Name: detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice
Uploaded: 2020-07-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice at JoVE.com

نشكر سارة ويليامز ، دكتوراه ، من مجموعة Edanz (www.edanzediting.com) لتحرير مسودة هذه المخطوطة.

تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة جيتشي الطبية والامتثال لإرشادات استخدام ورعاية التجارب من دليل جامعة جيتشي الطبية لحيوانات المختبر.
1. الحصول على عينات الكلى من الفئران HIGA
ملاحظة: تظهر الفئران HIGA نمطا ظاهريا مستقرا ?...

<ol>
	<li>Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+Nephropathy.">IgA Nephropathy.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).</li><li>Szeto, C. C., Li, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+IgA+nephropathy.">MicroRNAs in IgA nephropathy.</a> Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).</li><li>Wyatt, R. J., Julian, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+nephropathy.">IgA nephropathy.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).</li><li>Vishnoi, A., Rani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA+Biogenesis+and+Regulation+of+Diseases:+An+Overview.">MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).</li><li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics:+towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases.">MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).</li><li>Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+miR-148b+expression+promotes+aberrant+glycosylation+of+IgA1+in+IgA+nephropathy.">Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).</li><li>Serino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+a+retrospective+international+study,+circulating+miR-148b+and+let-7b+were+found+to+be+serum+markers+for+detecting+primary+IgA+nephropathy.">In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy.</a> Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).</li><li>Muso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+production+of+glomerular+extracellular+matrix+in+a+new+mouse+strain+of+high+serum+IgA+ddY+mice.">Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice.</a> Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).</li><li>Kurano, M., Yatomi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gas+chromatography+mass+spectrometry+to+elucidate+metabolites+predicting+the+phenotypes+of+IgA+nephropathy+in+hyper+IgA+mice.">Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice.</a> Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).</li><li>Hyun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy.">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li><li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade.">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification.">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy.">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li><li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy.">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li></ol>

تمكنا من قياس مستويات التعبير عن miRNAs في كليتي فأر اعتلال الكلية IgA (فئران HIGA) باستخدام هذه الطريقة الجديدة. اعتلال الكلية IgA هو مرض غير مبرر يحتاج إلى مزيد من البحث لتوضيح مسبباته وأهدافه العلاجية 1,3. ومع ذلك ، فإن الحصول على عينات الكلى البشرية أمر شديد التوغ?...

اعتلال الكلية المناعي A (IgA) هو نوع من التهاب كبيبات الكلى الأولي الذي يتميز بالترسب غير الطبيعي ل IgA في المنطقة المتوسطة الكبيبية الكلوية 1,2. هذا هو الأكثر شيوعا من التهاب كبيبات الكلى الأولي ويؤدي إلى الفشل الكلوي في المرحلة النهائية في 20 ٪ -40 ٪ من المرضى2. لا يزال السبب غير معروف ولكن العدوى المخاطية المستمرة متورطة 1,3. تم اقتراح الستيرويدات القشرية ومثبطات المناعة ومثبطات نظام الرينين أنجيوتنسين كطرق علاجية1،3 ، ولكن لم يتم تأسيسها بالكامل 3. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتوضيح المسببات والطرق العلاجية لعلاج اعتلال الكلية IgA.
microRNAs (miRNAs) هي RNAs صغيرة غير مشفرة تلعب دورا مهما في تنظيم التعبير الجيني 4,5. تم الإبلاغ عن أن miRNAs متورطة في التسبب في أمراض مختلفة ، وقد تم تحديد بعضها كمؤشرات حيوية للمرض وعوامل علاجية 4,5. في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ أيضا عن ارتباط بين miRNAs والتسبب في اعتلال الكلية IgA2،6،7. على سبيل المثال ، تبين أن miR-148b متورط في التشوهات الهيكلية ل IgA في المرضى الذين يعانون من اعتلال الكلية IgA2،6،7 ، بينما تم توثيق miR-148b و let-7b كمؤشرات حيوية جديدة للكشف عن اعتلال الكلية IgA 7. على الرغم من أن فهم آثار miRNAs على اعتلال الكلية IgA قد يساعد في توضيح المسببات والعلاج 2 ، إلا أن الطرق القياسية لتحديد سمات miRNAs في اعتلال الكلية IgA باستخدام نماذج حيوانية صغيرة لم يتم تحديدها بعد2.
لقد طورنا هنا طريقة بسيطة وموثوقة لقياس مستويات تعبير miRNA في كليتي نموذج فأر اعتلال الكلية IgA (فئران HIGA). فأر HIGA هو سلالة DDY مميزة تظهر مستوى مرتفعا بشكل خاص من مصل IgA وترسب غير طبيعي ل IgA في كبيبات الكلى8،9،10،11. لذلك ، يمكن استخدام الفئران HIGA كنموذج فأر اعتلال الكلية IgA8،9،10،11. تتكون طريقتنا من أربع خطوات رئيسية: أولا ، الحصول جراحيا على عينات الكلى من فئران HIGA. ثانيا ، تجانس العينات وتنقية الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا ؛ ثالثا ، توليف الحمض النووي المكمل (cDNA) من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي ؛ ورابعا ، الكشف عن مستويات التعبير عن miRNA بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR). ويستند الأساس المنطقي لهذه الطريقة وموثوقية النتائج إلى التقارير السابقة12,13. لقد أظهرنا أن هذه تقنية مفيدة لقياس مستويات تعبير miRNA بدقة في نموذج فأر اعتلال الكلية IgA ، وأنه يمكن استخدامه لتسهيل البحث المستقبلي في miRNAs في اعتلال الكلية IgA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/cCrSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>Mouse for control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGA/NscSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>IgA nephropathy mouse model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Experimental kit for synthesis of cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Experimental kit fot extraction of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (RNU6-2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-155-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-146a-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-21-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Experimental kit for real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice

