Name: measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2020-08-06T16:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Maiken Visti er takket for utmerket teknisk assistanse. Dette arbeidet ble delvis finansiert av et stipend (MAVARECA II; 17-02-KU) fra Utenriksdepartementet i Danmark og administrert av Danida Fellowship Centre. Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.

De humane serumprøvene som ble brukt til resultatene som presenteres her, ble samlet inn i en egenstudie 19. Samlingen ble godkjent av Institutional Review Board of Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of Ghana (studie 038/10-11), og av Regional Research Ethics Committees, Capital Region of Denmark (protokoll H-4-2013-083).
1. Parasittkultur
MERK: Følg de lokale forskriftene for håndtering av menneskelige patogener.</p...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Report+-+2018.">World Malaria Report - 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li><li>Pierce, S. K., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Day+2009:+What+malaria+knows+about+the+immune+system+that+immunologists+still+do+not.">World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not.</a> Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).</li><li>Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancy-associated+malaria:+Parasite+binding,+natural+immunity+and+vaccine+development.">Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development.</a> International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+surface+antigen-specific+IgG+and+protection+against+clinical+consequences+of+pregnancy-associated+Plasmodium+falciparum+malaria.">Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria.</a> Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+variant+surface+antigens+of+plasmodium+falciparum+-Infected+erythrocytes+are+associated+with+protection+from+treatment+failure+and+the+development+of+anemia+in+pregnancy.">Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).</li><li>Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Antibodies+and+Protection+against+Blood-stage+Malaria.">Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria.</a> Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).</li><li>Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+effector+functions+in+malaria+and+other+parasitic+diseases:+a+few+needles+and+many+haystacks.">Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks.</a> Immunology &amp; Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonic+activity+of+human+immune+serum+on+in+vitro+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+infected+red+blood+cells+by+monocytes.">Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes.</a> Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-Parasitized+Erythrocytes+by+Human+Polymorphonuclear+Leukocytes.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes.</a> The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).</li><li>Jaworowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+human+immunodeficiency+virus+type+1+coinfection,+anemia,+and+levels+and+function+of+antibodies+to+variant+surface+antigens+in+pregnancy-associated+malaria.">Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).</li><li>Ata&#237;de, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+induce+phagocytosis+of+malaria+infected+erythrocytes:+Effect+of+HIV+infection+and+correlation+with+clinical+outcomes.">Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes.</a> PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunisation+with+recombinant+PfEMP1+domains+elicits+functional+rosette-inhibiting+and+phagocytosis-inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum.">Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum.</a> PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+strain-transcending+antibodies+against+Group+A+PfEMP1+surface+antigens+from+virulent+malaria+parasites.">Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets+of+antibodies+against+erythrocytes+in+malaria+immunity.">Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).</li><li>Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+upon+immunization+with+a+recombinant+PfEMP1+NTS+DBL1&#945;+domain.">Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1&#945; domain.</a> Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+point+in+protein+trafficking+by+Plasmodium+falciparum+determines+the+expression+of+major+antigens+on+the+surface+of+infected+erythrocytes+targeted+by+human+antibodies.">A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).</li><li>Quintana, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+in+children+with+malaria+to+PfEMP1,+RIFIN+and+SURFIN+expressed+at+the+Plasmodium+falciparum+parasitized+red+blood+cell+surface.">Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).</li><li>Hommel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+antibody+functional+activity+and+strain-specificity+of+vaccine+candidates+for+malaria+in+pregnancy+using+in+vitro+phagocytosis+assays.">Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).</li><li>Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+responses+to+pregnancy-restricted+and+-unrestricted+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+membrane+protein+1+antigens+in+Ghanaian+women+naturally+exposed+to+malaria+parasites.">B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).</li><li>Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+to+serum+for+cultivation+of+Plasmodium+falciparum+in+vitro.">An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pregnancy-associated+malaria-specific+B+cells+target+polymorphic,+conformational+epitopes+in+VAR2CSA.">Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA.</a> Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+Plasmodium+falciparum+3D7+for+expression+of+variant+surface+antigens+associated+with+severe+malaria+in+African+children.">In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children.</a> Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).</li><li>Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PfEMP1-VAR2CSA+translation+by+a+Plasmodium+translation-enhancing+factor.">Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor.</a> Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+immunity+to+Plasmodium+falciparum+malaria+by+IgM+masking+of+protective+IgG+epitopes+in+infected+erythrocyte+surface-exposed+PfEMP1.">Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).</li><li>Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2013).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+malaria+microscopy.+Part+I.+Learner's+Guide.">Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide.</a> World Health Organization. , (1991).</li><li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+monocyte-like+cell+line+THP-1+expresses+FcyRl+and+Fc'yRIl.">The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl.</a> Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).</li><li>Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+IgG+Fc+receptor+expression+induced+by+phorbol+12-myristate+13-acetate+treatment+of+THP-1+monocytic+leukemia+cells.">Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells.</a> Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+improved+phagocytosis+assay+to+evaluate+the+effect+of+HIV+on+specific+antibodies+to+pregnancy-associated+malaria.">Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria.</a> PloS One. 5 (5), 10807 (2010).</li></ol>

