Name: measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2020-08-06T16:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Maiken Visti tackas för utmärkt tekniskt bistånd. Detta arbete finansierades delvis genom ett bidrag (MAVARECA II; 17-02-KU) från Danmarks utrikesdepartement och administrerades av Danida Fellowship Centre. Finansiären hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller utarbetande av manuskriptet.

De humana serumprover som användes för de resultat som presenteras här samlades in i en separat studie19. Collection godkändes av Den institutionella granskningsnämnden för Noguchi Memorial Institute for Medical Research, University of Ghana (studie 038/10-11), och av de regionala forskningsetiska kommittéerna, Huvudstadsregionen i Danmark (protokoll H-4-2013-083).
1. Parasitkultur
OBS: Följ de lokala föreskrifterna för hantering av m...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Report+-+2018.">World Malaria Report - 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li><li>Pierce, S. K., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Day+2009:+What+malaria+knows+about+the+immune+system+that+immunologists+still+do+not.">World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not.</a> Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).</li><li>Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancy-associated+malaria:+Parasite+binding,+natural+immunity+and+vaccine+development.">Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development.</a> International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+surface+antigen-specific+IgG+and+protection+against+clinical+consequences+of+pregnancy-associated+Plasmodium+falciparum+malaria.">Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria.</a> Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+variant+surface+antigens+of+plasmodium+falciparum+-Infected+erythrocytes+are+associated+with+protection+from+treatment+failure+and+the+development+of+anemia+in+pregnancy.">Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).</li><li>Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Antibodies+and+Protection+against+Blood-stage+Malaria.">Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria.</a> Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).</li><li>Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+effector+functions+in+malaria+and+other+parasitic+diseases:+a+few+needles+and+many+haystacks.">Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks.</a> Immunology &amp; Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonic+activity+of+human+immune+serum+on+in+vitro+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+infected+red+blood+cells+by+monocytes.">Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes.</a> Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-Parasitized+Erythrocytes+by+Human+Polymorphonuclear+Leukocytes.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes.</a> The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).</li><li>Jaworowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+human+immunodeficiency+virus+type+1+coinfection,+anemia,+and+levels+and+function+of+antibodies+to+variant+surface+antigens+in+pregnancy-associated+malaria.">Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).</li><li>Ata&#237;de, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+induce+phagocytosis+of+malaria+infected+erythrocytes:+Effect+of+HIV+infection+and+correlation+with+clinical+outcomes.">Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes.</a> PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunisation+with+recombinant+PfEMP1+domains+elicits+functional+rosette-inhibiting+and+phagocytosis-inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum.">Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum.</a> PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+strain-transcending+antibodies+against+Group+A+PfEMP1+surface+antigens+from+virulent+malaria+parasites.">Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets+of+antibodies+against+erythrocytes+in+malaria+immunity.">Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).</li><li>Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+upon+immunization+with+a+recombinant+PfEMP1+NTS+DBL1&#945;+domain.">Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1&#945; domain.</a> Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+point+in+protein+trafficking+by+Plasmodium+falciparum+determines+the+expression+of+major+antigens+on+the+surface+of+infected+erythrocytes+targeted+by+human+antibodies.">A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).</li><li>Quintana, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+in+children+with+malaria+to+PfEMP1,+RIFIN+and+SURFIN+expressed+at+the+Plasmodium+falciparum+parasitized+red+blood+cell+surface.">Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).</li><li>Hommel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+antibody+functional+activity+and+strain-specificity+of+vaccine+candidates+for+malaria+in+pregnancy+using+in+vitro+phagocytosis+assays.">Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).</li><li>Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+responses+to+pregnancy-restricted+and+-unrestricted+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+membrane+protein+1+antigens+in+Ghanaian+women+naturally+exposed+to+malaria+parasites.">B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).</li><li>Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+to+serum+for+cultivation+of+Plasmodium+falciparum+in+vitro.">An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pregnancy-associated+malaria-specific+B+cells+target+polymorphic,+conformational+epitopes+in+VAR2CSA.">Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA.</a> Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+Plasmodium+falciparum+3D7+for+expression+of+variant+surface+antigens+associated+with+severe+malaria+in+African+children.">In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children.</a> Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).</li><li>Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PfEMP1-VAR2CSA+translation+by+a+Plasmodium+translation-enhancing+factor.">Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor.</a> Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+immunity+to+Plasmodium+falciparum+malaria+by+IgM+masking+of+protective+IgG+epitopes+in+infected+erythrocyte+surface-exposed+PfEMP1.">Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).</li><li>Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2013).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+malaria+microscopy.+Part+I.+Learner's+Guide.">Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide.</a> World Health Organization. , (1991).</li><li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+monocyte-like+cell+line+THP-1+expresses+FcyRl+and+Fc'yRIl.">The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl.</a> Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).</li><li>Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+IgG+Fc+receptor+expression+induced+by+phorbol+12-myristate+13-acetate+treatment+of+THP-1+monocytic+leukemia+cells.">Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells.</a> Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+improved+phagocytosis+assay+to+evaluate+the+effect+of+HIV+on+specific+antibodies+to+pregnancy-associated+malaria.">Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria.</a> PloS One. 5 (5), 10807 (2010).</li></ol>

Protokollet som presenteras här har tidigare beskrivits ochanvänts 12,15,17,31 för att mäta kapaciteten hos antikroppar som riktar sig mot ytan av P. falciparum IEs att inducera opsonization och fagocytos av THP-1 celler. De resultat som presenteras här fokusera på naturligt förvärvade VAR2CSA-specifika antikroppar i plasma/serum av kvinnor som lever i en P. falciparum...

