Name: measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2020-08-06T16:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Maiken Visti הוא הודה על סיוע טכני מעולה. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק (MAVARECA II; 17-02-KU) ממשרד החוץ של דנמרק ומנוהלת על ידי מרכז המעבדות דנידה. ל-funder לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

דגימות הנסיוב האנושי המשמשות לתוצאות המוצגות כאן נאספו במחקר נפרד19. האוסף אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של מכון נוגוצ'י למחקר רפואי, אוניברסיטת גאנה (מחקר 038/10-11), ועל ידי ועדות האתיקה של המחקר האזורי, אזור הבירה של דנמרק (פרוטוקול H-4-2013-083).
1. תרבות טפילים
<p class=...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Report+-+2018.">World Malaria Report - 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li><li>Pierce, S. K., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Day+2009:+What+malaria+knows+about+the+immune+system+that+immunologists+still+do+not.">World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not.</a> Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).</li><li>Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancy-associated+malaria:+Parasite+binding,+natural+immunity+and+vaccine+development.">Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development.</a> International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+surface+antigen-specific+IgG+and+protection+against+clinical+consequences+of+pregnancy-associated+Plasmodium+falciparum+malaria.">Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria.</a> Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+variant+surface+antigens+of+plasmodium+falciparum+-Infected+erythrocytes+are+associated+with+protection+from+treatment+failure+and+the+development+of+anemia+in+pregnancy.">Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).</li><li>Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Antibodies+and+Protection+against+Blood-stage+Malaria.">Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria.</a> Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).</li><li>Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+effector+functions+in+malaria+and+other+parasitic+diseases:+a+few+needles+and+many+haystacks.">Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks.</a> Immunology &amp; Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonic+activity+of+human+immune+serum+on+in+vitro+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+infected+red+blood+cells+by+monocytes.">Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes.</a> Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-Parasitized+Erythrocytes+by+Human+Polymorphonuclear+Leukocytes.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes.</a> The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).</li><li>Jaworowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+human+immunodeficiency+virus+type+1+coinfection,+anemia,+and+levels+and+function+of+antibodies+to+variant+surface+antigens+in+pregnancy-associated+malaria.">Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).</li><li>Ata&#237;de, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+induce+phagocytosis+of+malaria+infected+erythrocytes:+Effect+of+HIV+infection+and+correlation+with+clinical+outcomes.">Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes.</a> PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunisation+with+recombinant+PfEMP1+domains+elicits+functional+rosette-inhibiting+and+phagocytosis-inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum.">Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum.</a> PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+strain-transcending+antibodies+against+Group+A+PfEMP1+surface+antigens+from+virulent+malaria+parasites.">Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets+of+antibodies+against+erythrocytes+in+malaria+immunity.">Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).</li><li>Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+upon+immunization+with+a+recombinant+PfEMP1+NTS+DBL1&#945;+domain.">Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1&#945; domain.</a> Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+point+in+protein+trafficking+by+Plasmodium+falciparum+determines+the+expression+of+major+antigens+on+the+surface+of+infected+erythrocytes+targeted+by+human+antibodies.">A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).</li><li>Quintana, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+in+children+with+malaria+to+PfEMP1,+RIFIN+and+SURFIN+expressed+at+the+Plasmodium+falciparum+parasitized+red+blood+cell+surface.">Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).</li><li>Hommel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+antibody+functional+activity+and+strain-specificity+of+vaccine+candidates+for+malaria+in+pregnancy+using+in+vitro+phagocytosis+assays.">Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).</li><li>Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+responses+to+pregnancy-restricted+and+-unrestricted+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+membrane+protein+1+antigens+in+Ghanaian+women+naturally+exposed+to+malaria+parasites.">B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).</li><li>Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+to+serum+for+cultivation+of+Plasmodium+falciparum+in+vitro.">An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pregnancy-associated+malaria-specific+B+cells+target+polymorphic,+conformational+epitopes+in+VAR2CSA.">Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA.</a> Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+Plasmodium+falciparum+3D7+for+expression+of+variant+surface+antigens+associated+with+severe+malaria+in+African+children.">In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children.</a> Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).</li><li>Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PfEMP1-VAR2CSA+translation+by+a+Plasmodium+translation-enhancing+factor.">Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor.</a> Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+immunity+to+Plasmodium+falciparum+malaria+by+IgM+masking+of+protective+IgG+epitopes+in+infected+erythrocyte+surface-exposed+PfEMP1.">Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).</li><li>Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2013).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+malaria+microscopy.+Part+I.+Learner's+Guide.">Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide.</a> World Health Organization. , (1991).</li><li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+monocyte-like+cell+line+THP-1+expresses+FcyRl+and+Fc'yRIl.">The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl.</a> Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).</li><li>Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+IgG+Fc+receptor+expression+induced+by+phorbol+12-myristate+13-acetate+treatment+of+THP-1+monocytic+leukemia+cells.">Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells.</a> Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+improved+phagocytosis+assay+to+evaluate+the+effect+of+HIV+on+specific+antibodies+to+pregnancy-associated+malaria.">Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria.</a> PloS One. 5 (5), 10807 (2010).</li></ol>