Protokollen som presenteres her har tidligere blitt beskrevet ogbrukt 12,15,17,31 for å måle kapasiteten til antistoffer rettet mot overflaten av P. falciparum IE for å indusere opsonisering og fagocytose av THP-1 celler. Resultatene som presenteres her fokuserer på naturlig ervervede VAR2CSA-spesifikke antistoffer i plasma/serum av kvinner som bor i en P. falciparum endem...

Malaria er en vektorbåren sykdom forårsaket hos mennesker ved infeksjon med fem forskjellige arter av slekten Plasmodium. Den mest utbredte arten er P. falciparum, som også er ansvarlig for den mest sykelighet og dødelighet1. Malaria klinisk presentasjon varierer fra asymptomatiske eller godartede infeksjoner til komplisert / alvorlig sykdom, sistnevnte forekommer hovedsakelig hos barn under fem år. Eksponering for P. falciparum induserer ikke steril immunitet, men personer som bor i endemiske områder utvikler langsomt immunitet mot den kliniske sykdommen. Beskyttelse er alder/eksponering avhengig og immunitet er normalt ervervet i løpet av de første 5-10 årene av livet2. Voksne kvinner er et viktig unntak, da alvorlig malaria kan oppstå under graviditet i en klinisk presentasjon kjent som placenta malaria (PM). PM er en viktig årsak til abort, dødfødsel, for tidlig levering, lav fødselsvekt, fosterdød, og mors anemi. Motstand mot PM utvikler seg over påfølgende graviditeter3. Beskyttelse mot PM er forbundet med oppkjøpet av antistoffer mot VAR2CSA-type PfEMP14,5, et infisert erytrocytt (IE) overflateantigen som binder seg til kondroitinsulfat A (CSA) som muliggjør IE-sekvestrasjon i morkaken. Antistoffer mediere beskyttelse utfører ulike funksjonelle aktiviteter (gjennomgåtti 6,7) inkludert opsonisering av IE for å indusere fagocytose. Tidlige in vitro studier viste at antistoffer kan begrense P. falciparum vekst i nærvær av monocytter via phagocytosis8,9. Nyere studier har vist at høyere nivåer av fagocytose-induserende antistoffer er forbundet med bedre graviditetsutfall (i sammenheng med HIV-samtidig infeksjon)10,11, noe som indikerer relevansen av denne effektorfunksjonen i naturlig ervervet immunrespons.
Her presenterer vi en protokoll for å måle denne funksjonen av antistoffer som finnes i humant plasma/serum, ved hjelp av in vitro kultiverte IEer som uttrykker VAR2CSA sammen med monocyttlinjen THP-1. Analysen har tidligere blitt brukt11,12,13,14,15,16,17,18 og regnes som en forbedret og enklere tilnærming sammenlignet med tidligere mikroskopbaserteprotokoller 8, siden det tillater testing av et større antall antistoffprøver i et enkelt løp ved hjelp av mindre mengder antistoff og unngår kjedelig og partisk mikroskoptelling. Selv om analysen har blitt brukt av flere laboratorier og utførelsen er enkel nok, krever det nøye planlegging og forberedelse, derfor vil en detaljert protokoll tillate anvendelse av laboratorier og forskere som mangler tidligere erfaring. Vi bruker, som et eksempel, sene fase-synkroniserte IEer som uttrykker VAR2CSA opsonisert med antistoffer tilstede i serum samlet inn fra kvinner med naturlig ervervet PM-spesifikk immunitet. Protokollen kan imidlertid enkelt endres for å analysere funksjonaliteten til antistoffer mot ethvert parasittantigen tilstede på IE-overflaten, enten indusert av naturlig eksponering eller ved vaksinasjon.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well cell culture plates, round bottom with lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11021-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II (5%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Blood Cells antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34858</td>
			<td>Prepare 2&#65533;&#65533;l aliquots and freeze a -20&#176;C. Use one aliquot per experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC500 flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Heat inactivate before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555406 or 556618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD64</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowLogic software</td>
			<td>Inivai technologies</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS CS-column and accesories</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parasite culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50&#181;g/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vario MACS magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay

Protokollen beskriver hvordan du setter opp og kjører en strømningscytometribasert fagocytoseanalyse av Plasmodium falciparum-infiserteerytrocytter (IE) opsonisert av naturlig ervervede IgG-antistoffer som er spesifikke for VAR2CSA. VAR2CSA er parasittantigenet som formidler selektiv sekvestrasjon av IE i morkaken som kan forårsake en alvorlig form for malaria hos gravide kvinner, kalt placenta malaria (PM). Beskyttelse mot PM er mediert av VAR2CSA-spesifikke antistoffer som antas å fungere ved å hemme placentasequestration og/eller ved å opsonisere IE for fagocytose. Analysen benytter sene stadium-synkroniserte IEer som er valgt in vitro å uttrykke VAR2CSA, plasma / serum-antistoffer fra kvinner med naturlig ervervet PM-spesifikk immunitet, og fagocytisk cellelinje THP-1. Protokollen kan imidlertid enkelt endres for å analysere funksjonaliteten til antistoffer mot ethvert parasittantigen tilstede på IE-overflaten, enten indusert av naturlig eksponering eller ved vaksinasjon. Analysen tilbyr enkel og høy gjennomstrømningsevaluering, med god reproduserbarhet, av et viktig funksjonelt aspekt av antistoffmediert immunitet i malaria. Det er derfor nyttig når man vurderer klinisk immunitet mot P. falciparum malaria, en viktig årsak til sykelighet og dødelighet i tropene, spesielt i Afrika sør for Sahara.

Her presenterer vi i detalj en protokoll som tidligere har blittbeskrevet 31 ogbrukt 11,12,13,14,15,16,17,18 for å måle kapasiteten til antistoffer rettet mot overflaten av P. falciparum IEs å indusere opsonisering og fag...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Det overordnede målet med denne protokollen er å gi instruksjon om hvordan man måler kapasiteten til antistoffer som finnes i sera eller plasma av individer, naturlig utsatt for Plasmodium falciparum infeksjon, å opsonisere og indusere fagocytose av parasitt-infiserte erytrocytter (IE).

Måling naturlig ervervet phagocytosis-induserende antistoffer mot Plasmodium falciparum parasitter ved en Flow Cytometry-basert analyse