Malaria är en vektorburen sjukdom som orsakas hos människor vid infektion med fem olika arter av släktet Plasmodium. Den mest förhärskande arten är P. falciparum, som också är ansvarig för den mest sjuklighet och dödlighet1. Malaria klinisk presentation varierar från asymtomatiska eller godartade infektioner till komplicerade/svår sjukdom, den senare förekommer mestadels hos barn under fem års ålder. Exponering för P. falciparum inducerar inte steril immunitet, men individer som lever i endemiska områden utvecklar långsamt immunitet mot den kliniska sjukdomen. Skydd är ålder/exponeringsberoende och immunitet förvärvas normalt under de första 5-10 åren i livet2. Vuxna kvinnor är ett viktigt undantag, som svår malaria kan uppstå under graviditeten i en klinisk presentation som kallas placenta malaria (PM). PM är en viktig orsak till abort, dödföddhet, för tidig leverans, låg födelsevikt, fosterdöd, och moderns anemi. Resistens mot PM utvecklas under på varandra följande graviditeter3. Skydd från PM är associerad med förvärv av antikroppar mot VAR2CSA-typ PfEMP14,5, en infekterad erytrocyt (IE) ytantigen som binder till kondroitinsulfat A (CSA) som möjliggör IE-kvarstad i moderkakan. Antikroppar medla skydd utför olika funktionella aktiviteter (ses överi 6,7) inklusive opsonization av IEs att inducera fagocytos. Tidiga in vitro-studier visade att antikroppar kan begränsa P. falciparumtillväxt i närvaro av monocyter via fagocytos8,9. Nyare studier har visat att högre nivåer av fagocytos-inducerande antikroppar är associerade med bättre graviditetsutfall (i samband med HIV-co-infektion)10,11, som anger relevansen av denna effektorfunktion i det naturligt förvärvade immunsvaret.
