Name: measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2020-08-06T16:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Maiken Visti est remercié pour son excellente assistance technique. Ces travaux ont été financés en partie par une subvention (MAVARECA II; 17-02-KU) du Ministère des affaires étrangères du Danemark et administrée par le Danida Fellowship Centre. Le bailleur de fonds n’a joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Les échantillons de sérum humain utilisés pour les résultats présentés ici ont été prélevés dans une étude distincte19. La collecte a été approuvée par le Comité d’examen institutionnel du Noguchi Memorial Institute for Medical Research de l’Université du Ghana (étude 038/10-11) et par les Comités régionaux d’éthique de la recherche de la région de la capitale du Danemark (protocole H-4-2013-083).
1. Culture parasite
...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Report+-+2018.">World Malaria Report - 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li><li>Pierce, S. K., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Day+2009:+What+malaria+knows+about+the+immune+system+that+immunologists+still+do+not.">World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not.</a> Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).</li><li>Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+point+in+protein+trafficking+by+Plasmodium+falciparum+determines+the+expression+of+major+antigens+on+the+surface+of+infected+erythrocytes+targeted+by+human+antibodies.">A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).</li><li>Quintana, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+in+children+with+malaria+to+PfEMP1,+RIFIN+and+SURFIN+expressed+at+the+Plasmodium+falciparum+parasitized+red+blood+cell+surface.">Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).</li><li>Hommel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+antibody+functional+activity+and+strain-specificity+of+vaccine+candidates+for+malaria+in+pregnancy+using+in+vitro+phagocytosis+assays.">Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).</li><li>Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+responses+to+pregnancy-restricted+and+-unrestricted+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+membrane+protein+1+antigens+in+Ghanaian+women+naturally+exposed+to+malaria+parasites.">B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).</li><li>Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pregnancy-associated+malaria-specific+B+cells+target+polymorphic,+conformational+epitopes+in+VAR2CSA.">Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA.</a> Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+Plasmodium+falciparum+3D7+for+expression+of+variant+surface+antigens+associated+with+severe+malaria+in+African+children.">In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children.</a> Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).</li><li>Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PfEMP1-VAR2CSA+translation+by+a+Plasmodium+translation-enhancing+factor.">Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor.</a> Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+immunity+to+Plasmodium+falciparum+malaria+by+IgM+masking+of+protective+IgG+epitopes+in+infected+erythrocyte+surface-exposed+PfEMP1.">Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).</li><li>Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2013).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+malaria+microscopy.+Part+I.+Learner's+Guide.">Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide.</a> World Health Organization. , (1991).</li><li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+monocyte-like+cell+line+THP-1+expresses+FcyRl+and+Fc'yRIl.">The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl.</a> Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).</li><li>Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+IgG+Fc+receptor+expression+induced+by+phorbol+12-myristate+13-acetate+treatment+of+THP-1+monocytic+leukemia+cells.">Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells.</a> Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+improved+phagocytosis+assay+to+evaluate+the+effect+of+HIV+on+specific+antibodies+to+pregnancy-associated+malaria.">Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria.</a> PloS One. 5 (5), 10807 (2010).</li></ol>

Le protocole présenté ici a été précédemment décrit et utilisé12,15,17,31 pour mesurer la capacité des anticorps ciblant la surface des IEs de P. falciparum pour induire l’opsonisation et la phagocytose par les cellules de THP-1. Les résultats présentés ici se concentrent sur les anticorps naturellement acquis var2CSA-spécifiques dans le plasma / sérum des femmes vivant...