הפרוטוקול שהוצג כאן תואר בעבר ונעשה בושימוש 12,15,17,31 כדילמדוד את הקיבולת של נוגדנים מיקוד פני השטח של P. falciparum IEs כדי לגרום opsonization ו phagocytosis על ידי תאי THP-1.15 התוצאות המוצגות כאן מתמקדות בתרופות נוגדנים ספציפיות ל-VAR2CSA ש?...

מלריה היא מחלה הנישנת על ידי וקטור הנגרמת בבני אדם על זיהום עם חמישה מינים שונים של סוג Plasmodium. המינים הנפוצים ביותר הם P. falciparum, שאחראי גם על התפלואה והתמותה הגבוהותביותר 1. מצגת קלינית מלריה משתנה מזיהומים א-תסמינים או שפירים למחלה מסובכת/חמורה, האחרונה מתרחשת בעיקר בילדים מתחת לגיל חמש שנים. חשיפה P. falciparum אינה לגרום חסינות סטרילית, אבל אנשים החיים באזורים אנדמיים לאט לפתח חסינות מפני המחלה הקלינית. הגנה היא גיל / חשיפה תלויה חסינות נרכשת בדרך כלל במהלך 5-10 השנים הראשונות שלהחיים 2. נשים בוגרות הן יוצא מן הכלל חשוב, כמו מלריה חמורה יכולה להתרחש במהלך ההריון במצגת קלינית המכונה מלריה שליה (PM). ראש הממשלה היא סיבה חשובה להפלות, לידה מתות, לידה מוקדמת, משקל לידה נמוך, מוות עוברי ואנמיה אימהית. התנגדות לראש הממשלה מתפתחת על הריונות רצופים3. הגנה מפני PM קשורה לרכישת נוגדנים נגד PfEMP1 מסוג VAR2CSA4,5, אנטיגן אריתרושייט נגוע (IE) החייב לכונדרויטין גופרתי A (CSA) המאפשר IE סירוקציה שליה. נוגדנים לתווך הגנה ביצוע פעילויותפונקציונליות שונות (נבדק ב 6,,7)כולל opsonization של IEs כדי לגרום phagocytosis. מחקרים מוקדמים במבחנה הראו כי נוגדנים יכולים להגביל את צמיחת P. falciparum בנוכחות של מונוציטים באמצעות phagocytosis8,9. מחקרים עדכניים יותר הראו כי רמות גבוהות יותר של נוגדנים הזורמים פוגוציטוזיס קשורים לתוצאות הריון טובות יותר (בהקשר של HIV שיתוף זיהום)10,,11, המציין את הרלוונטיות של פונקציה זו אפקט בתגובה חיסונית שנרכשה באופן טבעי.
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד פונקציה זו של נוגדנים נוכחים פלזמה אנושית / סרום, באמצעות IEs מתורבתת חוץ חוץ להביע VAR2CSA יחד עם קו מונוצייט THP-1. ההסכם שימש בעבר11,12,13,14,15,16,17,18 והואנחשב גישה משופרת וקלה יותר בהשוואהפרוטוקולים מבוססי מיקרוסקופ קודם 8, שכן הוא מאפשר בדיקה של מספר גדול יותר של דגימות נוגדנים בריצה אחת באמצעות כמויות קטנות יותר של נוגדנים ונמנע ספירת מיקרוסקופים מייגעים ומוטה. למרות שהאסא היה בשימוש על ידי מעבדות מרובות וביצועו הוא פשוט מספיק, זה דורש תכנון והכנה זהירים, לכן, פרוטוקול מפורט יאפשר את יישומו על ידי מעבדות וחוקרים חסר ניסיון קודם. אנו משתמשים, כדוגמה, IEs בשלב מאוחר מסונכרן לבטא VAR2CSA opsonized עם נוגדנים נוכחים בסרום שנאספו מנשים עם חסינות ספציפית PM שנרכש באופן טבעי. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לומר את הפונקציונליות של נוגדנים לכל אנטיגן טפיל קיים על פני השטח IE, אם מושרה על ידי חשיפה טבעית או על ידי חיסון.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well cell culture plates, round bottom with lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11021-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II (5%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Blood Cells antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34858</td>
			<td>Prepare 2&#65533;&#65533;l aliquots and freeze a -20&#176;C. Use one aliquot per experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC500 flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Heat inactivate before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555406 or 556618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD64</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowLogic software</td>
			<td>Inivai technologies</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS CS-column and accesories</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parasite culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50&#181;g/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vario MACS magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay