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Denne protokollen gjør det mulig å måle antistoffenes evne til å opsonisere og indusere fagocytose av plasmodium falciparum infiserte erytrocytter. Antistoffer tilstede i serumet av individer som er naturlig utsatt for parasittinfeksjon, så vel som de som induseres av immunisering med parasittantigener, kan testes. Å demonstrere prosedyren med meg vil være Maiken Visti, en tekniker fra laboratoriet mitt.For å sette opp en THP-1 cellekultur for en phagocytosis analyse, dagen før eksperimentet frø cellene i en 25-centimeter kvadrert kultur kolbe og en konsentrasjon på 2,5 ganger 10 til femte celler per milliliter i THP en celle kultur medium. På dagen for eksperimentet, minst en time før eksperimentblokken til runde bunn 96-brønnplater med 150 mikroliter sterile 2% FBS i PBS per brønn. For mid-to-late-stage trophozoite-infiserte erytrocytter høsting og rensing, forberede rundt 1,2 milliliter pakket P falciparum parasittkultur i 10 milliliter parasittkultur medium, med minst 5% parasittemi og legg til en magnetisk kolonne.Vask kolonnen med 50 milliliter parasittkulturmedium. For å elute de infiserte erytrocytter, fjern kolonnen fra magneten og skyll den med 50 milliliter parasittkulturmedium. Deretter samler du de infiserte erytrocytter ved sentrifugering og resuspend pellet i en milliliter fersk parasittkultur medium for telling.Juster den rensede infiserte erytrocyttsuspensjonen med 3,3 ganger 10 til de syvende cellene per milliliter i parasittkulturmedium som inneholder ethidiumbromid, til en endelig konsentrasjon på 2,5 mikrogram per milliliter. Deretter fjerner du blokkeringsløsningen fra en 96-brønnsplate ved å sveipe platen inn i en avfallsbeholder. Fjern deretter overflødig over et papirhåndkle og tilsett 30 mikroliter av ethidiumbromidetiketten infisert erytrocyttfjæring til alle unntatt en godt i øvre halvdel av platen.Tilsett 30 mikroliter parasittkulturmedium til den tomme brønnen, og inkuber platen i 10 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen, tilsett 170 mikroliter parasittkulturmedium til hver brønn og sediment de infiserte erytrocytter på bunnen av platen ved sentrifugering. Fjern det overnaturlige ved å bla platen inn i en avfallsbeholder, og vask ethidiumbromidmerket infiserte erytrocytter to ganger til, med 200 mikroliter parasittkulturmedium per vel, som nettopp demonstrert.Etter den andre vasken, bruk en flerkanals pipette til å forsiktig fjerne hele volumet av supernatant fra hver brønn, uten å forstyrre pellets. Og resuspend ethidium bromid-merket infiserte erytrocytter i 30 mikroliter antistoffløsning, inkludert de riktige kontrollene og testprøvene som tidligere er utarbeidet i parasittkulturmedium. Deretter plasserer du platen på 37 grader Celsius i 45 minutter, beskyttet mot lys.Mens de infiserte erytrocytter blir opsonisert, samle THP-1 celler ved sentrifugering, og gjenbruk pellet i 12 milliliter av friske, pre-varmet THP-1 celle kultur medium. Etter en annen sentrifugering, resuspend pellet i en milliliter THP-1 celle kultur medium for telling, og justere cellekonsentrasjonen til fem ganger 10 til femte celler per milliliter i THP-1 celle kultur medium. Fjern blokkeringsløsningen fra den andre 96-brønnsplaten og tilsett 100 mikroliter THP-1-celler til hver brønn.Deretter plasserer du platen i cellekulturinkubatoren. På slutten av opsoniseringsinkubasjonen legger du til 170 mikroliter parasittkulturmedium til hver brønn av opsoniseringsplaten, og sedimenter de infiserte erytrocytter til bunnen av platen ved sentrifugering. Vask de opsoniserte infiserte erytrocytter to ganger med 200 mikroliter parasittkulturmedium per brønn, ved hjelp av en flerkanals pipette for å forsiktig fjerne det overnaturlige etter den andre vasken.Resuspend opsonized infiserte erytrocytter i 100 mikroliter av forvarmet THP-1 celle kultur medium per brønn, og overføre 50 mikroliter av hver opsonisert infisert erytrocytt suspensjon til en tilsvarende brønn i phagocytose plate. Når alle cellene er lagt til, plasser platen i cellekulturinkubatoren i ikke mer enn 40 minutter, beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen, stopp fagocytose ved sentrifugering ved fire grader Celsius.Fjern den overnaturlige og resuspend pellets med 150 mikroliter romtemperatur ammoniumklorid lysing løsning per brønn. Etter nøyaktig tre minutter, tilsett 