Le paludisme est une maladie à transmission vectorielle causée chez l’homme lors de l’infection par cinq espèces différentes du genre Plasmodium. L’espèce la plus répandue est P. falciparum, qui est également responsable de la plus grande morbidité et mortalité1. La présentation clinique du paludisme varie des infections asymptomatiques ou bénignes aux maladies compliquées/graves, ces dernières se produisant principalement chez les enfants de moins de cinq ans. L’exposition à P. falciparum n’induit pas l’immunité stérile, mais les individus vivant dans les zones endémiques développent lentement l’immunité contre la maladie clinique. La protection dépend de l’âge et de l’exposition et l’immunité est normalement acquise au cours des 5 à 10 premières années de vie2. Les femmes adultes sont une exception importante, car le paludisme sévère peut se produire pendant la grossesse dans une présentation clinique connue sous le nom de paludisme placentaire (PM). Le PM est une cause importante d’avortement, de mortinaissance, d’accouchement prématuré, de faible poids à la naissance, de mort fœtale et d’anémie maternelle. La résistance au PM se développe au cours des grossesses successives3. La protection contre les PARTICULES est associée à l’acquisition d’anticorps contre le type VAR2CSA PfEMP14,5, un antigène de surface infecté par l’érythrocyte (EI) qui se lie au sulfate de chondroïne A (ASC) permettant la séquestration de l’IE dans le placenta. Anticorps mediatise protection effectuant diverses activités fonctionnelles (examinés dans6,7) y compris l’opsonisation des IE pour induire la phagocytose. Des études in vitro précoces ont montré que les anticorps peuvent limiter la croissance de P. falciparum en présence de monocytes par phagocytose8,9. Des études plus récentes ont montré que des niveaux plus élevés d’anticorps induisant la phagocytose sont associés à de meilleurs résultats de la grossesse (dans le contexte de la co-infection par le VIH)10,11, indiquant la pertinence de cette fonction effecteur dans la réponse immunitaire acquise naturellement.
Ici, nous présentons un protocole pour mesurer cette fonction des anticorps présents dans le plasma humain / sérum, en utilisant in vitro cultivés IEs exprimant VAR2CSA avec la ligne de monocytes THP-1. L’essai a été précédemment utilisé11,12,13,14 ,15,16,17,,18 et est considéré comme une approche améliorée et plus facile par rapport aux protocoles antérieurs à base de microscope8, car il permet l’essai d’un plus grand nombre d’échantillons d’anticorps en une seule course en utilisant de plus petits volumes d’anticorps et en évitant le comptage fastidieux et biaisé de la microscopie.17 Même si l’essai a été utilisé par plusieurs laboratoires et que son exécution est assez simple, il nécessite une planification et une préparation minutieuses, par conséquent, un protocole détaillé permettrait son application par des laboratoires et des chercheurs dépourvus d’expérience antérieure. Nous utilisons, à titre d’exemple, des IE synchronisés à un stade avancé exprimant l’opsonized VAR2CSA avec des anticorps présents dans le sérum recueilli auprès des femmes atteintes d’une immunité spécifique aux PARTICULES naturellement acquise. Cependant, le protocole peut facilement être modifié pour évaluer la fonctionnalité des anticorps à tout antigène parasite présent sur la surface de l’IE, qu’il soit induit par une exposition naturelle ou par la vaccination.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well cell culture plates, round bottom with lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11021-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II (5%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Blood Cells antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34858</td>
			<td>Prepare 2&#65533;&#65533;l aliquots and freeze a -20&#176;C. Use one aliquot per experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC500 flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Heat inactivate before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555406 or 556618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD64</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowLogic software</td>
			<td>Inivai technologies</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS CS-column and accesories</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parasite culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50&#181;g/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vario MACS magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay

Le protocole décrit comment mettre en place et exécuter un test de phagocytose à base de cytométrie de flux de Plasmodium falciparum-infectés érythrocytes (IE) opsonized par des anticorps IgG naturellement acquis spécifiques pour VAR2CSA. VAR2CSA est l’antigène parasite qui joue un médiateur dans la séquestration sélective des EI dans le placenta qui peut causer une forme grave de paludisme chez les femmes enceintes, appelée paludisme placentaire (PM). La protection contre les PARTICULES est médiée par des anticorps spécifiques à VAR2CSA qui sont censés fonctionner en inhibant la séquestration placentaire et/ou en opsonisant les EI pour la phagocytose. L’essai emploie des IE synchronisés à un stade avancé qui ont été sélectionnés in vitro pour exprimer VAR2CSA, plasma/sérique-anticorps de femmes avec l’immunité naturellement acquise pm-spécifique, et la ligne de cellules phagocytiques THP-1. Cependant, le protocole peut facilement être modifié pour évaluer la fonctionnalité des anticorps à tout antigène parasite présent sur la surface de l’IE, qu’il soit induit par une exposition naturelle ou par la vaccination. L’essai offre une évaluation simple et à haut débit, avec une bonne reproductibilité, d’un aspect fonctionnel important de l’immunité sous médiation des anticorps dans le paludisme. Il est donc utile lors de l’évaluation de l’immunité clinique contre le paludisme à P. falciparum, une cause majeure de morbidité et de mortalité sous les tropiques, en particulier en Afrique subsaharienne.