Här presenterar vi ett protokoll för att mäta denna funktion av antikroppar som finns i humant plasma/serum, med hjälp av in vitro odlade IEs uttrycker VAR2CSA tillsammans med monocyte linjen THP-1. Analysen har tidigare använts11,12,13,14,15,16,17,18 och anses vara en förbättrad och enklare metod jämfört med tidigare mikroskopbaserade protokoll8, eftersom det möjliggör testning av ett större antal antikroppsprover i en enda körning med mindre volymer av antikropp och undvika tråkiga och sneda mikroskopiräkning. Även om analysen har använts av flera laboratorier och dess utförande är enkelt nog, det kräver noggrann planering och förberedelser, därför skulle ett detaljerat protokoll tillåta dess tillämpning av laboratorier och forskare saknar tidigare erfarenhet. Vi använder, som ett exempel, sent stadium-synkroniserade IEs uttrycker VAR2CSA opsonized med antikroppar som finns i serum som samlats in från kvinnor med naturligt förvärvade PM-specifika immunitet. Protokollet kan dock lätt modifieras för att analysera funktionaliteten hos antikroppar mot någon parasitantigen som finns på IE-ytan, oavsett om den framkallas genom naturlig exponering eller genom vaccination.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well cell culture plates, round bottom with lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11021-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II (5%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Blood Cells antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34858</td>
			<td>Prepare 2&#65533;&#65533;l aliquots and freeze a -20&#176;C. Use one aliquot per experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC500 flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Heat inactivate before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555406 or 556618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD64</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowLogic software</td>
			<td>Inivai technologies</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS CS-column and accesories</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parasite culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50&#181;g/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vario MACS magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay

Protokollet beskriver hur man ställer in och kör ett flöde cytometry-baserade fagocytos analys av Plasmodium falciparum-infekterade erytrocyter (IEs) opsonized av naturligt förvärvade IgG antikroppar specifika för VAR2CSA. VAR2CSA är parasiten antigen som förmedlar selektiv kvarstad av IEs i moderkakan som kan orsaka en allvarlig form av malaria hos gravida kvinnor, kallas placenta malaria (PM). Skydd från PM medieras av VAR2CSA-specifika antikroppar som tros fungera genom att hämma placentabindning och/eller genom att opsonisera IEs för fagocytos. Analysen sysselsätter sent stadium-synkroniserade IEs som har valts in vitro för att uttrycka VAR2CSA, plasma/serum-antikroppar från kvinnor med naturligt förvärvade PM-specifika immunitet, och den fagocytic cellinje THP-1. Protokollet kan dock lätt modifieras för att analysera funktionaliteten hos antikroppar mot någon parasitantigen som finns på IE-ytan, oavsett om den framkallas genom naturlig exponering eller genom vaccination. Analysen erbjuder enkel och hög genomströmning utvärdering, med god reproducerbarhet, av en viktig funktionell aspekt av antikropp-medierad immunitet i malaria. Det är därför användbart vid utvärdering av klinisk immunitet mot P. falciparum malaria, en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet i tropikerna, särskilt i Afrika söder om Sahara.

Här presenterar vi i detalj ett protokoll som tidigare harbeskrivits 31 och används11,12,13,14,15,16,17,18 för att mäta kapaciteten hos antikroppar som riktar sig till ytan av P. falciparum IEs att inducera opsonization ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Det övergripande målet med detta protokoll är att ge instruktioner om hur man mäter kapaciteten hos antikroppar som finns i sera eller plasma av individer, naturligt utsatt för Plasmodium falciparum infektion, att opsonize och inducera fagocytos av parasitinfekterade erytrocyter (IEs).

Mätning Naturligt förvärvade Phagocytosis-inducerande antikroppar mot Plasmodium falciparum parasiter av en Flow Cytometry-baserade assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Detta protokoll gör det möjligt att mäta förmåga antikroppar att opsonize och inducera fagocytos av plasmodium falciparum infekterade erytrocyter. Antikroppar som finns i serum av individer som utsätts naturligt för parasitinfektion, liksom de som framkallas genom immunisering med parasitantigener, kan testas. Demonstrerar proceduren med mig blir Maiken Visti, en tekniker från mitt laboratorium.För att ställa in en THP-1 cell kultur för en fagocytos analys, dagen före experimentet utsäde cellerna i en 25-centimeters kvadratodling kolv och en koncentration av 2,5 gånger 10 till den femte