Name: measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2020-08-06T16:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

مايكن فيستي هو الشكر للمساعدة التقنية الممتازة. وقد تم تمويل هذا العمل جزئياً من منحة (MAVARECA II؛ 17-02-KU) من وزارة الخارجية في الدانمرك، ويديرها مركز زمالة دانيدا. ولم يكن للممول أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو قرار نشرها، أو إعدادها.

تم جمع عينات مصل الإنسان المستخدمة للنتائج المعروضة هنا في دراسة منفصلة19. وقد وافق على جمعها مجلس المراجعة المؤسسي لمعهد نوغوشي التذكاري للبحوث الطبية، جامعة غانا (دراسة 038/10-11)، ومن قبل اللجان الإقليمية لأخلاقيات البحوث، منطقة العاصمة الدانمركية (البروتوكول H-4-2013-083).
<p class="...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Report+-+2018.">World Malaria Report - 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li><li>Pierce, S. K., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Day+2009:+What+malaria+knows+about+the+immune+system+that+immunologists+still+do+not.">World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not.</a> Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).</li><li>Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancy-associated+malaria:+Parasite+binding,+natural+immunity+and+vaccine+development.">Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development.</a> International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+surface+antigen-specific+IgG+and+protection+against+clinical+consequences+of+pregnancy-associated+Plasmodium+falciparum+malaria.">Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria.</a> Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+variant+surface+antigens+of+plasmodium+falciparum+-Infected+erythrocytes+are+associated+with+protection+from+treatment+failure+and+the+development+of+anemia+in+pregnancy.">Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).</li><li>Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Antibodies+and+Protection+against+Blood-stage+Malaria.">Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria.</a> Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).</li><li>Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+effector+functions+in+malaria+and+other+parasitic+diseases:+a+few+needles+and+many+haystacks.">Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks.</a> Immunology &amp; Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonic+activity+of+human+immune+serum+on+in+vitro+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+infected+red+blood+cells+by+monocytes.">Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes.</a> Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-Parasitized+Erythrocytes+by+Human+Polymorphonuclear+Leukocytes.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes.</a> The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).</li><li>Jaworowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+human+immunodeficiency+virus+type+1+coinfection,+anemia,+and+levels+and+function+of+antibodies+to+variant+surface+antigens+in+pregnancy-associated+malaria.">Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).</li><li>Ata&#237;de, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+induce+phagocytosis+of+malaria+infected+erythrocytes:+Effect+of+HIV+infection+and+correlation+with+clinical+outcomes.">Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes.</a> PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunisation+with+recombinant+PfEMP1+domains+elicits+functional+rosette-inhibiting+and+phagocytosis-inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum.">Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum.</a> PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+strain-transcending+antibodies+against+Group+A+PfEMP1+surface+antigens+from+virulent+malaria+parasites.">Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets+of+antibodies+against+erythrocytes+in+malaria+immunity.">Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).</li><li>Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+upon+immunization+with+a+recombinant+PfEMP1+NTS+DBL1&#945;+domain.">Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1&#945; domain.</a> Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+point+in+protein+trafficking+by+Plasmodium+falciparum+determines+the+expression+of+major+antigens+on+the+surface+of+infected+erythrocytes+targeted+by+human+antibodies.">A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).</li><li>Quintana, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+in+children+with+malaria+to+PfEMP1,+RIFIN+and+SURFIN+expressed+at+the+Plasmodium+falciparum+parasitized+red+blood+cell+surface.">Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).</li><li>Hommel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+antibody+functional+activity+and+strain-specificity+of+vaccine+candidates+for+malaria+in+pregnancy+using+in+vitro+phagocytosis+assays.">Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).</li><li>Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+responses+to+pregnancy-restricted+and+-unrestricted+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+membrane+protein+1+antigens+in+Ghanaian+women+naturally+exposed+to+malaria+parasites.">B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).</li><li>Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+to+serum+for+cultivation+of+Plasmodium+falciparum+in+vitro.">An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pregnancy-associated+malaria-specific+B+cells+target+polymorphic,+conformational+epitopes+in+VAR2CSA.">Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA.</a> Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+Plasmodium+falciparum+3D7+for+expression+of+variant+surface+antigens+associated+with+severe+malaria+in+African+children.">In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children.</a> Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).</li><li>Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PfEMP1-VAR2CSA+translation+by+a+Plasmodium+translation-enhancing+factor.">Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor.</a> Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+immunity+to+Plasmodium+falciparum+malaria+by+IgM+masking+of+protective+IgG+epitopes+in+infected+erythrocyte+surface-exposed+PfEMP1.">Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).</li><li>Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2013).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+malaria+microscopy.+Part+I.+Learner's+Guide.">Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide.</a> World Health Organization. , (1991).</li><li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+monocyte-like+cell+line+THP-1+expresses+FcyRl+and+Fc'yRIl.">The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl.</a> Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).</li><li>Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+IgG+Fc+receptor+expression+induced+by+phorbol+12-myristate+13-acetate+treatment+of+THP-1+monocytic+leukemia+cells.">Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells.</a> Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+improved+phagocytosis+assay+to+evaluate+the+effect+of+HIV+on+specific+antibodies+to+pregnancy-associated+malaria.">Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria.</a> PloS One. 5 (5), 10807 (2010).</li></ol>