100 mikroliter iskaldt ved 2% FBS i PBS for å stoppe lysisen, og sediment de intakte cellene ved sentrifugering. Deretter vasker cellene tre ganger med 200 mikroliter friskis 2% FBS i PBS per brønn, per vask.Etter den endelige vasken, resuspend cellen pellet i 200 mikroliter frisk iskald 2% FBS i PBS per brønn. For strømningscytometri oppkjøp og analyse, umiddelbart laste cellene på en strømningscytometer og bruke lineær fremover versus lineær side scatter plot for brønnene uten infiserte erytrocytter å gate THP-1 celler. Få 10 000 hendelser i denne porten, og bruk THP-1-cellene med de infiserte erytrocytter opsonisert med en positiv kontroll for å sette opp et histogrammet plott for å måle ethidiumbromid fluorescensintensiteten.For analyse, åpne lineær fremover versus lineær side scatter plot for brønnene uten infiserte erytrocytter, og gate THP-1 celler. Deretter setter du opp en positiv port i et FL-3 histogrammet og kopierer disse portene til alle de andre prøvebrønnene for å bestemme prosentandelen av ethidiumbromidpositive THP-1-celler. For hver prøve testet, kan fagocytose rapporteres som den absolutte verdien eller som den relative fagocytose beregnet som en prosentandel ved hjelp av den positive kontrollen som maksimum.THP-1-cellene bør kontrolleres regelmessig for FC gammareseptoroverflateuttrykk ved strømningscytometri. Cellene skal være negative for CD16, og positive for CD32 og CD64. I dette opsoniseringseksperimentet ble THP-1-cellene først inngjerdet i henhold til deres fremover- og sidesp scatter-profiler, for å tillate kvantifisering av prosentandelen av ethidiumbromidmerkede-merkede celler, som indikerer celler som har fagocytisert minst ett antistoff opsonisert infisert erytrocytt.De negative kontrollprøvene skal alle generere en enkelt negativ topp i FL3-kanalen, med få hendelser observert i ethidiumbromidmarkøren. Ifølge, gjennomsnittlig fagocytose verdier, både som absolutt ethidium bromid-positive THP-1 celler og som relative fagocytose prosenter, bør være svært lav. I motsetning bør den positive kontrollen generere spor med to topper, en negativ topp og en klart positiv og godt separert topp som ligger innenfor ethidiumbromidmarkøren.De gjennomsnittlige fagocytoseverdiene er normalt høyest for den positive kontrollen, etterfulgt av malariaeksponert kvinnelig basseng og de eneste malariaeksponerte kvinnekontrollene. Selv om denne metodikken genererer konsistente resultater, er avvik i hellingskoeffisienten til de justerte linjene observert. Derfor anbefales bruk av relative verdier, spesielt hvis det ikke er mulig å kjøre alle prøvene i et enkelt eksperiment.Sørg for å nøye planlegge eksperimentet på forhånd, forbereder både THP-1-cellene og parasittene tilsvarende, ved hjelp av bare trofocytter med renhet større enn 80%I tillegg må du alltid inkludere de riktige kontrollene, slik at kvaliteten på eksperimentet kan vurderes og lette dataanalyse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Valg av Plasmodium falciparum Parasitter for Cytoadhesion til Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infeksjon modell for å studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 interaksjoner i Human Primary monocytt-deriverte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

En enkel protokoll for blodplater-mediert klumping av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infiserte Erytrocytter i en ressurs Dårlig innstilling

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rensing av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites For bruk i Opsonizing Antistoff Analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

I Vivo Vurdering av gnagere Plasmodium parasitemia og merozoit invasjon av flowcytometrisystemer

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Metoder for å undersøke om forskrifter rolle Små RNA og Ribosomalt Kapasitet av<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flowcytometri basert analyse for overvåking av NK cellefunksjoner

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdere Netthinne microglial fagocyttfunksjon<em&gt; I Vivo</em&gt; Ved hjelp av en flowcytometrisystemer basert analyse

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

En flyt cytometri-baserte cytotoksisitet analysen for vurdering av menneskelig NK celle aktivitet

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...