)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10009634</td>
			<td>2 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Hedgehog/Shh (C24II) 
			N-Terminus (SHH)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>1845-SH</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542 (SB)</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>13031</td>
			<td>10 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor type &#223;3 
			(TGF&#223;3)</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>243-B3</td>
			<td>1 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>10005583</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissociation reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell dissociation reagent 
			(StemPro Accutase)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11575020</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation and cDNA kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA isolation kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>Rneasy MiniKit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA lysis buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>Trizol lysis buffer (RNA 
			lysis buffer)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcriptase (kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080-085</td>
			<td>SuperScript III Reverse 
			Transcriptase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Description/Application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Framework (CCF) 
			(Graphical user interface, GUI)</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>User interface for the automated system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellPathFinder software 
			(image analysis software 1)</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CellPathfinder HCS Software</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellVoyager Measurement System</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>Included with 
			CellVoyager 7000</td>
			<td>Microscope controlling 
			software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus software 
			(image analysis software 2)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Columbus</td>
			<td>Image analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloud based qPCR app</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Themo Fisher cloud</td>
			<td>Analysis software for 
			qRT-PCR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Venus software</td>
			<td>Hamilton Robotics</td>
			<td>VENUS Two Dynamic 
			Schedular 5.1 Software</td>
			<td>Controlling software for the 
			automated system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated production of human induced pluripotent stem cell-derived cortical and dopaminergic neurons with integrated live-cell monitoring

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC) manuel kültür ve farklılaşma protokolleri standartlaştırmak, yüksek değişkenlik göstermek ve istenmeyen hücre tiplerine spontan farklılaşmayatkındır. Yöntemler emek yoğundur ve büyük ölçekli deneylere kolayca uygun değildir. Bu sınırlamaları aşmak için, yüksek iş letimatif görüntüleme sistemiyle birleşen otomatik bir hücre kültür sistemi geliştirdik ve paralel ve nöronal farklılaşmada birden fazla hiPSC hattını korumak için protokoller uyguladık. 6\u20128 gün içinde hiPSC kaynaklı kortikal nöronlar üretmek için Neurogenin-2 (NGN2) aşırı ekspresyonu kullanarak kısa süreli bir farklılaşma protokolünün otomasyonunu ve 65 gün içinde hiPSC kaynaklı orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronları üretmek için uzun vadeli bir ayırım protokolünün uygulanmasını tanımladık. Ayrıca, GFP lentivirus ile transekküçük bir molekül türevi nöral öncül hücrelere (smNPC) NGN2 yaklaşımını uyguladık ve canlı hücre otomatik neurite outgrowth testi oluşturduk. Rutin hiPSC kültürüne ve kortikal ve dopaminerjik nöronlara farklılaşmaya uygun protokollere sahip otomatik bir sistem salıyoruz. Platformumuz, yeni hastalık mekanizmalarını ve ilaç hedeflerini belirlemek için uzun vadeli eller serbest kültür ve yüksek içerikli/yüksek içerikli hiPSC tabanlı bileşik, RNAi ve CRISPR/Cas9 gösterimleri için uygundur.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring at JoVE.com

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kültürlerinin otomasyonu ve otomatik görüntüleme ve analiz ile uyumlu nöronal farklılasyonlar gösteriyoruz.

Entegre Canlı Hücre İzleme ile İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kortikal ve Dopaminerjik Nöronların Otomatik Üretimi