البروتوكول المقدم هنا قد سبق وصفه واستخدامه12،15،17،31 لقياس قدرة الأجسام المضادة التي تستهدف سطح P. falciparum IEs للحث على opsonization والبلعوم من قبل الخلايا THP - 1. وتركز النتائج المقدمة هنا على الأجسام المضادة التي تم الحصول ع...

الملاريا هي مرض ينتقل بالنواقل يسبب في البشر عند العدوى مع خمسة أنواع مختلفة من جنس بلازموديوم. الأنواع الأكثر انتشارا هي P. falciparum، والتي هي أيضا مسؤولة عن معظم المراضة والوفيات1. يختلف العرض السريري للملاريا من التهابات غير أعراضية أو حميدة إلى مرض معقد/شديد، ويحدث هذا الأخير في الغالب في الأطفال دون سن الخامسة. لا يؤدي التعرض لـ P. falciparum إلى مناعة معقمة ، ولكن الأفراد الذين يعيشون في المناطق المتوطنة يطورون ببطء مناعة ضد المرض السريري. الحماية هي العمر / التعرض التبعية ويتم اكتساب الحصانة عادة خلال أول 5-10 سنوات من الحياة2. تعتبر النساء البالغات استثناءً هاماً، حيث يمكن أن تحدث الملاريا الحادة أثناء الحمل في عرض سريري يعرف باسم الملاريا المشيمة (PM). PM هو سبب مهم للإجهاض، والإملاص، والولادة المبكرة، وانخفاض الوزن عند الولادة، ووفاة الجنين، وفقر الدم الأمومي. مقاومة PM يتطور على الحمل المتعاقب3. وترتبط الحماية من PM مع اكتساب الأجسام المضادة ضد VAR2CSA-نوع PfEMP14,5, مستضد سطح الدم الحمراء المصاب (IE) الذي يربط مع كبريتات شوندروتين A (CSA) تمكين عزل IE في المشيمة. الأجسام المضادة توسط حماية أداء مختلف الأنشطة الوظيفية (استعرض في6،7)بما في ذلك opsonization من الـ IEs للحث على phagocytosis. أظهرت الدراسات في المختبر في وقت مبكر أن الأجسام المضادة يمكن أن تحد من P. فالسيباروم النمو في وجود monocytes عبر البلعميات8,9. وقد أظهرت دراسات أكثر حداثة أن مستويات أعلى من الأجسام المضادة المحفزة للزناغة ترتبط مع أفضل نتائج الحمل (في سياق فيروس نقص المناعة البشرية المشترك العدوى)10,11, مما يدل على أهمية هذه الوظيفة المفعول في الاستجابة المناعية المكتسبة بشكل طبيعي.
هنا نقدم بروتوكول لقياس هذه الوظيفة من الأجسام المضادة الموجودة في البلازما البشرية / المصل، وذلك باستخدام في المختبر IEs مثقف التعبير عن VAR2CSA مع خط أحادية THP-1. وقد استخدمت سابقا في الفحص11,12,13,14,15,16,17,18 ويعتبر نهجا محسنا وأسهل مقارنة مع البروتوكولات المجهرية في وقت سابق8, لأنه يسمح باختبار عدد أكبر من عينات الأجسام المضادة في تشغيل واحد باستخدام كميات أصغر من الأجسام المضادة وتجنب العد المجهري الممل والمتحيز. على الرغم من أن الفحص قد استخدم من قبل مختبرات متعددة وتنفيذه بسيط بما فيه الكفاية ، فإنه يتطلب تخطيطًا وإعدادًا دقيقين ، لذلك ، فإن بروتوكولًا مفصلًا سيسمح بتطبيقه من قبل المختبرات والباحثين الذين يفتقرون إلى الخبرة السابقة. نحن نستخدم، كمثال، في مرحلة متأخرة من مرحلة المتزامنة IEs التعبير عن VAR2CSA opsonized مع الأجسام المضادة الموجودة في المصل التي تم جمعها من النساء مع مناعة PM المكتسبة بشكل طبيعي محددة. ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول بسهولة إلى فحص وظيفة الأجسام المضادة إلى أي مستضد طفيلي موجود على سطح IE، سواء كان ذلك بسبب التعرض الطبيعي أو التطعيم.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well cell culture plates, round bottom with lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11021-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II (5%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Blood Cells antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34858</td>
			<td>Prepare 2&#65533;&#65533;l aliquots and freeze a -20&#176;C. Use one aliquot per experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC500 flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Heat inactivate before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555406 or 556618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD64</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowLogic software</td>
			<td>Inivai technologies</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS CS-column and accesories</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parasite culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50&#181;g/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vario MACS magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay

