Name: measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2020-08-06T16:20:00
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Maiken Visti es agradecido por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue financiado en parte por una subvención (MAVARECA II; 17-02-KU) del Ministerio de Relaciones Exteriores de Dinamarca y administrado por el Centro de Becas Danida. El financiador no tenía ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Las muestras de suero humano utilizadas para los resultados presentados aquí se recogieron en un estudio separado19. La colección fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional del Instituto Memorial de Investigación Médica noguchi, Universidad de Ghana (estudio 038/10-11), y por los Comités Regionales de Etica de Investigación, Región Capital de Dinamarca (protocolo H-4-2013-083).
1. Cultivo de parásitos
NOTA: Siga las regulacion...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Report+-+2018.">World Malaria Report - 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li><li>Pierce, S. K., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Day+2009:+What+malaria+knows+about+the+immune+system+that+immunologists+still+do+not.">World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not.</a> Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).</li><li>Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancy-associated+malaria:+Parasite+binding,+natural+immunity+and+vaccine+development.">Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development.</a> International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+surface+antigen-specific+IgG+and+protection+against+clinical+consequences+of+pregnancy-associated+Plasmodium+falciparum+malaria.">Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria.</a> Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+variant+surface+antigens+of+plasmodium+falciparum+-Infected+erythrocytes+are+associated+with+protection+from+treatment+failure+and+the+development+of+anemia+in+pregnancy.">Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).</li><li>Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Antibodies+and+Protection+against+Blood-stage+Malaria.">Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria.</a> Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).</li><li>Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+effector+functions+in+malaria+and+other+parasitic+diseases:+a+few+needles+and+many+haystacks.">Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks.</a> Immunology &amp; Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonic+activity+of+human+immune+serum+on+in+vitro+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+infected+red+blood+cells+by+monocytes.">Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes.</a> Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-Parasitized+Erythrocytes+by+Human+Polymorphonuclear+Leukocytes.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes.</a> The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).</li><li>Jaworowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+human+immunodeficiency+virus+type+1+coinfection,+anemia,+and+levels+and+function+of+antibodies+to+variant+surface+antigens+in+pregnancy-associated+malaria.">Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).</li><li>Ata&#237;de, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+induce+phagocytosis+of+malaria+infected+erythrocytes:+Effect+of+HIV+infection+and+correlation+with+clinical+outcomes.">Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes.</a> PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunisation+with+recombinant+PfEMP1+domains+elicits+functional+rosette-inhibiting+and+phagocytosis-inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum.">Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum.</a> PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+strain-transcending+antibodies+against+Group+A+PfEMP1+surface+antigens+from+virulent+malaria+parasites.">Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets+of+antibodies+against+erythrocytes+in+malaria+immunity.">Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).</li><li>Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+upon+immunization+with+a+recombinant+PfEMP1+NTS+DBL1&#945;+domain.">Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1&#945; domain.</a> Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+point+in+protein+trafficking+by+Plasmodium+falciparum+determines+the+expression+of+major+antigens+on+the+surface+of+infected+erythrocytes+targeted+by+human+antibodies.">A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).</li><li>Quintana, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+in+children+with+malaria+to+PfEMP1,+RIFIN+and+SURFIN+expressed+at+the+Plasmodium+falciparum+parasitized+red+blood+cell+surface.">Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).</li><li>Hommel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+antibody+functional+activity+and+strain-specificity+of+vaccine+candidates+for+malaria+in+pregnancy+using+in+vitro+phagocytosis+assays.">Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).</li><li>Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+responses+to+pregnancy-restricted+and+-unrestricted+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+membrane+protein+1+antigens+in+Ghanaian+women+naturally+exposed+to+malaria+parasites.">B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).</li><li>Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+to+serum+for+cultivation+of+Plasmodium+falciparum+in+vitro.">An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pregnancy-associated+malaria-specific+B+cells+target+polymorphic,+conformational+epitopes+in+VAR2CSA.">Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA.</a> Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+Plasmodium+falciparum+3D7+for+expression+of+variant+surface+antigens+associated+with+severe+malaria+in+African+children.">In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children.</a> Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).</li><li>Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PfEMP1-VAR2CSA+translation+by+a+Plasmodium+translation-enhancing+factor.">Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor.</a> Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+immunity+to+Plasmodium+falciparum+malaria+by+IgM+masking+of+protective+IgG+epitopes+in+infected+erythrocyte+surface-exposed+PfEMP1.">Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).</li><li>Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2013).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+malaria+microscopy.+Part+I.+Learner's+Guide.">Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide.</a> World Health Organization. , (1991).</li><li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+monocyte-like+cell+line+THP-1+expresses+FcyRl+and+Fc'yRIl.">The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl.</a> Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).</li><li>Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+IgG+Fc+receptor+expression+induced+by+phorbol+12-myristate+13-acetate+treatment+of+THP-1+monocytic+leukemia+cells.">Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells.</a> Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+improved+phagocytosis+assay+to+evaluate+the+effect+of+HIV+on+specific+antibodies+to+pregnancy-associated+malaria.">Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria.</a> PloS One. 5 (5), 10807 (2010).</li></ol>

