Name: measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2020-08-06T16:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Майкен Висти благодарит за отличную техническую помощь. Эта работа частично финансировалась за счет гранта (MAVARECA II; 17-02-KU) министерства иностранных дел Дании и администрироваться Центром стипендий Даниды. Спонсор не играл никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Образцы сыворотки человека, используемые для представленных здесь результатов, были собраны в отдельномисследовании 19. Коллекция была одобрена Институциональным советом по обзору Института медицинских исследований Мемориала Ногути, Университетом Ганы (исследование 038/1...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Report+-+2018.">World Malaria Report - 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li><li>Pierce, S. K., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Day+2009:+What+malaria+knows+about+the+immune+system+that+immunologists+still+do+not.">World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not.</a> Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).</li><li>Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancy-associated+malaria:+Parasite+binding,+natural+immunity+and+vaccine+development.">Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development.</a> International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+surface+antigen-specific+IgG+and+protection+against+clinical+consequences+of+pregnancy-associated+Plasmodium+falciparum+malaria.">Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria.</a> Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+variant+surface+antigens+of+plasmodium+falciparum+-Infected+erythrocytes+are+associated+with+protection+from+treatment+failure+and+the+development+of+anemia+in+pregnancy.">Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).</li><li>Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Antibodies+and+Protection+against+Blood-stage+Malaria.">Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria.</a> Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).</li><li>Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+effector+functions+in+malaria+and+other+parasitic+diseases:+a+few+needles+and+many+haystacks.">Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks.</a> Immunology &amp; Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonic+activity+of+human+immune+serum+on+in+vitro+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+infected+red+blood+cells+by+monocytes.">Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes.</a> Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-Parasitized+Erythrocytes+by+Human+Polymorphonuclear+Leukocytes.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes.</a> The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).</li><li>Jaworowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+human+immunodeficiency+virus+type+1+coinfection,+anemia,+and+levels+and+function+of+antibodies+to+variant+surface+antigens+in+pregnancy-associated+malaria.">Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).</li><li>Ata&#237;de, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+induce+phagocytosis+of+malaria+infected+erythrocytes:+Effect+of+HIV+infection+and+correlation+with+clinical+outcomes.">Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes.</a> PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunisation+with+recombinant+PfEMP1+domains+elicits+functional+rosette-inhibiting+and+phagocytosis-inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum.">Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum.</a> PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+strain-transcending+antibodies+against+Group+A+PfEMP1+surface+antigens+from+virulent+malaria+parasites.">Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets+of+antibodies+against+erythrocytes+in+malaria+immunity.">Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).</li><li>Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+upon+immunization+with+a+recombinant+PfEMP1+NTS+DBL1&#945;+domain.">Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1&#945; domain.</a> Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+point+in+protein+trafficking+by+Plasmodium+falciparum+determines+the+expression+of+major+antigens+on+the+surface+of+infected+erythrocytes+targeted+by+human+antibodies.">A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).</li><li>Quintana, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+in+children+with+malaria+to+PfEMP1,+RIFIN+and+SURFIN+expressed+at+the+Plasmodium+falciparum+parasitized+red+blood+cell+surface.">Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).</li><li>Hommel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+antibody+functional+activity+and+strain-specificity+of+vaccine+candidates+for+malaria+in+pregnancy+using+in+vitro+phagocytosis+assays.">Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).</li><li>Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+responses+to+pregnancy-restricted+and+-unrestricted+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+membrane+protein+1+antigens+in+Ghanaian+women+naturally+exposed+to+malaria+parasites.">B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).</li><li>Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+to+serum+for+cultivation+of+Plasmodium+falciparum+in+vitro.">An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pregnancy-associated+malaria-specific+B+cells+target+polymorphic,+conformational+epitopes+in+VAR2CSA.">Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA.</a> Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+Plasmodium+falciparum+3D7+for+expression+of+variant+surface+antigens+associated+with+severe+malaria+in+African+children.">In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children.</a> Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).</li><li>Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PfEMP1-VAR2CSA+translation+by+a+Plasmodium+translation-enhancing+factor.">Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor.</a> Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+immunity+to+Plasmodium+falciparum+malaria+by+IgM+masking+of+protective+IgG+epitopes+in+infected+erythrocyte+surface-exposed+PfEMP1.">Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).</li><li>Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2013).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+malaria+microscopy.+Part+I.+Learner's+Guide.">Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide.</a> World Health Organization. , (1991).</li><li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+monocyte-like+cell+line+THP-1+expresses+FcyRl+and+Fc'yRIl.">The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl.</a> Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).</li><li>Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+IgG+Fc+receptor+expression+induced+by+phorbol+12-myristate+13-acetate+treatment+of+THP-1+monocytic+leukemia+cells.">Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells.</a> Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+improved+phagocytosis+assay+to+evaluate+the+effect+of+HIV+on+specific+antibodies+to+pregnancy-associated+malaria.">Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria.</a> PloS One. 5 (5), 10807 (2010).</li></ol>