يصف البروتوكول كيفية إعداد وتشغيل مقايسة البلعة المستندة إلى الخلايا المتدفقة من plasmodium falciparum-eded inedethrotes (IEs) التي تم التقاطها من قبل الأجسام المضادة IgG المكتسبة بشكل طبيعي محددة لـ VAR2CSA. VAR2CSA هو مستضد الطفيليات التي تتوسط في عزل انتقائي لل IEs في المشيمة التي يمكن أن تسبب شكلًا حادًا من الملاريا لدى النساء الحوامل ، وتسمى الملاريا المشيمة (PM). يتم توسط الحماية من PM بواسطة الأجسام المضادة VAR2CSA الخاصة التي يعتقد أنها تعمل عن طريق تثبيط عزل المشيمة و / أو عن طريق opsonizing IEs للبالعميات. يستخدم الفحص IEs في مرحلة متأخرة من متزامنة التي تم اختيارها في المختبر للتعبير عن VAR2CSA ، والهيئات المضادة للبيات البلازما / المصل من النساء ذوات مناعة PM محددة بشكل طبيعي ، وخط الخلايا الفاتجية THP-1. ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول بسهولة إلى فحص وظيفة الأجسام المضادة إلى أي مستضد طفيلي موجود على سطح IE، سواء كان ذلك بسبب التعرض الطبيعي أو التطعيم. تقدم هذه المقايسة تقييم بسيط وعالي الإنتاجية، مع قابلية جيدة للتكرار، لجانب وظيفي مهم من مناعة الأجسام المضادة بوساطة في الملاريا. ولذلك، فإنه مفيد عند تقييم المناعة السريرية ضد الملاريا P. فالسيباروم، وهي سبب رئيسي للاعتلال والوفيات في المناطق المدارية، وخاصة في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى.

هنا نقدم بالتفصيل بروتوكول سبق أن وصفت31 واستخدمت11،12،13،14،15،16،17،18 لقياس قدرة الأجسام المضادة التي تستهدف سطح P. falciparum IEs للح?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير تعليمات حول كيفية قياس قدرة الأجسام المضادة الموجودة في سيرا أو البلازما للأفراد ، المعرضين بشكل طبيعي لعدوى بالسيباروم البلازمودي ، لopsonize والحث على البلعميات الحمراء المصابة بالطفيليات (IEs).

قياس المكتسبة بشكل طبيعي Phagocytosis-تحريض الأجسام المضادة لبلاموديوم فالسيباروم الطفيليات من قبل تدفق Cytometry القائم على المقايسة