El protocolo presentado aquí ha sido descrito previamente y utilizado12,15,17,31 para medir la capacidad de los anticuerpos dirigidos a la superficie de P. falciparum IEs para inducir opsonización y fagocitosis por las células THP-1. Los resultados presentados aquí se centran en anticuerpos específicos de VAR2CSA adquiridos naturalmente en el plasma/suero de mujeres que viven en u...

La malaria es una enfermedad transmitida por vectores causada en humanos tras la infección con cinco especies diferentes del género Plasmodium. La especie más frecuente es P. falciparum,que también es responsable de la mayor morbilidad y mortalidad1. La presentación clínica del paludismo varía de infecciones asintomáticas o benignas a enfermedades complicadas/graves, esta última ocurre principalmente en niños menores de cinco años. La exposición a P. falciparum no induce inmunidad estéril, pero las personas que viven en zonas endémicas desarrollan lentamente inmunidad contra la enfermedad clínica. La protección depende de la edad/exposición y la inmunidad se adquiere normalmente durante los primeros 5-10 años de vida2. Las mujeres adultas son una excepción importante, ya que el paludismo grave puede ocurrir durante el embarazo en una presentación clínica conocida como malaria placentaria (PM). La PM es una causa importante de aborto, mortinato, parto prematuro, bajo peso al nacer, muerte fetal y anemia materna. La resistencia a la PM se desarrolla durante embarazos sucesivos3. La protección contra la PM se asocia con la adquisición de anticuerpos contra el sulfato de tipo VAR2CSA PfEMP14,5, un antígeno de superficie de eritrocitos infectados (IE) que se une al sulfato de condroitina A (CSA) que permite el secuestro de IE en la placenta. Los anticuerpos median la protección que realiza diversas actividades funcionales (revisadas en6,7) incluida la opsonización de las IE para inducir la fagocitosis. Los primeros estudios in vitro mostraron que los anticuerpos pueden limitar el crecimiento de P. falciparum en presencia de monocitos a través de la fagocitosis8,9. Estudios más recientes han demostrado que los niveles más altos de anticuerpos que inducen la fagocitosis se asocian con mejores resultados del embarazo (en el contexto de la coinfusión del VIH)10,11, lo que indica la relevancia de esta función efectora en la respuesta inmunitaria adquirida naturalmente.
Aquí presentamos un protocolo para medir esta función de los anticuerpos presentes en el plasma/suero humano, utilizando IE cultivado in vitro expresando VAR2CSA junto con la línea de monocitos THP-1. El ensayo se ha utilizado previamente11,12,13,14,15,16,17,18 y se considera un enfoque mejorado y más fácil en comparación con los protocolos basados en microscopio anterior8, ya que permite la prueba de un mayor número de muestras de anticuerpos en una sola ejecución utilizando volúmenes más pequeños de anticuerpos y evitando el recuento de microscopía tediosa y sesgada. A pesar de que el ensayo ha sido utilizado por múltiples laboratorios y su ejecución es lo suficientemente simple, requiere una planificación y preparación cuidadosas, por lo tanto, un protocolo detallado permitiría su aplicación por laboratorios e investigadores carentes de experiencia previa. Utilizamos, como ejemplo, las IE sincronizadas en etapas tardías que expresan VAR2CSA opsonizadas con anticuerpos presentes en suero recogidos de mujeres con inmunidad específica de PM adquirida naturalmente. Sin embargo, el protocolo se puede modificar fácilmente para evaluar la funcionalidad de los anticuerpos contra cualquier antígeno parásito presente en la superficie de IE, ya sea inducido por la exposición natural o por la vacunación.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well cell culture plates, round bottom with lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11021-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II (5%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Blood Cells antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34858</td>
			<td>Prepare 2&#65533;&#65533;l aliquots and freeze a -20&#176;C. Use one aliquot per experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC500 flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Heat inactivate before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555406 or 556618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD64</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowLogic software</td>
			<td>Inivai technologies</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS CS-column and accesories</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parasite culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50&#181;g/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vario MACS magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay

El protocolo describe cómo configurar y ejecutar un ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo de Plasmodium falciparum-infezocitos infectados (IEs) opsonizados por anticuerpos IgG adquiridos naturalmente específicos para VAR2CSA. Var2CSA es el antígeno parásito que media el secuestro selectivo de IEs en la placenta que puede causar una forma grave de malaria en mujeres embarazadas, llamada malaria placentaria (PM). La protección contra la PM está mediada por anticuerpos específicos de VAR2CSA que se cree que funcionan mediante la inhibición del secuestro de placenta y/o por opsonización de IEs para la fagocitosis. El ensayo emplea IEs sincronizadas en etapas tardías que han sido seleccionadas in vitro para expresar VAR2CSA, anticuerpos plasmáticos/suero de mujeres con inmunidad específica de PM adquirida naturalmente, y la línea de células fagocíticas THP-1. Sin embargo, el protocolo se puede modificar fácilmente para evaluar la funcionalidad de los anticuerpos contra cualquier antígeno parásito presente en la superficie de IE, ya sea inducido por la exposición natural o por la vacunación. El ensayo ofrece una evaluación sencilla y de alto rendimiento, con buena reproducibilidad, de un aspecto funcional importante de la inmunidad mediada por anticuerpos en el paludismo. Por lo tanto, es útil cuando se evalúa la inmunidad clínica al paludismo por P. falciparum, una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los trópicos, particularmente en el Africa subsahariana.

Aquí presentamos en detalle un protocolo que previamente ha sido descrito31 y utilizado11,12,13,14,15,16,17,18 para medir la capacidad de los anticuerpos dirigidos a la superficie de P. falciparum IE para inducir opsonizaci...

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Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

El objetivo general de este protocolo es proporcionar instrucciones sobre cómo medir la capacidad de los anticuerpos presentes en los sueros o plasma de individuos, expuestos naturalmente a la infección por Plasmodium falciparum, para opsonizar e inducir la fagocitosis de los eritrocitos infectados por parásitos (IE).

Medición de anticuerpos que inducen la fagocitosis adquirida naturalmente a los parásitos plasmodium falciparum mediante un ensayo basado en citometría de flujo

