Name: measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2020-08-06T16:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Maiken Visti é grato por excelente assistência técnica. Este trabalho foi parcialmente financiado por uma subvenção (MAVARECA II; 17-02-KU) do Ministério das Relações Exteriores da Dinamarca e administrado pelo Danida Fellowship Centre. O financiador não teve papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.

As amostras de soro humano utilizadas para os resultados aqui apresentados foram coletadas em estudo separado19. A coleta foi aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional do Noguchi Memorial Institute for Medical Research, Universidade de Gana (estudo 038/10-11), e pelos Comitês Regionais de Ética em Pesquisa, Região capital da Dinamarca (protocolo H-4-2013-083).
1. Cultura de parasitas
NOTA: Siga as normas locais para o manuseio de pat?...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Report+-+2018.">World Malaria Report - 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li><li>Pierce, S. K., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Day+2009:+What+malaria+knows+about+the+immune+system+that+immunologists+still+do+not.">World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not.</a> Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).</li><li>Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+point+in+protein+trafficking+by+Plasmodium+falciparum+determines+the+expression+of+major+antigens+on+the+surface+of+infected+erythrocytes+targeted+by+human+antibodies.">A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).</li><li>Quintana, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+in+children+with+malaria+to+PfEMP1,+RIFIN+and+SURFIN+expressed+at+the+Plasmodium+falciparum+parasitized+red+blood+cell+surface.">Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).</li><li>Hommel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+antibody+functional+activity+and+strain-specificity+of+vaccine+candidates+for+malaria+in+pregnancy+using+in+vitro+phagocytosis+assays.">Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).</li><li>Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pregnancy-associated+malaria-specific+B+cells+target+polymorphic,+conformational+epitopes+in+VAR2CSA.">Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA.</a> Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+Plasmodium+falciparum+3D7+for+expression+of+variant+surface+antigens+associated+with+severe+malaria+in+African+children.">In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children.</a> Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).</li><li>Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PfEMP1-VAR2CSA+translation+by+a+Plasmodium+translation-enhancing+factor.">Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor.</a> Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+immunity+to+Plasmodium+falciparum+malaria+by+IgM+masking+of+protective+IgG+epitopes+in+infected+erythrocyte+surface-exposed+PfEMP1.">Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).</li><li>Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2013).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+malaria+microscopy.+Part+I.+Learner's+Guide.">Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide.</a> World Health Organization. , (1991).</li><li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+monocyte-like+cell+line+THP-1+expresses+FcyRl+and+Fc'yRIl.">The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl.</a> Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).</li><li>Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+IgG+Fc+receptor+expression+induced+by+phorbol+12-myristate+13-acetate+treatment+of+THP-1+monocytic+leukemia+cells.">Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells.</a> Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+improved+phagocytosis+assay+to+evaluate+the+effect+of+HIV+on+specific+antibodies+to+pregnancy-associated+malaria.">Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria.</a> PloS One. 5 (5), 10807 (2010).</li></ol>

O protocolo aqui apresentado foi previamente descrito e utilizado12,,15,17,31 para medir a capacidade dos anticorpos voltados para a superfície das IEs de P. falciparum para induzir opsonização e fagocitose pelas células THP-1. Os resultados aqui apresentados focam em anticorpos específicos VAR2CSA adquiridos naturalmente no plasma/soro de mulheres residentes em uma região endêm...