Ici, nous présentons en détail un protocole qui a déjà été décrit31 et utilisé11,12,13,14,15,16,17,18 pour mesurer la capacité des anticorps ciblant la surface de P. falciparum IEs pour induire l’opsonisation et l...

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Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

L’objectif global de ce protocole est de fournir des instructions sur la façon de mesurer la capacité des anticorps présents dans les sérums ou le plasma des individus, naturellement exposés à l’infection de Plasmodium falciparum, d’opsoniser et d’induire la phagocytose des érythrocytes infectés par le parasite (EI).

Mesure des anticorps naturels acquis de phagocytose induisant des parasites de plasmodium falciparum par un essai basé sur la cytométrie de flux

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Ce protocole permet de mesurer la capacité des anticorps à opsoniser et induire la phagocytose des érythrocytes infectés par le plasmodium falciparum. Les anticorps présents dans le sérum des individus naturellement exposés à l’infection parasitaire, ainsi que ceux induits par la vaccination par des antigènes parasites, peuvent être testés. Maiken Visti, technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec moi.Pour mettre en place une culture cellulaire THP-1 pour un essai de phagocytose, la veille de l’expérience semer les cellules dans un flacon de culture carré de 25 centimètres et une concentration de 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans THP un milieu de culture cellulaire. Le jour de l’expérience, au moins une heure avant le bloc d’expérience à fond rond 96-puits plaques avec 150 microlitres de stérile 2%FBS dans PBS par puits. Pour la récolte et la purification des érythrocytes infectés par les trophozoites à un stade intermédiaire ou avancé, préparez environ 1,2 millilitres de culture de parasites P falciparum emballés dans 10 millilitres de milieu de culture parasitaire, avec au moins 5 % de parasitemie et ajoutez à une colonne magnétique.Lavez la colonne avec 50 millilitres de milieu de culture parasitaire. Pour éliminer les érythrocytes infectés, retirez la colonne de l’aimant et rincez-la avec 50 millilitres de milieu de culture parasitaire. Ensuite, recueillir les érythrocytes infectés par centrifugation et resuspendre la pastille dans un millilitre de milieu de culture parasite frais pour le comptage.Ajuster la suspension purifiée des érythrocytes infectés de 3,3 fois 10 à la septième cellule par millilitre dans le milieu de culture des parasites contenant du bromure d’éthidium, à une concentration finale de 2,5 microgrammes par millilitre. Ensuite, retirez la solution de blocage d’une plaque de 96 puits en faisant glisser la plaque dans un conteneur à déchets. Retirez ensuite tout excès sur une serviette en papier et ajoutez 30 microlitres de la suspension érythrocyte infectée par l’étiquette de bromure d’érythrocyte à tous sauf un puits dans la moitié supérieure de la plaque.Ajouter 30 microlitres de culture parasitaire moyenne au puits vide, et incuber la plaque pendant 10 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, ajouter 170 microlitres de milieu de culture parasitaire à chaque puits et sédimenter les érythrocytes infectés au fond de la plaque par centrifugation. Enlevez le supernatant en faisant glisser la plaque dans un récipient à déchets, et lavez les érythrocytes infectés étiquetés au bromure d’éthidium deux fois de plus, avec 200 microlitres de milieu de culture parasitaire par puits, comme nous venons de le démontrer.Après le deuxième lavage, utiliser une pipette multicanal pour enlever soigneusement tout le volume de supernatant de chaque puits, sans déranger les granulés. Et résuspendez les érythrocytes infectés étiquetés au bromure d’éthidium dans 30 microlitres de solution d’anticorps, y compris les contrôles appropriés et les échantillons d’essai précédemment préparés dans le milieu de culture de parasite. Ensuite, placez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes, à l’abri de la lumière.Pendant que les érythrocytes infectés sont opsonisés, recueillez les cellules THP-1 par centrifugation, et réutilisez la pastille en 12 millilitres de milieu de culture cellulaire THP-1 frais préchauffé. Après une deuxième centrifugation, resuspendez la pastille dans un millilitre de milieu de culture cellulaire THP-1 pour le comptage, et ajustez la concentration cellulaire à cinq fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans le milieu de culture cellulaire THP-1. Retirez la solution de blocage de la deuxième plaque de 96 puits et ajoutez 100 microlitres de cellules THP-1 à chaque puits.Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation de l’opsonisation, ajouter 170 microlitres de milieu de culture parasitaire à chaque puits de la plaque d’opsonisation, et sédimenter les érythrocytes infectés au fond de la plaque par centrifugation. Lavez les érythrocytes infectés opsonisés deux fois avec 200 microlitres de milieu de culture parasitaire par puits, à l’aide d’une pipette multicanal pour enlever soigneusement le supernatant après le deuxième lavage.Resuspendez les érythrocytes infectés opsonisés dans 100 microlitres du milieu préchauffé de culture cellulaire de THP-1 par puits, et transférez 50 microlitres de chaque suspension infectée opsonisée d’érythrocyte à un puits correspondant dans la plaque de phagocytose. Lorsque toutes les cellules ont été ajoutées, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant au plus 40 minutes, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, arrêter la phagocytose par centrifugation à quatre degrés Celsius.Retirer le supernatant et réutiliser les granulés avec 150 microlitres de solution de lysage au chlorure d’ammonium à température ambiante par puits. Après exactement trois minutes, ajouter 100 microlitres de froid glacial à 2%FBS dans PBS pour arrêter la lyse, et sédimenter les cellules intactes par centrifugation. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de glace fraîche froide 2%FBS en PBS par puits, par lavage.Après le lavage final, resuspendez la pastille cellulaire dans 200 microlitres de glace fraîche froide 2%FBS en PBS par puits. Pour l’acquisition et l’analyse de cytométrie d’écoulement, chargez immédiatement les cellules sur un cytomètre d’écoulement et utilisez la parcelle linéaire de dispersion latérale avant contre linéaire pour les puits sans érythrocytes infectés pour portailr les cellules THP-1. Acquérir 10 000 événements dans cette porte, et utiliser les cellules THP-1 avec les érythrocytes infectés opsonisés avec un contrôle positif pour mettre en place une parcelle d’histogramme pour mesurer l’intensité de fluorescence de bromure d’éthidium.Pour analyse, ouvrez la parcelle linéaire de dispersion latérale vers l’avant par rapport à la parcelle linéaire de dispersion pour les puits sans érythrocytes infectés, et portez les cellules THP-1. Ensuite, installez une porte positive dans un histogramme FL-3 et copiez ces portes sur tous les autres puits d’échantillon pour déterminer le pourcentage de cellules THP-1 positives au bromure d’éthidium. Pour chaque échantillon testé, la phagocytose peut être déclarée comme valeur absolue ou comme phagocytose relative calculée en pourcentage en utilisant le contrôle positif comme maximum.Les cellules THP-1 doivent être vérifiées périodiquement pour l’expression de surface des récepteurs gamma FC par cytométrie d’écoulement. Les cellules doivent être négatives pour le CD16, et positives pour le CD32 et le CD64. Dans cette expérience d’opsonisation, les cellules THP-1 ont été gated d’abord selon leurs profils avant et latéraux de dispersion, pour permettre la quantification du pourcentage de cellules ethidium bromure-étiquetées, indicatif des cellules qui ont phagocytized au moins un érythrocyte infecté opsonized d’anticorps.Les échantillons témoins négatifs devraient tous générer un pic négatif unique dans le canal FL3, avec peu d’événements observés dans le marqueur de bromure d’éthidium. Par conséquent, les valeurs moyennes de phagocytose, à la fois en tant que cellules THP-1 absolues de bromure bromure-positive et en tant que pourcentages relatifs de phagocytose, devraient être très basses. En revanche, le contrôle positif devrait générer des traces avec deux pics, un pic négatif et un pic clairement positif et bien séparé situé dans le marqueur de bromure d’éthidium.Les valeurs moyennes de phagocytose sont normalement les plus élevées pour la lutte positive, suivies par le bassin féminin exposé au paludisme et les témoins féminins exposés au paludisme. Bien que cette méthodologie génère des résultats cohérents, des écarts dans le coefficient de pente des lignes ajustées ont été observés. Par conséquent, l’utilisation de valeurs relatives est recommandée, surtout s’il n’est pas possible d’exécuter tous les échantillons en une seule expérience.Assurez-vous de planifier soigneusement l’expérience à l’avance, en préparant à la fois les cellules THP-1 et les parasites en conséquence, en utilisant uniquement des trophocytes d’une pureté supérieure à 80%En outre, assurez-vous d’inclure toujours les contrôles appropriés, pour permettre à la qualité de l’expérience d’être évaluée et faciliter l’analyse des données.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

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