اعتلال الكلية بالغلوبولين المناعي A (IgA) هو نوع من التهاب كبيبات الكلى الأولي الذي يتميز بالترسب غير الطبيعي ل IgA ، مما يؤدي إلى الفشل الكلوي في المرحلة النهائية. في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ عن تورط microRNAs (miRNAs) في التسبب في اعتلال الكلية IgA. ومع ذلك ، لا توجد طريقة ثابتة لتحديد سمات miRNAs في اعتلال الكلية IgA باستخدام نماذج حيوانية صغيرة. لذلك ، قمنا بتطوير طريقة موثوقة لتحليل miRNA في كلية نموذج الماوس IgA (ماوس HIGA). الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن مستويات التعبير المتغيرة لل miRNAs في كليتي الفئران HIGA عند مقارنتها بالمستويات الموجودة في الكلى للفئران الضابطة. باختصار ، تتكون هذه الطريقة من أربع خطوات: 1) الحصول على عينات الكلى من الفئران HIGA. 2) تنقية الحمض النووي الريبي الكلي من عينات الكلى. 3) توليف الحمض النووي التكميلي من إجمالي الحمض النووي الريبي ؛ و 4) تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) ل miRNAs. باستخدام هذه الطريقة ، اكتشفنا بنجاح مستويات التعبير للعديد من miRNAs (miR-155-5p و miR-146a-5p و miR-21-5p) في كليتي فئران HIGA. يمكن تطبيق هذه الطريقة الجديدة على دراسات أخرى تنميط miRNAs في اعتلال الكلية IgA.

قمنا بالتحقيق في مستويات التعبير عن miRNAs في كليتي الفئران HIGA (ن = 10). تم الحصول على هذه النتيجة بالكامل بناء على البروتوكول الموصوف. تم اختيار كليتي فئران Balb / c كعنصر تحكم (n = 10). في كلتا المجموعتين ، تم اختيار الذين تتراوح أعمارهم بين 25 أسبوعا. كانت إناث الفئران HIGA فقط متاحة من المورد. مستويات ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice at JoVE.com

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

وتشارك microRNAs في التسبب في اعتلال الكلية IgA. لقد طورنا طريقة موثوقة للكشف عن مستويات تعبير microRNA في كليتي نموذج فأر اعتلال الكلية IgA (فئران HIGA). ستسهل هذه الطريقة الجديدة التحقق من تورط miRNAs في اعتلال الكلية IgA.

الكشف عن تعبير MicroRNA في كليتي الغلوبولين المناعي A الفئران الكلوية

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

تحريض التهاب النخامية الذاتية التجريبية في الفئران SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

4D التصوير تعدد الوسائط من<em&gt; الليمونية rodentium</em&gt; التهابات في الفئران

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

قياس الحساسية المفرطة المحلية في الفئران

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

التنظيم القائم على الرنا الميكروي من فيروسة بيكورناوية مع الأجسام

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

وصف الاستجابات ايستب الغلوبولين المناعي تعتمد على الغدة الصعترية، والغدة الصعترية مستقلة في الفئران باستخدام مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

ميكرورنا الرئة "التنميط عبر الشبقية دورة" في الفئران المعرضة للأوزون

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

تقييم استجابات المضيف الممرض ونجاعة اللقاح في الفئران

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...