Name: detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice
Uploaded: 2020-07-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice at JoVE.com

이 원고의 초안을 편집해 주신 Edanz Group(www.edanzediting.com)의 Sarah Williams 박사에게 감사드립니다.

동물 실험은 Jichi Medical University의 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals의 실험 동물 사용 및 관리 지침을 준수합니다.
1. HIGA 마우스에서 신장 샘플 채취
참고: HIGA 마우스는 생후25주 후에 IgA 신병증의 안정적인 표현형을 나타낸다 8,9,10,11.<...

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	<li>Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+Nephropathy.">IgA Nephropathy.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).</li><li>Szeto, C. C., Li, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+IgA+nephropathy.">MicroRNAs in IgA nephropathy.</a> Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).</li><li>Wyatt, R. J., Julian, B. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy.">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li><li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade.">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification.">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy.">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li><li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy.">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li></ol>

우리는 이 새로운 방법을 사용하여 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있었습니다. IgA 신병증은 원인 및 치료 목표를 명확히 하기 위해 추가 연구가 필요한 설명할 수 없는 질병이다 1,3. 그러나 인간 신장 샘플을 얻는 것은 매우 침습적입니다. 이 새로운 기술은 작은 동물을 이용한 IgA 신병증의 연구를 가능하게...

면역글로불린 A(IgA) 신병증은 신장 사구체 간질 영역 1,2에 IgA가 비정상적으로 침착되는 것을 특징으로 하는 원발성 사구체신염의 일종입니다. 원발성 사구체신염 중 가장 흔하며 환자의 20%-40%에서 말기 신부전을 유발한다2. 원인은 아직 밝혀지지 않았으나 지속적인 점막 감염이 연루되어 있다 1,3. 코르티코스테로이드, 면역억제제 및 레닌-안지오텐신계 억제제가 치료 방법으로 제안되었으나 1,3 완전히 확립되지는 않았다 3. 따라서 IgA 신증 치료의 병인 및 치료 방법을 명확히 하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
microRNA(miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 작은 비암호화 RNA입니다 4,5. miRNA는 다양한 질병의 발병기전에 관여하는 것으로 보고되어 있으며, 일부는 질병 바이오마커 및 치료제로 확인되고 있다 4,5. 최근에, miRNA와 IgA 신병증의 발병기전 사이의 연관성이 또한 보고되었다 2,6,7. 예를 들어, miR-148b는 IgA 신병증환자에서 IgA의 구조적 이상에 관여하는 것으로 나타났으며, miR-148b 및 let-7b는 IgA 신병증을 검출하기 위한 새로운 바이오마커로 기록되었다7. IgA 신병증에 대한 miRNA의 효과를 이해하면 병인과 치료법을 더 명확히 하는 데 도움이 될 수 있지만2, 소동물 모델을 사용하여 IgA 신증에서 miRNA를 프로파일링하는 표준 방법은 아직 확립되지 않았습니다2.
본 발명자들은 본원에서 IgA 신병증 마우스 모델 (HIGA 마우스)의 신장에서 miRNA 발현 수준을 측정하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 개발하였다. 상기 HIGA 마우스는 특히 높은 수준의 혈청 IgA 및 신장 사구체에 IgA의 비정상적인 침착을 나타내는 특징적인 ddY 균주이다 8,9,10,11. 따라서, HIGA 마우스는 IgA 신증마우스 모델로 8,9,10,11을 사용할 수 있다. 우리의 방법은 네 가지 주요 단계로 구성됩니다 : 첫째, HIGA 마우스에서 외과 적으로 신장 샘플을 채취합니다. 둘째, 실리카 멤브레인 기반의 스핀 컬럼을 이용하여 시료를 균질화하고 전체 RNA를 정제하는 단계; 셋째, 역전사를 사용하여 전체 RNA로부터 상보적 DNA(cDNA)를 합성하는 단계; 넷째, 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 통해 miRNA의 발현 수준을 검출하는 것이다. 이 방법의 이론적 근거와 결과의 신뢰성은 이전 보고서12,13을 기반으로합니다. 우리는 이것이 IgA 신병증 마우스 모델에서 miRNA 발현 수준을 정확하게 측정하는 데 유용한 기술이며 IgA 신병증에서 miRNA에 대한 향후 연구를 촉진하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/cCrSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>Mouse for control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGA/NscSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>IgA nephropathy mouse model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Experimental kit for synthesis of cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Experimental kit fot extraction of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (RNU6-2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-155-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-146a-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-21-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Experimental kit for real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice

면역 글로불린 A (IgA) 신 병증은 IgA의 비정상적인 침착을 특징으로하는 원발성 사구체 신염의 일종으로 말기 신부전을 유발합니다. 최근에, IgA 신병증의 발병기전에서 microRNA(miRNAs)의 관여가 보고되었다. 그러나 작은 동물 모델을 사용하여 IgA 신병증에서 miRNA를 프로파일링하는 확립된 방법은 없습니다. 따라서 IgA 마우스 모델(HIGA mouse)의 신장에서 miRNA를 분석하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜의 목표는 대조군 마우스의 신장 수준과 비교할 때 HIGA 마우스의 신장에서 miRNA의 변경된 발현 수준을 감지하는 것입니다. 간단히 말해서, 이 방법은 4개의 단계로 구성된다: 1) HIGA 마우스로부터 신장 샘플을 얻고; 2) 신장 샘플로부터 총 RNA를 정제하는 단계; 3) 전체 RNA로부터 상보적 DNA를 합성하는 단계; 및 4) miRNA의 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR). 이 방법을 사용하여 HIGA 마우스의 신장에서 여러 miRNA(miR-155-5p, miR-146a-5p 및 miR-21-5p)의 발현 수준을 성공적으로 검출했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에서 miRNA를 프로파일링하는 다른 연구에 적용할 수 있습니다.

우리는 HIGA 마우스(n=10)의 신장에서 miRNA의 발현 수준을 조사했습니다. 이 결과는 설명된 프로토콜에 따라 완전히 얻어졌습니다. Balb/c 마우스의 신장을 대조군으로 선택했습니다(n=10). 두 그룹 모두에서 25주령을 선택했습니다. 암컷 HIGA 마우스만 공급업체에서 구입할 수 있었습니다. 3개의 miRNA(miR-155-5p, miR-146a-5p, 및 miR-21-5p; 그림 1) IgA 신병증과 관련이 있는 것으로 이전에 보?...

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Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

microRNA는 IgA 신병증의 발병기전에 관여합니다. 우리는 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에 대한 miRNA의 관여를 확인하는 것을 용이하게 할 것입니다.

면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출

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