הפרוטוקול מתאר כיצד להגדיר ולהפעיל זרימה ציטומטריה מבוססי phagocytosis אסייג של Plasmodium falciparum-נגוע אריתרוציטים (IEs) opsonized על ידי נוגדנים IgG שנרכשו באופן טבעי ספציפי עבור VAR2CSA. VAR2CSA הוא אנטיגן טפיל המתווכת את ההפרדה הסלקטיבית של IEs שליה שיכול לגרום לצורה חמורה של מלריה בנשים בהריון, הנקרא מלריה שליה (PM). הגנה מפני PM מתווך על ידי נוגדנים ספציפיים VAR2CSA כי הם האמינו לתפקד על ידי עיכוב ההשתה שליה ו / או על ידי opsonizing IEs עבור phagocytosis. ה-assay משתמש IEs בשלב מאוחר מסונכרן in vitro שנבחרו במבחנה לבטא VAR2CSA, פלזמה / סרום-נוגדנים מנשים עם חסינות ספציפית PM שנרכש באופן טבעי, ואת קו התא הפוגוציצי THP-1. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לומר את הפונקציונליות של נוגדנים לכל אנטיגן טפיל קיים על פני השטח IE, אם מושרה על ידי חשיפה טבעית או על ידי חיסון. ההסכם מציע הערכה פשוטה ותפוקה גבוהה, עם רבייה טובה, של היבט תפקודי חשוב של חסינות בתיווך נוגדנים במלריה. זה, לכן, שימושי בעת הערכת חסינות קלינית P. falciparum מלריה, גורם מרכזי של תלודים ותמותה באזורים הטרופיים, במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה.

כאן אנו מציגים בפירוט פרוטוקול שתואר בעבר31 והשתמש 11 ,12,13,14,15,15,16,17,18 כדי למדוד את הקיבולת של נוגדנים מיקוד פני השטח של P. falciparum ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הוראה כיצד למדוד את היכולת של נוגדנים הנוכחי סרה או פלזמה של אנשים, באופן טבעי חשוף Plasmodium זיהום falciparum, כדי opsonize ו לגרום phagocytosis של אריתרוציטים נגועים טפילים (IEs).

