Name: detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice
Uploaded: 2020-07-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice at JoVE.com

Agradecemos a Sarah Williams, PhD, de Edanz Group (www.edanzediting.com) por editar un borrador de este manuscrito.

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Jichi y cumplen con las pautas de uso y cuidado de animales experimentales de la Guía para animales de laboratorio de la Universidad Médica de Jichi.
1. Obtención de muestras de riñón de ratones HIGA
NOTA: Los ratones HIGA muestran un fenotipo estable de nefropatía por IgA después de las 25 semanas de edad 8,9,10,11.<sup...

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	<li>Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgA+Nephropathy.">IgA Nephropathy.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).</li><li>Szeto, C. C., Li, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+IgA+nephropathy.">MicroRNAs in IgA nephropathy.</a> Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).</li><li>Wyatt, R. J., Julian, B. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+miR-148b+expression+promotes+aberrant+glycosylation+of+IgA1+in+IgA+nephropathy.">Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).</li><li>Serino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+a+retrospective+international+study,+circulating+miR-148b+and+let-7b+were+found+to+be+serum+markers+for+detecting+primary+IgA+nephropathy.">In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy.</a> Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).</li><li>Muso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+production+of+glomerular+extracellular+matrix+in+a+new+mouse+strain+of+high+serum+IgA+ddY+mice.">Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice.</a> Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).</li><li>Kurano, M., Yatomi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gas+chromatography+mass+spectrometry+to+elucidate+metabolites+predicting+the+phenotypes+of+IgA+nephropathy+in+hyper+IgA+mice.">Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice.</a> Plos One. 14 (7), 0219403 (2019).</li><li>Hyun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy.">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li><li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade.">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification.">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li><li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy.">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li><li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy.">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209 (2016).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), (2019).</li></ol>

Pudimos medir los niveles de expresión de miRNAs en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA) utilizando este nuevo método. La nefropatía por IgA es una enfermedad inexplicable que necesita más investigación para aclarar su etiología y dianas terapéuticas 1,3. Sin embargo, la obtención de muestras de riñón humano es altamente invasiva. Esta nueva técnica es ventajosa porque permite el estudio de la nefropatía por IgA utili...

La nefropatía por inmunoglobulina A (IgA) es un tipo de glomerulonefritis primaria caracterizada por el depósito anormal de IgA en la región mesangial glomerular renal 1,2. Es la más común de las glomerulonefritis primarias y conduce a la insuficiencia renal terminal en 20-40% de los pacientes2. La causa aún se desconoce, pero la infección persistente de la mucosa ha sido implicada 1,3. Los corticosteroides, inmunosupresores e inhibidores del sistema renina-angiotensina han sido propuestos como métodos terapéuticos1,3, pero no han sido completamente establecidos 3. Por lo tanto, se necesita investigación adicional para aclarar la etiología y los métodos terapéuticos para tratar la nefropatía por IgA.
Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que desempeñan un papel importante en la regulación de la expresión génica 4,5. Se informa que los miARN están involucrados en la patogénesis de diversas enfermedades, y algunos han sido identificados como biomarcadores de enfermedades y agentes terapéuticos 4,5. En los últimos años, también se ha descrito una asociación entre los miRNAs y la patogénesis de la nefropatía por IgA 2,6,7. Por ejemplo, se demostró que miR-148b estaba involucrado en anomalías estructurales de IgA en pacientes con nefropatía por IgA 2,6,7, mientras que miR-148b y let-7b se documentaron como nuevos biomarcadores para detectar la nefropatía por IgA7. Aunque comprender los efectos de los miARN sobre la nefropatía por IgA puede ayudar a dilucidar aún más la etiología y el tratamiento 2, aún no se han establecido métodos estándar para perfilar los miARN en la nefropatía por IgA utilizando modelos de animales pequeños2.
Aquí desarrollamos un método simple y confiable para medir los niveles de expresión de miARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía por IgA (ratones HIGA). El ratón HIGA es una cepa ddY característica que muestra un nivel particularmente alto de IgA sérica y el depósito anormal de IgA en los glomérulos renales 8,9,10,11. Por lo tanto, los ratones HIGA se pueden utilizar como un modelo de ratón de nefropatía por IgA 8,9,10,11. Nuestro método consta de cuatro pasos principales: primero, obtener quirúrgicamente muestras de riñón de ratones HIGA; segundo, homogeneizar muestras y purificar el ARN total utilizando una columna de espín basada en membrana de sílice; tercero, sintetizar ADN complementario (ADNc) a partir de ARN total mediante transcripción inversa; y cuarto, detectar los niveles de expresión de miRNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR). La justificación de este método y la fiabilidad de los resultados se basan en informes anteriores12,13. Demostramos que esta es una técnica útil para medir con precisión los niveles de expresión de miARN en un modelo de ratón con nefropatía por IgA, y que podría usarse para facilitar futuras investigaciones sobre miARN en la nefropatía por IgA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BALB/cCrSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>Mouse for control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIGA/NscSlc (25-week-old, female)</td>
			<td>Japan SLC, Inc.</td>
			<td>none</td>
			<td>IgA nephropathy mouse model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Experimental kit for synthesis of cDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Experimental kit fot extraction of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (RNU6-2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-155-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-146a-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001638</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript Primer Assay (miR-21-5p)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00009079</td>
			<td>miRNA-specific primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Experimental kit for real-time PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>biopolymer-shredding spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of microrna expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice

La nefropatía por inmunoglobulina A (IgA) es un tipo de glomerulonefritis primaria caracterizada por el depósito anormal de IgA, que conduce a la insuficiencia renal terminal. En los últimos años, se ha reportado la participación de microRNAs (miRNAs) en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Sin embargo, no existe un método establecido para perfilar miRNAs en la nefropatía por IgA utilizando modelos de animales pequeños. Por lo tanto, desarrollamos un método confiable para analizar miRNA en el riñón de un modelo de ratón IgA (ratón HIGA). El objetivo de este protocolo es detectar los niveles de expresión alterados de miRNAs en los riñones de ratones HIGA en comparación con los niveles en riñones de ratones control. En resumen, este método consta de cuatro pasos: 1) obtención de muestras de riñón de ratones HIGA; 2) purificar el ARN total de muestras de riñón; 3) sintetizar ADN complementario a partir de ARN total; y 4) reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) de miRNAs. Usando este método, detectamos con éxito los niveles de expresión de varios miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p) en los riñones de ratones HIGA. Este nuevo método se puede aplicar a otros estudios que perfilan miRNAs en nefropatía por IgA.

Investigamos los niveles de expresión de miRNAs en los riñones de ratones HIGA (n = 10). Este resultado se obtuvo completamente en base al protocolo descrito. Los riñones de ratones Balb/c fueron seleccionados como control (n=10). En ambos grupos, se seleccionaron las 25 semanas de edad. Solo los ratones HIGA hembra estaban disponibles en el proveedor. Los niveles de expresión de tres miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p y miR-21-5p; Figura 1) fueron detectados, que previamente fueron reporta...

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Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Los microARN están implicados en la patogénesis de la nefropatía por IgA. Hemos desarrollado un método fiable para detectar los niveles de expresión de microARN en los riñones de un modelo de ratón con nefropatía IgA (ratones HIGA). Este nuevo método facilitará la comprobación de la participación de los miRNAs en la nefropatía por IgA.

Detección de la expresión de microARN en los riñones de ratones nefropáticos de inmunoglobulina A

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

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