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

يسمح هذا البروتوكول بقياس قدرة الأجسام المضادة على الإرضاء والحث على بعتم البلازمات الفلاسية البلازميومية المصابة بالخيثارية. يمكن اختبار الأجسام المضادة الموجودة في مصل الأفراد المعرضين بشكل طبيعي لعدوى الطفيليات ، وكذلك تلك التي يتم تحريضها عن طريق التحصين بمستضدات الطفيليات. إثبات الإجراء معي سيكون مايكين فيستي، وهو فني من مختبري.لإعداد ثقافة خلية THP-1 لمقايسة البلعوم، في اليوم السابق للتجربة بذور الخلايا في قارورة ثقافة مربعة 25 سنتيمترا وتركيز 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر في THP خلية واحدة ثقافة المتوسطة. في يوم التجربة ، على الأقل ساعة واحدة قبل كتلة التجربة إلى 96-96- ألواح 96-جيدا الجولة مع microliters من العقيمة 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني في البئر. لحصاد وتنقية الخلايا الحمراء المصابة في منتصف إلى وقت متأخر من منتصف إلى مرحلة متأخرة ، قم بإعداد حوالي 1.2 ملليلتر من ثقافة طفيلي P الفاسيباروم المعبأة في 10 ملليلترات من متوسطة ثقافة الطفيليات ، مع ما لا يقل عن 5٪ من الطفيليات وإضافة إلى عمود مغناطيسي.غسل العمود مع 50 ملليلتر من ثقافة الطفيلي المتوسطة. لerute المصابة الكريات الحمراء، وإزالة العمود من المغناطيس وتدفق عليه مع 50 ملليلتر من المتوسطة ثقافة الطفيليات. ثم، وجمع الكريات الحمراء المصابة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من الطفيليات الطازجة ثقافة المتوسطة للعد.ضبط تعليق كريات الدم الحمراء المصابة منقّحتها بمقدار 3.3 مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر في وسط ثقافة الطفيليات التي تحتوي على بروميد الإثيديوم، إلى تركيز نهائي قدره 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. بعد ذلك، قم بإزالة حل الحجب من لوحة 96-well واحدة عن طريق تمرير اللوحة إلى حاوية نفايات. ثم إزالة أي فائض على منشفة ورقية وإضافة 30 ميكرولترات من تسمية بروميد الإتيهيديوم المصابة تعليق كريات اللكرة الأحمر للجميع ولكن واحد جيدا في النصف العلوي من لوحة.إضافة 30 ميكرولترات من ثقافة الطفيليات المتوسطة إلى البئر الفارغة، واحتضان لوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، إضافة 170 ميكرولترات من ثقافة الطفيليات المتوسطة لكل بئر والرواسب الكريات الحمراء المصابة في الجزء السفلي من لوحة عن طريق الطرد المركزي. إزالة supernatant عن طريق نفض الغبار لوحة في وعاء النفايات، وغسل الكريات الحمراء المسماة بروميد الإيثييوم المسمى المصابة مرتين أكثر، مع 200 ميكرولترات من ثقافة الطفيلي المتوسطة في جيدا، كما أظهرت للتو.بعد الغسيل الثاني، استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة الحجم الكامل من المابس من كل بئر بعناية، دون إزعاج الكريات. وإعادة تعليق كريات الدم الحمراء المسماة ببروميد الإيثيديوم في 30 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة، بما في ذلك الضوابط المناسبة وعينات الاختبار التي تم إعدادها سابقًا في وسط ثقافة الطفيليات. ثم ضع اللوحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، ومحمية من الضوء.في حين يتم opsonized الخلايا الحمراء المصابة ، وجمع الخلايا THP - 1 عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة بيليه في 12 ملليلتر من الطازجة ، قبل الدافئة THP - 1 خلية المتوسطة. بعد الطرد المركزي الثاني، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من THP-1 خلية ثقافة المتوسطة للعد، وضبط تركيز الخلية إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر في خلية THP-1 المتوسطة. إزالة الحل حظر من لوحة 96-جيدا الثانية وإضافة 100 ميكرولترات من الخلايا THP-1 إلى كل بئر.ثم، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية. في نهاية الحضانة opsonization، إضافة 170 ميكرولترات من ثقافة الطفيليات المتوسطة إلى كل بئر من لوحة opsonization، ورواسب الكريات الحمراء المصابة إلى الجزء السفلي من لوحة عن طريق الطرد المركزي. غسل الكريات الحمراء المصابة opsonized مرتين مع 200 ميكرولترات من ثقافة الطفيلي المتوسطة في البئر ، وذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات لإزالة بعناية supernatant بعد الغسيل الثاني.Resuspend الخلايا الكريات الحمراء المصابة opsonized في 100 microliters من قبل الدافئ THP-1 خلية ثقافة المتوسطة في البئر ، ونقل 50 ميكرولترات من كل تعليق الكريات الحمراء المصابة opsonized إلى بئر المقابلة في لوحة البلعمية. عندما يتم إضافة جميع الخلايا، ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة لا تزيد عن 40 دقيقة، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، أوقف البلعوم عن طريق الطرد المركزي عند أربع درجات مئوية.