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

פרוטוקול זה מאפשר למדוד את היכולת של נוגדנים לאופוסוניזציה ולהוות את הפגוציטוזיס של פלסמודיום פלציפרום נגוע אריתרוציטים. נוגדנים הקיימים בסרום של אנשים שנחשפו באופן טבעי לזיהום טפיל, כמו גם אלה הנגרמים על ידי חיסון עם אנטיגנים טפילים, ניתן לבדוק. להדגים את ההליך איתי יהיה מיקן ויסטי, טכנאי מהמעבדה שלי.כדי להקים תרבות תאים THP-1 עבור phagocytosis assay, יום לפני הניסוי לזרוע את התאים בבקבוק תרבות בריבוע 25 ס"מ וריכוז של 2.5 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר ב THP מדיום תרבות תא אחד. ביום הניסוי, לפחות שעה אחת לפני שהניסוי חוסם לצלחות עגולות של 96 בארות עם 150 מיקרוליטרים של סטרילי 2%FBS ב-PBS ל הבאר. לקציר וטיהור של אריתרוציטים נגועים בטרופוזויטים באמצע עד בשלב מאוחר, הכינו כ־1.2 מיליליטר של תרבות טפילי P falciparum ארוזים ב־10 מיליליטר של מדיום תרבות טפילים, עם לפחות 5% טפילים והוסיפו לעמוד מגנטי.לשטוף את העמוד עם 50 מיליליטר של תרבות טפיל בינוני. כדי לסלק את אריתרוקיטים נגועים, להסיר את העמוד מן המגנט לשטוף אותו עם 50 מיליליטר של מדיום תרבות טפיל. לאחר מכן, לאסוף את אריתרוציטים נגועים על ידי צנטריפוגה ו resuspend את גלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבות טפיל טרי לספירה.התאימו את ההשעיה הנגועה המטוהרת ב-3.3 פעמים 10 לתאים השביעיים למיליליטר בתרבות הטפילים הבינונית המכילה אתידיום ברומיד, לריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר. לאחר מכן, הסר את פתרון החסימה מצלחת אחת של 96 בארות על-ידי הפלת הצלחת לתוך מיכל פסולת. לאחר מכן להסיר כל עודף על מגבת נייר ולהוסיף 30 microliters של תווית אתידיום ברומיד נגוע מתלה אריתרוציטים לכל אבל אחד טוב במחצית העליונה של הצלחת.מוסיפים 30 מיקרוליטרים של תרבות טפילים בינוניים לתוך באר ריקה, ו דגירה את הצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, מוסיפים 170 מיקרוליטרים של מדיום תרבות טפילים לכל באר ומציעים את אריתרוציטים נגועים בתחתית הצלחת על ידי צנטריפוגה. הסר את supernatant על ידי הבהבת הצלחת לתוך מיכל פסולת, ולשטוף את האתידם ברומיד שכותרתו אריתרוקיטים נגועים פעמיים נוספות, עם 200 microliters של תרבות טפיל בינוני לגם, כפי שהוכח רק.לאחר הכביסה השנייה, השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להסיר בזהירות את כל נפח supernatant מכל באר, מבלי להפריע כדורי. ולתלות מחדש את אריתרוציטים נגועים עם תווית אתידיום ברומיד ב-30 מיקרוליטרים של תווי נוגדנים, כולל הבקרות המתאימות ודגימות הבדיקה שהוכנו בעבר במדיום תרבות הטפילים. לאחר מכן, מניחים את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, מוגן מפני אור.בעוד אריתרוסיטים נגועים הם להיות opsonized, לאסוף את התאים THP-1 על ידי צנטריפוגה, ו resuspend את גלולה ב 12 מיליליטר של טרי, מראש מחומם THP-1 תא תרבות בינוני. לאחר צנטריפוגה שנייה, יש להשתמש מחדש את גלולה במיליליטר אחד של מדיום תרבות התא THP-1 לספירה, ולהתאים את ריכוז התאים לחמש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר במדיום תרבות התא THP-1. הסר את פתרון החסימה מהצלחת השנייה של 96 בארות והוסף 100 מיקרוליטרים של תאי THP-1 לכל באר.לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא. בסוף הדגירה opsonization, להוסיף 170 microliters של תרבות טפיל בינוני לכל באר של צלחת opsonization, ומסיסים את אריתרוציטים נגועים לתחתית הצלחת על ידי צנטריפוגה. לשטוף את אריתרוציטים נגועים opsonized פעמיים עם 200 microliters של תרבות טפיל בינוני ל הבאר, באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי להסיר בזהירות את supernatant לאחר לשטוף השני.