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Este protocolo permite medir la capacidad de los anticuerpos para opsonizar e inducir la fagocitosis de plasmodium falciparum infectado eritrocitos. Se pueden probar los anticuerpos presentes en el suero de individuos expuestos naturalmente a la infección por parásitos, así como los inducidos por la inmunización con antígenos parásitos. Demostrando el procedimiento conmigo estará Maiken Visti, un técnico de mi laboratorio.Para establecer un cultivo celular THP-1 para un ensayo de fagocitosis, el día antes del experimento sembraron las células en un matraz de cultivo cuadrado de 25 centímetros y una concentración de 2,5 veces 10 a las quintas células por mililitro en THP un medio de cultivo celular. El día del experimento, al menos una hora antes del experimento se bloquea a placas de 96 pozos de fondo con 150 microlitros de 2% FBS estériles en PBS por pozo. Para la cosecha y purificación de eritrocitos infectados por trofozoítos de mediados a finales de etapa, preparar alrededor de 1,2 mililitros de cultivo de parásitos P falciparum envasado en 10 mililitros de medio de cultivo de parásitos, con al menos 5% parasitemia y añadir a una columna magnética.Lavar la columna con 50 mililitros de medio de cultivo de parásitos. Para eluir a los eritrocitos infectados, retire la columna del imán y eléjela con 50 mililitros de medio de cultivo de parásitos. Luego, recoger los eritrocitos infectados por centrifugación y resuspend el pellet en un mililitro de medio de cultivo de parásitos frescos para el conteo.Ajustar la suspensión de eritrocitos infectada purificada 3,3 veces 10 veces a las séptimas células por mililitro en un medio de cultivo de parásitos que contenga bromuro de etidio, a una concentración final de 2,5 microgramos por mililitro. A continuación, retire la solución de bloqueo de una placa de 96 pozos moviendo la placa en un contenedor de residuos. A continuación, retire cualquier exceso sobre una toalla de papel y agregue 30 microlitros de la etiqueta de bromuro de etidio en suspensión de eritrocitos infectada a todos los pozos excepto a uno en la mitad superior de la placa.Añadir 30 microlitros de medio de cultivo de parásitos al pozo vacío, e incubar la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz. Al final de la incubación, añadir 170 microlitros de medio de cultivo de parásitos a cada pozo y sedimentar los eritrocitos infectados en la parte inferior de la placa por centrifugación. Retire el sobrenadante moviendo la placa en un recipiente de desecho, y lave los eritrocitos infectados con sello de bromuro de etidio dos veces más, con 200 microlitros de medio de cultivo de parásitos por bien, como acaba de demostrar.Después del segundo lavado, utilice una pipeta multicanal para eliminar cuidadosamente todo el volumen de sobrenadante de cada pozo, sin alterar los pellets. Y resuspender los eritrocitos infectados con sello de bromuro de etidio en 30 microlitros de solución de anticuerpos, incluidos los controles y muestras de prueba adecuados previamente preparados en un medio de cultivo de parásitos. A continuación, coloque la placa a 37 grados centígrados durante 45 minutos, protegida de la luz.Mientras que los eritrocitos infectados están siendo opsonizados, recoger las células THP-1 por centrifugación, y resuspender el pellet en 12 mililitros de medio de cultivo celular THP-1 fresco, precalentado. Después de una segunda centrifugación, resuspendir el pellet en un mililitro de medio de cultivo celular THP-1 para el recuento, y ajustar la concentración celular a cinco veces 10 a las quintas células por mililitro en el medio de cultivo celular THP-1. Retire la solución de bloqueo de la segunda placa de 96 pozos y agregue 100 microlitros de células THP-1 a cada pozo.A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación de opsonización, añadir 170 microlitros de medio de cultivo de parásitos a cada pozo de la placa de opsonización, y sedimentar los eritrocitos infectados en el fondo de la placa por centrifugación. Lavar los eritrocitos infectados opsonizados dos veces con 200 microlitros de medio de cultivo de parásitos por pozo, utilizando una pipeta multicanal para quitar cuidadosamente el sobrenadante después del segundo lavado.Resuspender los eritrocitos infectados opsonizados en 100 microlitros de medio de cultivo celular THP-1 precalentado por pozo, y transferir 50 microlitros de cada suspensión de eritrocitos infectado opsonizado a un pozo correspondiente en la placa de fagocitosis. Cuando se hayan añadido todas las células, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante no más de 40 minutos, protegida de la luz. Al final de la incubación, detener la fagocitosis por centrifugación a cuatro grados centígrados.Retire el sobrenadante y resuspendir