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

Bu çalışmanın genel amacı, insan IPS hücrelerinin nöronal soylara dönüştürülmesi ve farklılaştırılması için otomatik prosedürlerin nasıl uygulanacağını ve bunların otomatik görüntülemesini göstermektir. Standartlaştırılmış otomatik prosedürler, yüksek henotypik tekrarlanabilirlik sağlarken düşük deneysel varyasyon sağlar. Buna ek olarak, sistem yeni protokollerin geliştirilmesi için uyarlanabilir.Prosedürleri gösteren joachim Tager ve Elisangela Bressan, laboratuarımızdan post-docs olacaktır. Otomatik sistemin grafik kullanıcı arabiriminde, kaynak enstrüman ı işlem görünümünü tıklatın ve kaynak enstrümanı işlemini seçin. Çalıştır enstrüman işlemini tıklatın ve çalıştırılaç HEPA başlık ve yeniden yükleme işlemlerini çalıştırın.Yüklenecek kaynakları seçin, kapıyı açın ve hücre kültür plakalarını ve tek kullanımlık ipuçlarını açılır görüntülerde belirtildiği gibi uygun konumlara yükleyin. Daha sonra kapanmadan önce kapıyı %70 etanol ile dezenfekte edin ve dekontaminasyon işlemini çalıştırın. Sistem 30 dakika boyunca UV radyasyonu ile sterilize edilecektir.Plakaları kültür ortamı veya dissosiasyon reaktifi ile yüklemek için, run HEPA başlık adımını uygulayın ve sıvı taşıma istasyonunun kapısını açın. %70 etanol ile dekontaminasyondan sonra, rezervuarları güverteye atanan konuma yerleştirin ve kapağını kapatın. Sıvı işleme istasyonunun kapısını kapatın ve HEPA kaputunu kapatmak için InitHepaHood kaynak enstrümanı işlemini çalıştırın.Otomatik bir kültür yöntemini yürütmek için, grafik kullanıcı arabiriminin takvim görünümünde, işlem adımı ekle'yi tıklatın ve denemede kullanılacak hücre satırını seçin. Projeyi seçmek ve kullanılacak toplu işlemi işaretlemek için sihirbazı kullanın. Sağdaki ok ucuna tıklayın ve yürütülecek işlem adımını seçmek için sihirbazın bir sonraki sayfasına gidin.Sihirbazın son sayfasında, denemeyi zamanlayın ve yöntemi çalıştırmak için gerekli uygun parametreleri ayrıntıları değişkenlerini ayarlayın. Ardından Tamam'ı tıklatın. 50 mililitrelik bir tüpü insan IPS hücre süspansiyonu ile yükledikten sonra, raftaki hücreleri almak için kaplamalı kültür plakaları yükleyin ve tüpler yönteminden plakaların tohumlama yürütmek. Brightfield görüntüleme sitometresindeki hücreleri saymak için, güvertede hücre süspansiyonu olan 384 kuyulu bir sayma plakası otomatik olarak hazırlayın ve 384 kuyudaki sayma plakasını güverteden Brightfield görüntüleme sitometresine aktarmak için robotik kolu kullanın.Sayım dan sonra, sistem plakayı orijinal konumuna döndürecek ve kaplamalı bir kültür veya istinat plakasını raftan pipetleme güvertesine aktaracaktır. Sistem daha sonra hücreleri kullanıcı tarafından tanımlanan sayı ve hacimlerde plakaya uygun olarak tohumlayacak ve pipetleme ile karıştıracaktır. Tohumlamadan sonra, plaka karbondioksit kuvöze aktarılmadan önce hücre dağıtımı için dakikada 500 devirde 10 saniye boyunca güvertede çalkalayıcıya taşınır.Otomatik birleşimi değerlendirmek için, denetim birleştirme yöntemini uygulayın ve en az bir kültür plakası ve hiçbir deneme plakası içeren bir toplu iş seçin. Parametreler ayrıntı bölümünde, görüntüleme analizi ayarlarına görüntü edinme için iPSCf_2020 girin. Sistem daha sonra ilk plakayı kuvözden Brightfield görüntüleme sitometresine aktaracak ve hücre birleşimini görüntüleyecek.Hücre kültürünü veya test plakası ortamını değiştirmek için, kültür plakaları yönteminin ortam değişikliğini uygulayın ve yalnızca kültür plakaları içeren bir toplu iş seçin. Sistem plakaları güverteye aktaracak ve plakaları yatıracak ve süpernatantın aspirasyonuna izin verecek. Supernatant atık toplama modülüne atılır ve uçları atılır ve her plakaya 12 mililitre taze ortam eklenecektir.Sistem daha sonra plakaları yeniden kapatacak ve plakaları hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürecek. Alternatif olarak, test plakalarının ortasını değiştirmek için, test plakaları yönteminin ortam değişimini gerçekleştirin. Hücreleri alt işlemek için, yapışık hücrelerin alt ekimi yöntemini uygulayın ve alt ekimi gereken kültür plakalarını içeren toplu işlemi seçin.Orta attıktan sonra, sistem hücrelere 0.5 milimolar EDTA sekiz mililitre eklemeden önce plaka başına pbs sekiz mililitre ile bir kez hücreleri yıkayın. Eğilme seçeneği ile güvertede sekiz dakika sonra, EDTA plaka başına taze orta 12 mililitre ile değiştirilecektir. Sistem, kolonileri 50 ila 80 mikron kümelere ayırmak için beş döngü boruyla hücreleri üçe ayırmadan önce kolonileri yerinden çıkarmak için dakikada 2,000 devirde plakaları sallayacak.Hücreler daha sonra bir-yedi bölünmüş oranda tohumlama önce güvertede 50 mililitrelik tüp aktarılacaktır. Otomatik yüksek içerik, yüksek iş grubu hücre görüntüleme için görüntüleme yöntemini uygulayın ve en az bir test plakası ve kültür plakası içermeyen bir toplu iş seçin. Sistem daha sonra görüntüleme için otomatik konfokal mikroskoba bir araştırma plakası aktaracaktır.Gerekli işlem adımlarını gerçekleştirirken doğru toplu iş ve plaka adlarını seçtiğinizden emin olun. HiPSC kültürleri büyüme için günlük olarak izlenmeli ve Brightfield görüntüleme sitometresinde biraraya gelen yüzdeleri için analiz edilmelidir. Passaging ve manuel veya otomatik sistem kültürü sonra, hücreler tipik bir kök hücre ve pluripotency marker ekspresyonu sergiler.Otomatik kültür sisteminde farklılaşan nöronlar, manuel olarak yetiştirilen nöronlara benzer morfoloji ve nöronal ağ organizasyonu gösterir. Altı günlük farklılaşmadan sonra, otomatik olarak diferansiye kortikal nöronlar nörona özgü sınıf III beta-tübulin ve üst kortikal tabaka belirteç ekspresyonu için pozitiftir. Sekiz gün sonra, hücreler de mikrotübül ilişkili protein ifade 2, nöral hücre adezyon molekülü, ve sinapsin I, yanı sıra kortikal nöron belirteçleri.HiPSC'de bu belirteçlerin çok düşük veya hiç ekspresyonu gözlenmez. Bu sistem aynı zamanda manuel müdahale olmadan farklılaşma 11 gün boyunca ölçülebilir neurite uzunlukları sağlayan bir canlı hücre otomatik neurite outgrowth çıkış tsay kurmak için kullanılabilir. 65 günlük bir kültür döneminde orta değişiklikler gerçekleştirmek için otomatik kültür sisteminin kullanılması beklenen hücresel organizasyon ve morfoloji ile orta beyin dopaminerjik nöronlar içine hiPSC farklılaşmasını kolaylaştırır.Nötrit çıkıntısına ek olarak, nörodejenerasyonu incelemek le ilgili diğer otomatik henotik tahliller, örneğin, TDP-43 translokasyon RNA foci ve alfa-sinüklein fibril alımı, bu yüksek iş üretimi, yüksek içerik biçimi kullanılarak incelenebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...