תמשוך מחדש את אריתרוסיטים נגועים opsonized ב 100 microliters של THP-1 מחומם מראש תאים בינוני ל הבאר, ולהעביר 50 microliters של כל מתלה אריתרוסיטים נגועים אופוסוניזציה ל הבאר המתאימה בצלחת phagocytosis. לאחר הוספת כל התאים, מניחים את הצלחת בממגר תרבות התאים למשך לא יותר מ-40 דקות, מוגנים מפני אור. בסוף הדגירה, לעצור את phagocytosis על ידי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס.הסר את supernatant ו resuspend כדורי עם 150 microliters של טמפרטורת החדר אמוניום כלוריד lysing פתרון לגם. לאחר שלוש דקות בדיוק, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של קרח קר ב 2%FBS ב PBS כדי לעצור את התמוגה, ומסיסים את התאים שלמים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 microliters של קרח טרי קר 2% FBS ב PBS ל הבאר, לכל לשטוף.לאחר הכביסה הסופית, יש לעשות שימוש חוזר ב-200 מיקרוליטרים של קרח טרי קר 2%FBS ב-PBS ל הבאר. לרכישה וניתוח של ציטומטריית זרימה, טען מיד את התאים על ציטומטר זרימה ולהשתמש בעלילה של פיזור צד ליניארי קדימה לעומת ליניארי עבור בארות ללא אריתרוציטים נגועים לשער את תאי THP-1. לרכוש 10, 000 אירועים בשער זה, ולהשתמש בתאי THP-1 עם אריתרוציטים נגועים opsonized עם שליטה חיובית כדי להגדיר עלילה היסטוגרמה כדי למדוד את עוצמת פלואורסצנטיות אתידיום ברומיד.לצורך ניתוח, פתח את העלילה ליניארי קדימה לעומת צד ליניארי פיזור עבור בארות ללא אריתרוציטים נגועים, ושער תאי THP-1. לאחר מכן, להגדיר שער חיובי בהיסטוגרמה FL-3 ולהעתיק שערים אלה על כל בארות מדגם אחרים כדי לקבוע את אחוז אתידיום ברומיד חיובי THP-1 תאים. עבור כל מדגם שנבדק, phagocytosis ניתן דיווח כערך מוחלט או כמו phagocytosis היחסי מחושב כאחוז באמצעות הפקד החיובי כמו המקסימום.יש לבדוק מעת לעת את תאי ה- THP-1 עבור ביטוי פני השטח של קולטן גמא FC על-ידי ציטומטריית זרימה. התאים צריכים להיות שליליים עבור CD16 וחיוביים עבור CD32 ו- CD64. בניסוי אופסוניזציה זה, תאי THP-1 היו מגודרים תחילה על פי פרופילי פיזור קדימה וצד שלהם, כדי לאפשר כימות של אחוז התאים המסומן באתידיום ברומיד, המעיד על תאים שיש להם phagocytized לפחות נוגדן אחד אופוסוניזציה נגוע אריתרוציטים.דגימות הבקרה השלילית צריכות ליצור שיא שלילי יחיד בערוץ FL3, עם מעט אירועים שנצפו בסמן האתידיום ברומיד. בהתאם לכך, ערכי הפאגוסיטוזיס הממוצעים, הן כתאי THP-1 חיוביים-אתידיום מוחלט והן כאחוזי phagocytosis יחסיים, צריכים להיות נמוכים מאוד. לעומת זאת, השליטה החיובית צריכה ליצור עקבות עם שתי פסגות, שיא שלילי ושיא חיובי ומופרד היטב הממוקם בתוך סמן האתידיום ברומיד.ערכי הפאגוציטוזיס הממוצעים הם בדרך כלל הגבוהים ביותר עבור השליטה החיובית, ואחריו הבריכה הנשית החשופה למלריה והשליטה של האישה החשופה למלריה. למרות שמתודולוגיה זו יוצרת תוצאות עקביות, נצפו סטיות במקדם השיפוע של הקווים המותאמים. לכן, מומלץ להשתמש בערכים יחסיים, במיוחד אם לא ניתן להפעיל את כל הדגימות בניסוי יחיד.הקפד לתכנן את הניסוי בקפידה מראש, הכנת שני תאי THP-1 ואת הטפילים בהתאם, באמצעות trophocytes רק עם טוהר גדול מ 80%בנוסף, הקפד תמיד לכלול את הפקדים המתאימים, כדי לאפשר את איכות הניסוי להיות מוערך להקל על ניתוח נתונים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

מבחר Plasmodium falciparum טפילים עבור Cytoadhesion לתאי המוח האנושי האנדותל

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; נגועים בסביבה מסכנה משאבים

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

הפרדה<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; שלב מאוחר נגועים באמצעי מגנטי

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

בVivo ההערכה של מכרסמים Plasmodium Parasitemia וMerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...