A malária é uma doença transmitida por vetores causada em humanos após infecção com cinco espécies diferentes do gênero Plasmodium. A espécie mais prevalente é a P. falciparum,que também é responsável pela maior morbidade e mortalidade1. A apresentação clínica da malária varia de infecções assintomáticas ou benignas a doenças complicadas/graves, esta última ocorrendo principalmente em crianças menores de cinco anos. A exposição ao P. falciparum não induz imunidade estéril, mas indivíduos que vivem em áreas endêmicas lentamente desenvolvem imunidade contra a doença clínica. A proteção é dependente de idade/exposição e a imunidade é adquirida normalmente durante os primeiros 5-10 anos de vida2. As mulheres adultas são uma exceção importante, pois a malária grave pode ocorrer durante a gravidez em uma apresentação clínica conhecida como malária placentária (PM). A PM é uma importante causa de aborto, natimorto, parto prematuro, baixo peso ao nascer, morte fetal e anemia materna. A resistência à PM se desenvolve ao longo de sucessivas gestações3. A proteção contra a PM está associada à aquisição de anticorpos contra o PfEMP14,5, um antígeno de superfície eritrócito infectado (IE) que se liga ao sulfato de condroitina A (CSA) que permite o sequestro de IE na placenta. Anticorpos mediam a proteção realizando diversas atividades funcionais (revisadas em6,7) incluindo a opsonização das EIs para induzir a fagocitose. Estudos in vitro in vitro mostraram que os anticorpos podem limitar o crescimento de P. falciparum na presença de monócitos via fagocitose8,9. Estudos mais recentes têm demonstrado que níveis mais elevados de anticorpos indutores de fagocitose estão associados a melhores desfechos de gravidez (no contexto da co-infecção pelo HIV)10,11, indicando a relevância dessa função efetiva na resposta imune adquirida naturalmente.
Aqui apresentamos um protocolo para medir essa função de anticorpos presentes no plasma/soro humano, utilizando IEs in vitro cultivados expressando VAR2CSA juntamente com a linha de monócitoS THP-1. O ensaio foi usado anteriormente11,12,13,14,15,16,17,18 e é considerado uma abordagem melhorada e mais fácil em comparação com os protocolos anteriores baseados em microscópio8, uma vez que permite o teste de um número maior de amostras de anticorpos em uma única corrida usando volumes menores de anticorpos e evitando a contagem de microcópia tediosa e tendenciosa. Embora o ensaio tenha sido usado por vários laboratórios e sua execução seja bastante simples, requer um planejamento e preparação cuidadosos, portanto, um protocolo detalhado permitiria sua aplicação por laboratórios e pesquisadores sem experiência prévia. Usamos, como exemplo, IEs sincronizados em estágio final expressando VAR2CSA opssonizado com anticorpos presentes em soro coletados de mulheres com imunidade específica de PM adquirida naturalmente. No entanto, o protocolo pode ser facilmente modificado para avaliar a funcionalidade de anticorpos para qualquer antígeno parasita presente na superfície do IE, seja induzido pela exposição natural ou pela vacinação.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well cell culture plates, round bottom with lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11021-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II (5%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Blood Cells antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34858</td>
			<td>Prepare 2&#65533;&#65533;l aliquots and freeze a -20&#176;C. Use one aliquot per experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC500 flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Heat inactivate before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555406 or 556618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD64</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowLogic software</td>
			<td>Inivai technologies</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS CS-column and accesories</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parasite culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50&#181;g/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vario MACS magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay

O protocolo descreve como configurar e executar um ensaio de fagocitose baseado em citometria de fluxo de plasmodium falciparum-infectado eritrócitos (IEs) opsonizados por anticorpos IgG naturalmente adquiridos específicos para VAR2CSA. VAR2CSA é o antígeno parasita que media o sequestro seletivo de IEs na placenta que pode causar uma forma grave de malária em gestantes, chamada malária placentária (PM). A proteção contra PM é mediada por anticorpos específicos var2CSA que se acredita funcionar inibindo o sequestro placentário e/ou opssonizando IEs para fagocitose. O ensaio emprega IEs sincronizados em estágio final que foram selecionados in vitro para expressar VAR2CSA, plasma/soro-anticorpos de mulheres com imunidade específica de PM adquirida naturalmente, e a linha de células fagocíticas THP-1. No entanto, o protocolo pode ser facilmente modificado para avaliar a funcionalidade de anticorpos para qualquer antígeno parasita presente na superfície do IE, seja induzido pela exposição natural ou pela vacinação. O ensaio oferece avaliação simples e de alto rendimento, com boa reprodutibilidade, de um importante aspecto funcional da imunidade mediada por anticorpos na malária. É, portanto, útil na avaliação da imunidade clínica à malária P. falciparum, uma das principais causas de morbidade e mortalidade nos trópicos, particularmente na África subsaariana.

Aqui apresentamos em detalhes um protocolo que já foi descrito31 e utilizado11,12,13,14,15,16,17,18 para medir a capacidade de anticorpos voltados para a superfície das IEs P. falciparum para induzir opsonização e fagoci...