إزالة supernatant وإعادة تعليق الكريات مع 150 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة الأمونيوم كلوريد محلول في بئر. بعد ثلاث دقائق بالضبط ، إضافة 100 ميكرولترات من الجليد البارد في 2 ٪ FBS في برنامج تلفزيوني لوقف التحلل ، ورواسب الخلايا السليمة عن طريق الطرد المركزي. المقبل، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من الجليد الطازج الباردة 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني في بئر، في غسل.بعد الغسيل النهائي، resuspend بيليه الخلية في 200 ميكرولترات من الجليد الطازج الباردة 2٪ FBS في برنامج تلفزيوني في البئر. للحصول على تحليل وتحليل قياس الخلايا التدفقي، قم على الفور بتحميل الخلايا على مقياس تدفق الخلايا واستخدم مؤامرة التشتت الجانبي الخطي مقابل الخطية للآبار بدون كريات الدم الحمراء المصابة إلى بوابة خلايا THP-1. الحصول على 10،000 الأحداث في هذه البوابة، واستخدام الخلايا THP-1 مع الكريات الحمراء المصابة opsontes مع سيطرة إيجابية لإعداد مؤامرة الرسم البياني لقياس كثافة الفلورية بروميد الإيثيديوم.للتحليل، افتح مؤامرة التشتت الجانبي الخطي مقابل الخطية للآبار بدون كريات الدم الحمراء المصابة، وابابة خلايا THP-1. ثم قم بإعداد بوابة إيجابية في رسم بياني من نوع FL-3 ونسخ هذه البوابات على جميع آبار العينة الأخرى لتحديد النسبة المئوية للخلايا THP-1 الإيجابية لبروميديوم. لكل عينة تم اختبارها ، يمكن الإبلاغ عن البلعمية على أنها القيمة المطلقة أو باعتبارها البلعمة النسبية المحسوبة كنسبة مئوية باستخدام التحكم الإيجابي كحد أقصى.يجب فحص خلايا THP-1 بشكل دوري للتعبير السطحي لمستقبلات FC غاما عن طريق عملية استئصال الخلايا المتدفقة. يجب أن تكون الخلايا سالبة لـ CD16، وإيجابية لـ CD32 و CD64. في تجربة opsonization هذه، تم بوابات الخلايا THP-1 أولاً وفقاً لمحاتها الأمامية والجانبية مبعثر، للسماح quantization النسبة المئوية للخلايا المسماة بروميد الإتيهيديوم، مؤشراً للخلايا التي بعتها الأجسام المضادة واحد على الأقل opsonized الكريات الحمراء المصابة.وينبغي أن تولد عينات التحكم السلبية جميعها ذروة سلبية واحدة في قناة FL3، مع وجود عدد قليل من الأحداث التي لوحظت في علامة بروميد الإتيهيدوم. وبناء على ذلك، ينبغي أن تكون قيم البلعيات المتوسطة، سواء كخلايا THP-1 الإيجابية المطلقة من بروميد الإتربي أو كنسب مئوية نسبية للداءات البلعمية، منخفضة جداً. وعلى النقيض من ذلك، ينبغي أن تولد الرقابة الإيجابية آثاراً ذات ذرتين، وذرية سالبة، وذرية موجبة ومفصلة بشكل جيد تقع ضمن علامة بروميد الإثيديوم.وعادة ما تكون قيم البلعوم المتوسط هي الأعلى بالنسبة للسيطرة الإيجابية، تليها مجموعة الإناث المعرضة للملاريا وضوابط المرأة الوحيدة المعرضة للملاريا. وعلى الرغم من أن هذه المنهجية تولد نتائج متسقة، فقد لوحظت انحرافات في معامل الميل للخطوط المعدلة. لذلك، يوصى باستخدام القيم النسبية، خاصةً إذا لم يكن من الممكن تشغيل كافة العينات في تجربة واحدة.تأكد من التخطيط بعناية للتجربة مسبقًا ، وإعداد كل من خلايا THP-1 والطفيليات وفقًا لذلك ، باستخدام ال trophocytes فقط مع نقاء أكبر من 80٪ بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من تضمين دائمًا الضوابط المناسبة ، للسماح بتقييم جودة التجربة وتسهيل تحليل البيانات.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

و<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك عدوى نموذج لدراسة<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

بروتوكول بسيط لتجمع الصفائح الدموية بوساطة<em&gt; المتصورة المنجلية</emتبدي الكريات الحمر&gt; بالفيروس في أجواء فقيرة الموارد

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

فصل<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; في وقت متأخر مرحلة المصابين تبدي الكريات الحمر بوسائل المغناطيسي

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

في تقييم فيفو من القوارض المتصورة الطفيل وأقسومة الغزو من قبل التدفق الخلوي

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

طرق بالتحقيق في الدور التنظيمي للالرنا الصغيرة وخاص بالريبوسوم إشغال<em&gt; المتصورة المنجلية</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

الفحص التدفق الخلوي استنادا لمراقبة وظائف الخلايا القاتلة الطبيعية

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...