Протокол, представленный здесь, был ранееописан и использован 12,15,17,31 для измерения способностиантител,направленных на поверхность P. falciparum IEs, чтобы вызвать опсонизацию и фагоцитоз клетками THP-1. Представленные з...

Малярия является трансмиссивной болезнью, вызываемой у людей при инфицировании пяти различных видов рода Plasmodium. Наиболее распространенным видом является P. falciparum, который также отвечает за наиболее заболеваемости и смертности1. Клиническое представление малярии варьируется от аимптоматических или доброкачественных инфекций до сложных/тяжелых заболеваний, последние происходят в основном у детей в возрасте до пяти лет. Воздействие P. falciparum не вызывает стерильного иммунитета, но у людей, живущих в эндемичных районах, медленно развивается иммунитет против клинической болезни. Защита зависит от возраста/экспозиции, а иммунитет обычно приобретается в течение первых 5-10 лет жизни2. Взрослые женщины являются важным исключением, так как тяжелая малярия может произойти во время беременности в клинической презентации, известной как плацентарный малярии (ТЧ). ТЧ является важной причиной абортов, мертворождений, преждевременных родов, низкой массы тела при рождении, смерти плода и материнской анемии. Сопротивление PM развивается в течение последовательных беременностей3. Защита от ТЧ связана с приобретением антител против PFEMP1 типа VAR2CSA4,5,инфицированного эритроцита (IE) поверхностного антигена, который связывает хондроитин сульфат A (CSA), позволяющий IE секвестрации в плаценте. Антитела посредником защиты выполнения различных функциональных мероприятий(рассмотрены в 6,7), в том числе опсонизации ИЭ, чтобы вызвать фагоцитоз. Ранние исследования in vitro показали, что антитела могут ограничить рост P. falciparum в присутствии моноцитов через фагоцитоз8,9. Более поздние исследования показали, что более высокие уровни фагоцитоз-индуцирующих антител связаны с лучшими исходами беременности (в контексте со-инфекции ВИЧ)10,11, что свидетельствует об актуальности этой функции эффектора в естественно приобретенных иммунных реакций.
Здесь мы представляем протокол для измерения этой функции антител, присутствующих в плазме/сыворотке человека, используя in vitro культурные IEs, выражаюющие VAR2CSA вместе с моноцитной линией THP-1. Анализ был ранее использован11 , 12,13,14,1514,16,17,18 и считаетсяулучшенным и более простой подход по сравнению с предыдущими микроскопомна основе протоколов 8, так как это позволяет тестирование большего числа образцов антител в одном запуске с использованием меньших объемов антител и избежать утомительного и предвзятого подсчета микроскопии. Несмотря на то, что анализ использовался несколькими лабораториями и его выполнение достаточно просто, оно требует тщательного планирования и подготовки, поэтому подробный протокол позволит использовать его лабораториям и исследователям, не имеющим предыдущего опыта. В качестве примера мы используем синхронизированные ИИ на поздней стадии, выражаюющие VAR2CSA, оссонированные антителами, присутствующими в сыворотке крови, собранными у женщин с естественным ТЧ-специфическим иммунитетом. Тем не менее, протокол может быть легко изменен, чтобы продать функциональность антител к любому антигену паразита, присутствуют на поверхности IE, будь то индуцированные естественным воздействием или вакцинацией.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well cell culture plates, round bottom with lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11021-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II (5%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Blood Cells antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34858</td>
			<td>Prepare 2&#65533;&#65533;l aliquots and freeze a -20&#176;C. Use one aliquot per experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC500 flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Heat inactivate before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555406 or 556618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD64</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowLogic software</td>
			<td>Inivai technologies</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS CS-column and accesories</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parasite culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50&#181;g/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vario MACS magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay

Протокол описывает, как настроить и запустить поток цитометрии основе фагоцитоза анализ Plasmodium falciparum-инфицированныхэритроцитов (ИП) опоясывается естественно приобретенных антител IgG, характерных для VAR2CSA. VAR2CSA является паразитом антиген, который опосредует селективного секвестра ИП в плаценте, которые могут вызвать тяжелую форму малярии у беременных женщин, называется плацентарной малярии (ТЧ). Защита от ТЧ опосредована СПЕЦИФИЧЕСКИМИ антителами VAR2CSA, которые, как полагают, функционируют путем ингибирования плацентарный секвестр и/или путем опосредовки ИП для фагоцитоза. Анализ использует поздней стадии синхронизированных ИП, которые были выбраны в пробирке, чтобы выразить VAR2CSA, плазмы / сыворотки антитела от женщин с естественным приобретенным PM-специфический иммунитет, и фагоцитатической клеточной линии THP-1. Тем не менее, протокол может быть легко изменен, чтобы продать функциональность антител к любому антигену паразита, присутствуют на поверхности IE, будь то индуцированные естественным воздействием или вакцинацией. Анализ предлагает простую и высокую пропускную способность оценки, с хорошей воспроизводимости, важного функционального аспекта антител опосредованного иммунитета при малярии. Поэтому он полезен при оценке клинического иммунитета к малярии P. falciparum, основной причине заболеваемости и смертности в тропиках, особенно в странах Африки к югу от Сахары.

Здесь мы представляем подробно протокол, который ранеебыл описан 31 и используется 11,12,13,14,15,16,17,,,18 для измерения способности ант...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы дать инструкцию о том, как измерить способность антител, присутствующих в сере или плазме людей, естественно подверженных Plasmodium falciparum инфекции, чтобы опсонизировать и вызвать фагоцитоз паразитов инфицированных эритроцитов (ИП).

Измерение естественно приобретенных фагоцитоз-индуцирующих антител к паразитам Plasmodium falciparum с помощью анализа на основе цитометрии потока

