Name: detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice
Uploaded: 2020-07-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice at JoVE.com

Agradecemos a Sarah Williams, PhD, do Edanz Group (www.edanzediting.com) pela edição de um rascunho deste manuscrito.

Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Jichi Medical University e estão em conformidade com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Obtenção de amostras de rins de camundongos HIGA
NOTA: Camundongos HIGA apresentam fenótipo estável de nefropatia por IgA após 25 semanas de idade 8,9,10,11.<su...

<ol>
	<li>Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+Nephropathy.">IgA Nephropathy.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).</li><li>Szeto, C. C., Li, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+IgA+nephropathy.">MicroRNAs in IgA nephropathy.</a> Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).</li><li>Wyatt, R. J., Julian, B. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics:+towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases.">MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).</li><li>Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+miR-148b+expression+promotes+aberrant+glycosylation+of+IgA1+in+IgA+nephropathy.">Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).</li><li>Serino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+a+retrospective+international+study,+circulating+miR-148b+and+let-7b+were+found+to+be+serum+markers+for+detecting+primary+IgA+nephropathy.">In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy.</a> Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).</li><li>Muso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+production+of+glomerular+extracellular+matrix+in+a+new+mouse+strain+of+high+serum+IgA+ddY+mice.">Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice.</a> Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).</li><li>Kurano, M., Yatomi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gas+chromatography+mass+spectrometry+to+elucidate+metabolites+predicting+the+phenotypes+of+IgA+nephropathy+in+hyper+IgA+mice.">Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice.</a> Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).</li><li>Hyun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy.">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li><li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade.">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification.">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy.">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li><li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy.">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li></ol>

Conseguimos medir os níveis de expressão de miRNAs nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA) usando este novo método. A nefropatia por IgA é uma doença inexplicada que necessita de mais pesquisas para esclarecer sua etiologia e alvosterapêuticos1,3. No entanto, a obtenção de amostras de rim humano é altamente invasiva. Essa nova técnica é vantajosa na medida em que permite o estudo da nefropatia por IgA em pequenos a...

A nefropatia por imunoglobulina A (IgA) é um tipo de glomerulonefrite primária caracterizada pela deposição anormal de IgA na região mesangial glomerular renal 1,2. É a mais comum das glomerulonefrites primárias e leva à insuficiência renal terminal em 20%–40% dos pacientes2. A causa ainda é desconhecida, mas infecção mucosa persistente tem sido implicada 1,3. Corticosteroides, imunossupressores e inibidores do sistema renina−angiotensina têm sido propostos como métodos terapêuticos1,3, mas não estão completamente estabelecidos 3. Portanto, mais pesquisas são necessárias para esclarecer a etiologia e os métodos terapêuticos do tratamento da nefropatia por IgA.
microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificantes que desempenham um papel importante na regulação da expressão gênica 4,5. Há relatos de que os miRNAs estão envolvidos na patogênese de várias doenças, e alguns têm sido identificados como biomarcadores e agentes terapêuticosda doença4,5. Nos últimos anos, uma associação entre miRNAs e a patogênese da nefropatia por IgA também tem sido relatada 2,6,7. Por exemplo, demonstrou-se que o miR-148b está envolvido em anormalidades estruturais da IgA em pacientes com nefropatia por IgA 2,6,7, enquanto o miR-148b e o let-7b foram documentados como novos biomarcadores para detecção de nefropatia por IgA7. Embora a compreensão dos efeitos dos miRNAs na nefropatia por IgA possa ajudar a elucidar melhor a etiologia e o tratamento 2, métodos padrão para o perfil de miRNAs na nefropatia por IgA usando modelos de pequenos animais ainda não foram estabelecidos2.
Desenvolvemos um método simples e confiável para medir os níveis de expressão de miRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). O camundongo HIGA é uma cepa ddY característica, apresentando um nível particularmente alto de IgA sérica e deposição anormal de IgA em glomérulos renais 8,9,10,11. Portanto, camundongos HIGA podem ser usados como modelo de nefropatia por IgAem camundongos 8,9,10,11. Nosso método consiste em quatro etapas principais: primeiro, a obtenção cirúrgica de amostras de rim de camundongos HIGA; segundo, homogeneizar amostras e purificar o RNA total usando uma coluna de spin baseada em membrana de sílica; terceiro, sintetizar DNA complementar (cDNA) a partir de RNA total usando transcrição reversa; e quarto, detecção dos níveis de expressão de miRNA por reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). A justificativa para esse método e a confiabilidade dos resultados são baseadas em relatos anteriores12,13. Mostramos que esta é uma técnica útil para medir com precisão os níveis de expressão de miRNA em um modelo de nefropatia por IgA em camundongos, e que poderia ser usada para facilitar pesquisas futuras sobre miRNAs na nefropatia por IgA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/cCrSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>Mouse for control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGA/NscSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>IgA nephropathy mouse model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Experimental kit for synthesis of cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Experimental kit fot extraction of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (RNU6-2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-155-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-146a-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-21-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Experimental kit for real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice

A nefropatia por imunoglobulina A (IgA) é um tipo de glomerulonefrite primária caracterizada pela deposição anormal de IgA, levando à insuficiência renal terminal. Nos últimos anos, o envolvimento de microRNAs (miRNAs) tem sido relatado na patogênese da nefropatia por IgA. No entanto, não há um método estabelecido para perfilar miRNAs na nefropatia por IgA usando modelos de pequenos animais. Portanto, desenvolvemos um método confiável para analisar miRNA no rim de um modelo de camundongo IgA (camundongo HIGA). O objetivo deste protocolo é detectar os níveis alterados de expressão de miRNAs nos rins de camundongos HIGA quando comparados com os níveis em rins de camundongos controle. Em resumo, esse método consiste em quatro etapas: 1) obtenção de amostras de rim de camundongos HIGA; 2) purificação do RNA total das amostras de rim; 3) sintetizar DNA complementar a partir de RNA total; e 4) reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) de miRNAs. Usando este método, detectamos com sucesso os níveis de expressão de vários miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p) nos rins de camundongos HIGA. Este novo método pode ser aplicado a outros estudos de perfil de miRNAs na nefropatia por IgA.

Nós investigamos os níveis de expressão de miRNAs nos rins de camundongos HIGA (n=10). Este resultado foi obtido completamente baseado no protocolo descrito. Os rins de camundongos Balb/c foram selecionados como controle (n=10). Em ambos os grupos, foram selecionadas idades de 25 semanas. Apenas camundongos fêmeas HIGA estavam disponíveis no fornecedor. Os níveis de expressão de três miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p e miR-21-5p; Gráfico 1) foram detectados, os quais foram previamente...

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Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

microRNAs estão envolvidos na patogênese da nefropatia por IgA. Desenvolvemos um método confiável para detectar os níveis de expressão de microRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). Este novo método facilitará a verificação do envolvimento de miRNAs na nefropatia por IgA.

Detecção da Expressão de MicroRNA nos Rins de Camundongos Nefropáticos com Imunoglobulina A

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

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