los pellets con 150 microlitros de solución de colorante de cloruro de amonio a temperatura ambiente por pozo. Después de exactamente tres minutos, agregue 100 microlitros de hielo frío al 2%FBS en PBS para detener la lelisis, y sedimente las células intactas por centrifugación. A continuación, lavar las células tres veces con 200 microlitros de hielo fresco 2%FBS en PBS por pozo, por lavado.Después del lavado final, resuspender el pellet celular en 200 microlitros de hielo fresco 2%FBS en PBS por pozo. Para la adquisición y análisis de citometría de flujo, cargue inmediatamente las células en un citometro de flujo y utilice la gráfica de dispersión lineal hacia adelante frente a lado lineal para los pozos sin eritrocitos infectados para cercar las células THP-1. Adquiera 10.000 eventos en esta puerta y utilice las células THP-1 con los eritrocitos infectados opsonizados con un control positivo para configurar una gráfica de histograma para medir la intensidad de fluorescencia del bromuro de etidio.Para el análisis, abra la gráfica de dispersión lineal hacia delante frente frente a lado lineal para los pozos sin eritrocitos infectados, y puerta las células THP-1. Luego, configure una puerta positiva en un histograma FL-3 y copie estas puertas en todos los otros pozos de muestra para determinar el porcentaje de células THP-1 de bromuro de etidio positivo. Para cada muestra analizada, la fagocitosis puede notificarse como el valor absoluto o como la fagocitosis relativa calculada como un porcentaje utilizando el control positivo como máximo.Las células THP-1 deben ser revisadas periódicamente para la expresión de la superficie del receptor gamma FC por citometría de flujo. Las células deben ser negativas para CD16 y positivas para CD32 y CD64. En este experimento de opsonización, las células THP-1 fueron cerradas primero de acuerdo con sus perfiles de dispersión hacia adelante y lateral, para permitir la cuantificación del porcentaje de células etiquetadas con bromuro de etidio, indicativas de células que han fagocitotizado al menos un anticuerpo opsonizado eritrocitos infectados.Las muestras de control negativo deben generar un único pico negativo en el canal FL3, con pocos eventos observados en el marcador de bromuro de etidio. En consecuencia, los valores medios de fagocitosis, tanto como células THP-1 positivas absolutas de bromuro de etidio y como porcentajes relativos de fagocitosis, deben ser muy bajos. Por el contrario, el control positivo debe generar trazas con dos picos, un pico negativo y un pico claramente positivo y bien separado situado dentro del marcador de bromuro de etidio.Los valores medios de fagocitosis son normalmente más altos para el control positivo, seguidos por la piscina femenina expuesta al paludismo y los controles de una sola mujer expuesta al paludismo. Aunque esta metodología genera resultados consistentes, se han observado desviaciones en el coeficiente de pendiente de las líneas ajustadas. Por lo tanto, se recomienda el uso de valores relativos, especialmente si no es posible ejecutar todas las muestras en un solo experimento.Asegúrese de planificar cuidadosamente el experimento con una pureza superior al 80%Además, asegúrese de incluir siempre los controles adecuados, para permitir que se evalúe la calidad del experimento y facilitar el análisis de datos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Investigación

Inmunología e Infección

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

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Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infección modelo para estudiar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-VIH-1 en las interacciones humano primario de monocitos derivados de las células inmunitarias

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Un protocolo simple para el agrupamiento de plaquetas mediada por<em&gt; Plasmodium falciparum</emEritrocitos&gt; por el VIH en un recurso pobre ajuste

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

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Separación de los<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-eritrocitos infectados por medios magnéticos

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Alto Rendimiento Purificación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Los merozoitos Para uso en opsonizante Antibody Ensayos

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

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En la Evaluación in vivo de roedores Plasmodium parasitemia y Merozoite Invasión por Citometría de Flujo

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Métodos para investigar el papel de Regulación de pequeños ARN ribosomal y ocupación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...