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Этот протокол позволяет измерить способность антител к опсонизации и вызвать фагоцитоз плазмодия falciparum инфицированных эритроцитов. Антитела, присутствующие в сыворотке крови лиц, естественно подверженных паразитарной инфекции, а также те, которые вызваны иммунизацией с паразитами антигенов, могут быть проверены. Демонстрацией процедуры со мной будет Майкен Висти, техник из моей лаборатории.Чтобы создать культуру клеток THP-1 для анализа фагоцитоза, за день до эксперимента семени клеток в 25-сантиметровом квадрате культуры колбу и концентрации 2,5 раза 10 до пятой клетки на миллилитр в THP одной клеточной культуры среды. В день эксперимента, по крайней мере за час до начала эксперимента блок круглым дном 96-хорошо пластин с 150 микролитров стерильных 2%FBS в PBS на колодец. Для середины-поздней стадии трофозоита инфицированных эритроцитов сбора и очистки, подготовить около 1,2 миллилитров упакованы P falciparum паразита культуры в 10 миллилитров паразита культуры среды, по крайней мере 5%parasitemia и добавить к магнитной колонке.Вымойте колонку 50 миллилитров среды культуры паразитов. Чтобы избавить инфицированных эритроцитов, удалить столбец из магнита и промыть его с 50 миллилитров паразита культуры среды. Затем, собирать инфицированных эритроцитов центрифугации и повторно гранулы в один миллилитр свежих паразитов культуры среды для подсчета.Отрегулируйте очищенную инфекционную эритроцитную суспензию в 3,3 раза 10 до седьмого клетки на миллилитр в среде культуры паразитов, содержащей бромид этидия, до конечной концентрации 2,5 микрограмма на миллилитр. Затем удалите блокирующий раствор с одной пластины из 96 колодец, смахивая тарелку в контейнер для отходов. Затем удалите излишки на бумажное полотенце и добавить 30 микролитров этидия бромид этикетки инфицированных эритроцитов подвески для всех, кроме одного хорошо в верхней половине пластины.Добавьте 30 микролитров среды культуры паразитов в пустой колодец и инкубировать пластину в течение 10 минут при комнатной температуре, защищенной от света. В конце инкубации добавьте 170 микролитров среды культуры паразитов к каждой хорошо и осадок инфицированных эритроцитов в нижней части пластины центрифугации. Удалите супернатант, щелкивая пластину в контейнер для отходов, и мыть этидий бромид помечены инфицированных эритроцитов еще два раза, с 200 микролитров паразита культуры среды на колодец, как только что продемонстрировали.После второй стирки используйте многоканарную пипетку, чтобы тщательно удалить весь объем супернатанта из каждой системы, не нарушая гранулы. И повторное использование этидия бромид помечены инфицированных эритроцитов в 30 микролитров раствора антител, в том числе соответствующие элементы управления и тестовые образцы, ранее подготовленные в среде культуры паразитов. Затем поместите пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 45 минут, защищенных от света.В то время как инфицированные эритроциты в настоящее время opsonized, собирать THP-1 клетки центрифугации, и повторно гранулы в 12 миллилитров свежих, предварительно нагревается THP-1 клеточной культуры среды. После второй центрифугации, повторно гранулы в один миллилитр THP-1 клеточной культуры среды для подсчета, и настроить концентрацию клеток в пять раз от 10 до пятых клеток на миллилитр в THP-1 клеточной культуры среды. Удалите блокирующий раствор со второй пластины 96-колодец и добавьте 100 микролитров клеток THP-1 к каждой хорошо.Затем поместите пластину в инкубатор клеточной культуры. В конце инкубации опсонизации добавьте 170 микролитров среды культуры паразитов к каждому колодец оссонизации пластины, и осадок инфицированных эритроцитов на дно пластины центрифугации. Вымойте опсонизированные инфицированные эритроциты два раза с 200 микролитров паразита культуры среды на колодец, используя многоканарный пипетку, чтобы тщательно удалить супернатант после второй стирки.Resuspend opsonized зараженных эритроцитов в 100 микролитров предварительно разогретой THP-1 клеточной культуры среды на колодец, и передачи 50 микролитров каждого опсонизированных инфицированных эритроцитов подвески в соответствующий колодец в фагоцитоз пластины. Когда все клетки были добавлены, поместите пластину в инкубатор культуры клеток в течение не более 40 минут, защищенных от света. В конце инкубации, остановить фагоцитоз центрифугации при четырех градусах по Цельсию.Удалить супернатант и повторно гранулы с 150 микролитров комнатно-температурного раствора хлорида аммония на колодец. Ровно через три минуты добавьте 100 микролитров ледяного холода при 2%FBS в PBS, чтобы остановить лиз, и от осадка нетронутых клеток центрифугации. Далее, мыть клетки три раза с 200 микролитров свежего ледяного 2%FBS в PBS на колодец, за стирку.