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Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

O objetivo geral deste protocolo é fornecer instruções sobre como medir a capacidade dos anticorpos presentes no soro ou plasma de indivíduos, naturalmente expostos à infecção por Plasmodium falciparum, para opsonizar e induzir fagocitose dos eritrócitos infectados por parasitas (IEs).

Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Este protocolo permite medir a capacidade dos anticorpos de opsonizar e induzir a fagocitose de eritrócitos infectados pelo plasmodium falciparum. Podem ser testados anticorpos presentes no soro de indivíduos naturalmente expostos à infecção por parasitas, bem como aqueles induzidos pela imunização com antígenos parasitas. Demonstrando o procedimento comigo estará Maiken Visti, um técnico do meu laboratório.Para criar uma cultura celular THP-1 para um ensaio de fagocitose, um dia antes do experimento semeou as células em um frasco de cultura ao quadrado de 25 centímetros e uma concentração de 2,5 vezes 10 a 5 células por mililitro em THP um meio de cultura celular. No dia do experimento, pelo menos uma hora antes do bloco de experimentos para placas de fundo redondo de 96 poços com 150 microliters de FBS estéreis de 2%em PBS por poço. Para a colheita e purificação de eritrócitos infectados por trophozoitas em estágio médio e tardio em 10 mililitros de cultura parasita, com pelo menos 5% de parasitas e adicionar a uma coluna magnética.Lave a coluna com 50 mililitros de cultura parasita. Para elutá-los os eritrócitos infectados, remova a coluna do ímã e lave-a com 50 mililitros de cultura parasita. Em seguida, colete os eritrócitos infectados por centrifugação e resuspende a pelota em um mililitro de meio de cultura parasita fresco para contar.Ajuste a suspensão de eritrócito infectado purificado em 3,3 vezes 10 para a sétima célula por mililitro em meio de cultura parasita contendo brometo de etídio, para uma concentração final de 2,5 microgramas por mililitro. Em seguida, remova a solução de bloqueio de uma placa de 96 poços, jogando a placa em um recipiente de lixo. Em seguida, remova qualquer excesso sobre uma toalha de papel e adicione 30 microliters do rótulo de brometo de etídio infectado suspensão de eritrócito infectado a todos, exceto um bem na metade superior da placa.Adicione 30 microliters de cultura parasita ao poço vazio e incubar a placa por 10 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Ao final da incubação, adicione 170 microlitadores de cultura parasita médio a cada poço e sedimente os eritrócitos infectados na parte inferior da placa por centrifugação. Remova o supernatante, jogando a placa em um recipiente de lixo, e lave os eritrócitos infectados com brometo de etídio mais duas vezes, com 200 microliters de cultura parasita por bem, como apenas demonstrado.Após a segunda lavagem, use uma pipeta multicanal para remover cuidadosamente todo o volume de supernanato de cada poço, sem perturbar as pelotas. E resuspenja o eritrócito infectado rotulado por eritrócitos em 30 microliters de solução de anticorpos, incluindo os controles apropriados e amostras de teste previamente preparados em meio de cultura parasita. Em seguida, coloque a placa a 37 graus Celsius por 45 minutos, protegida da luz.Enquanto os eritrócitos infectados estão sendo opsonizados, colete as células THP-1 por centrifugação, e resuspenda a pelota em 12 mililitros de meio de cultura celular THP-1 fresco e pré-aquecido. Após uma segunda centrifugação, resuspenda a pelota em um mililitro de meio de cultura celular THP-1 para contagem, e ajustar a concentração celular para cinco vezes 10 para as quintas células por mililitro no meio de cultura celular THP-1. Remova a solução de bloqueio da segunda placa de 96 poços e adicione 100 microliters de células THP-1 a cada poço.Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular. Ao final da incubação da opsonização, adicione 170 microliters de cultura parasita médio a cada poço da placa de opssonização, e sedimente os eritrócitos infectados até o fundo da placa por centrifugação. Lave os eritrócitos infectados opsonizados duas vezes com 200 microliters de cultura parasita por poço, usando uma pipeta multicanal para remover cuidadosamente o supernatante após a segunda lavagem.Resuspend os eritrócitos infectados opsonizados em 100 microliters de meio de cultura celular THP-1 pré-aquecido por poço, e transfira 50 microlitadores de cada suspensão eritrócito infectado opsonizado para um poço correspondente na placa de