После окончательной стирки, повторное распределение гранулы клетки в 200 микролитров свежего ледяного холода 2%FBS в PBS на колодец. Для приобретения и анализа цитометрии потока немедленно загрузите клетки на цитометр потока и используйте линейный вперед по сравнению с линейным боковым рассеянием участка для скважин без зараженных эритроцитов к воротам клеток THP-1. Приобретите 10 000 событий в этих воротах, и используйте клетки THP-1 с инфицированными эритроцитами, опсонизированными с положительным контролем, чтобы создать сюжет гистограммы для измерения интенсивности флуоресценции бромистого этидия.Для анализа откройте линейный вперед и линейный участок рассеяния стороны для колодцев без зараженных эритроцитов и ворота клеток THP-1. Затем установите положительные ворота в гистограмме FL-3 и скопируйте эти ворота на все другие пробные скважины, чтобы определить процент клеток этидия бромисто-положительного THP-1. Для каждого образца испытания, фагоцитоз может быть сообщено как абсолютное значение или как относительный фагоцитоз рассчитывается в процентах с использованием положительного контроля, как максимум.Клетки THP-1 должны периодически проверяться на экспрессию поверхности гамма-рецепторов с помощью цитометрии потока. Клетки должны быть отрицательными для CD16 и положительными для CD32 и CD64. В этом эксперименте опсонизации, THP-1 клетки были закрыты в первую очередь в соответствии с их вперед и стороны рассеяния профилей, чтобы квантификация процент этидия бромисто-маркированных клеток, что свидетельствует о клетках, которые фагоцитов по крайней мере одно антитело опсонизированных инфицированных эритроцитов.Отрицательные образцы контроля должны генерировать один отрицательный пик в канале FL3, с несколькими событиями, наблюдаемыми в маркере бромистого этидия. Соответственно, средние значения фагоцитоза, как абсолютные клетки бромистого этидия, положительные THP-1, так и относительные проценты фагоцитоза, должны быть очень низкими. В отличие от этого, положительный контроль должен генерировать следы с двумя пиками, отрицательным пиком и явно положительным и хорошо разделенным пиком, расположенным в пределах бромистого маркера этидия.Средние значения фагоцитоза, как правило, являются самыми высокими для позитивного контроля, за которыми следуют женский бассейн, подвергшийся воздействию малярии, и единый женский контроль, подвергшийся воздействию малярии. Хотя эта методология приносит последовательные результаты, наблюдаются отклонения в коэффициенте наклона скорректированных линий. Поэтому рекомендуется использовать относительные значения, особенно если невозможно запустить все образцы в одном эксперименте.Обязательно спланируйте эксперимент заранее, подготовив как клетки THP-1, так и паразитов соответственно, используя только трофициты с чистотой более 80%Кроме того, обязательно обязательно включите соответствующие элементы управления, чтобы качество эксперимента оценивалось и облегчали анализ данных.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Выбор Plasmodium тропической Паразиты для Cytoadhesion для мозга человека эндотелиальных клеток

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

<em&gt; В пробирке</em&gt; Ко-инфекция моделью для изучения<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; ВИЧ-1 Взаимодействие человека в первичной моноцитарных иммунных клеток

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Простой протокол для опосредованного тромбоцитами слипания<em&gt; Малярийного плазмодия</em&gt;-Инфицированных эритроцитов в условиях ограниченных ресурсов Настройка

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Разделение<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; Поздняя стадия-инфицированных эритроцитов магнитных средств

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Высокая доходность Очистка<em&gt; Plasmodium тропической</em&gt; Мерозоиты для использования в Opsonizing антитела анализы

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

В Vivo оценки грызунов Plasmodium паразитемия и мерозоитам вторжения с помощью проточной цитометрии

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Методы по расследованию регулирующей роли малых РНК и рибосомного размещения в<em&gt; Малярийного плазмодия</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Проточной цитометрии на основе анализа на мониторинге NK клеточных функций

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции<em&gt; В Vivo</em&gt; С использованием анализа проточной цитометрии на основе

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

На основе цитометрии цитотоксичность Assay потока для оценки активности клеток человека NK

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...