fagocitose. Quando todas as células tiverem sido adicionadas, coloque a placa na incubadora de cultura celular por não mais do que 40 minutos, protegida da luz. No final da incubação, pare a fagocitose por centrifugação a quatro graus Celsius.Remova o supernascer e resuspenja as pelotas com 150 microliters de solução de cloreto de amônio de temperatura ambiente por poço. Após exatamente três minutos, adicione 100 microlitadores de gelo frio a 2% FBS em PBS para parar a lise, e sedimentar as células intactas por centrifugação. Em seguida, lave as células três vezes com 200 microliters de gelo fresco frio 2% FBS em PBS por poço, por lavagem.Após a lavagem final, resuspenja a pelota celular em 200 microliters de gelo fresco frio 2%FBS em PBS por poço. Para aquisição e análise da citometria de fluxo, carregue imediatamente as células em um citômetro de fluxo e use o gráfico de dispersão lateral linear para frente versus linear para os poços sem eritrócitos infectados para fechar as células THP-1. Adquira 10.000 eventos neste portão, e use as células THP-1 com os eritrócitos infectados opsonizados com um controle positivo para configurar um enredo histograma para medir a intensidade de fluorescência de brometo de ethidium.Para análise, abra o gráfico de dispersão lateral linear para frente versus linear para os poços sem eritrócitos infectados, e portão as células THP-1. Em seguida, configure um portão positivo em um histograma FL-3 e copie esses portões em todos os outros poços de amostra para determinar a porcentagem de células THP-1 positivas do brometo de ethidium. Para cada amostra testada, a fagocitose pode ser relatada como o valor absoluto ou como a fagocitose relativa calculada como uma porcentagem usando o controle positivo como o máximo.As células THP-1 devem ser verificadas periodicamente para a expressão da superfície do receptor gama FC por citometria de fluxo. As células devem ser negativas para CD16, e positivas para CD32 e CD64. Neste experimento de opsonização, as células THP-1 foram fechadas primeiro de acordo com seus perfis de dispersão dianteira e lateral, para permitir a quantificação da porcentagem de células rotuladas por brometo de etídio, indicativo de células que phagocitos têm fagocitos pelo menos um anticorpo opsonizado infectado eritrócito.As amostras de controle negativo devem gerar um único pico negativo no canal FL3, com poucos eventos observados no marcador de brometo de ethidium. Assim, os valores médios da fagocitose, tanto como células thp-1 positivas de ethidium absolutos quanto como percentuais relativos de fagocitose, devem ser muito baixos. Em contraste, o controle positivo deve gerar traços com dois picos, um pico negativo e um pico claramente positivo e bem separado localizado dentro do marcador de brometo de ethidium.Os valores médios da fagocitose são normalmente mais elevados para o controle positivo, seguidos pela piscina feminina exposta à malária e pelos controles femininos expostos à malária. Embora essa metodologia gere resultados consistentes, foram observados desvios no coeficiente de inclinação das linhas ajustadas. Portanto, recomenda-se o uso de valores relativos, especialmente se não for possível executar todas as amostras em um único experimento.Certifique-se de planejar cuidadosamente o experimento com antecedência, preparando tanto as células THP-1 quanto os parasitas em conformidade, utilizando apenas trofócitos com uma pureza superior a 80%, certifique-se de incluir sempre os controles apropriados, para permitir que a qualidade do experimento seja avaliada e facilitar a análise dos dados.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Seleção de Plasmodium falciparum Parasitas para Cytoadhesion para células do cérebro humano endotelial

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Imunologia e Infecção

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Um protocolo simples para agregação plaquetária mediada por<em&gt; Plasmodium falciparum</emEritrócitos&gt; infectados em uma configuração com poucos recursos

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separação de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Fase Tardia eritrócitos infectados por meio magnético

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

A avaliação in vivo de Rodent Plasmodium parasitemia e Merozoito Invasion por citometria de fluxo

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Métodos para investigar o papel de Regulamentação dos Pequenos RNAs e Ribosomal Ocupação de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...