celler per milliliter i THP en cell odling medium. På dagen för experimentet, minst en timme före experimentblocket till runda-botten 96-brunnsplattor med 150 mikroliter av sterila 2%FBS i PBS per brunn. För mitten till sent stadium trophozoite-infekterade erytrocyter skörd och rening, förbereda cirka 1,2 milliliter av packade P falciparum parasit kultur i 10 milliliter av parasit kultur medium, med minst 5%parasitemia och lägga till en magnetisk kolumn.Tvätta kolonnen med 50 milliliter av parasitkulturmedium. För att elera de infekterade erytrocyterna, ta bort kolonnen från magneten och spola den med 50 milliliter av parasitkulturmedium. Samla sedan de infekterade erytrocyterna genom centrifugering och resuspend pelleten i en milliliter av färskt parasitkulturmedium för räkning.Justera den renade infekterade erytrocytupphängningen med 3,3 gånger 10 till de sjunde cellerna per milliliter i parasitodlingsmedium som innehåller ethidiumbromid, till en slutkoncentration på 2,5 mikrogram per milliliter. Därefter tar du bort blockerande lösning från en 96-brunnsplatta genom att snärta fast plattan i en avfallsbehållare. Ta sedan bort eventuellt överskott över en pappershandduk och tillsätt 30 mikroliter av ethidiumbromid etiketten infekterade erytrocyt suspension till alla utom en brunn i den övre halvan av plattan.Tillsätt 30 mikroliter av parasitkulturmedium till den tomma brunnen, och inkubera plattan i 10 minuter vid rumstemperatur, skyddad från ljus. I slutet av inkubationen, tillsätt 170 mikroliter av parasitkulturmedium till varje brunn och sediment de infekterade erytrocyter längst ner på plattan genom centrifugeringen. Ta bort supernatanten genom att snärta in plattan i en avfallsbehållare och tvätta de ethidiumbromidmärkta infekterade erytrocyterna ytterligare två gånger, med 200 mikroliter av parasitkulturmedium per brunn, som precis visats.Efter den andra tvätten, använd en flerkanalspipett för att försiktigt ta bort hela volymen av supernatant från varje brunn, utan att störa pelletsen. Och resuspend ethidium bromid-märkt infekterade erytrocyter i 30 mikroliter av antikroppslösning, inklusive lämpliga kontroller och testprover som tidigare utarbetats i parasit kultur medium. Placera sedan plattan vid 37 grader Celsius i 45 minuter, skyddad från ljus.Medan de infekterade erytrocyter håller på att opsonized, samla THP-1 celler genom centrifugeringen, och återanvända pelleten i 12 milliliter av färska, förvuppvade THP-1 cell kultur medium. Efter en andra centrifugering, resuspend pelleten i en milliliter av THP-1 cell odling medium för räkning, och justera cellkoncentrationen till fem gånger 10 till den femte celler per milliliter i THP-1 cell odling medium. Ta bort blockeringslösningen från den andra 96-brunnsplattan och tillsätt 100 mikroliter THP-1-celler till varje brunn.Placera sedan plattan i cellkulturinkubatorn. I slutet av opsonisering inkubation, tillsätt 170 mikroliter av parasitkultur medium till varje brunn av opsonization plattan, och sediment de infekterade erytrocyter till botten av plattan genom centrifugeringen. Tvätta opsonized infekterade erytrocyter två gånger med 200 mikroliter av parasitkulturens medium per brunn, med hjälp av en flerkanalspipett för att försiktigt ta bort supernatanten efter den andra tvätten.Resuspend den opsonized infekterade erytrocyter i 100 microliters av förvuppvade THP-1 cell kultur medium per brunn, och överföra 50 microliters av varje opsonized infekterade erytrocyt suspension till en motsvarande väl i fagocytosis plattan. När alla celler har tillsatts, placera plattan i cellodlingen inkubatorn i högst 40 minuter, skyddad från ljus. Vid slutet av inkubationen, stoppa fagocytosen genom centrifugering vid fyra grader Celsius.Ta bort supernatanten och resuspend pelletsen med 150 mikroliter av rumstemperatur ammoniumkloridlysningslösning per brunn. Efter exakt tre minuter, tillsätt 100 mikroliter iskall vid 2%FBS i PBS för att stoppa lysen, och sediment de intakta cellerna genom centrifugeringen. Därefter tvätta cellerna tre gånger med 200 mikroliter av färsk iskall 2%FBS i PBS per brunn, per tvätt.Efter den slutliga tvätten, resuspend cell pelleten i 200 mikroliter av färsk iskall 2%FBS i PBS per brunn. För flödescytometri förvärv och analys, omedelbart ladda cellerna på ett flöde cytometer och använda den linjära framåt kontra linjära sidan scatter tomt för brunnarna utan infekterade erytrocyter att gate THP-1 celler. Förvärva 10, 000 händelser i denna gate, och använda THP-1 cellerna med de infekterade erytrocyter opsonized med en positiv kontroll för att inrätta en histogram tomt att mäta ethidium bromid fluorescens intensitet.För analys, öppna den linjära framåt kontra linjära sidan scatter tomt för brunnarna utan infekterade erytrocyter, och gate THP-1 celler. Ställ sedan in en positiv grind i ett FL-3-histogram och kopiera dessa portar på alla de andra provväldarna för att bestämma andelen ethidiumbromid-positiva THP-1-celler. För varje prov som testas kan fagocytos rapporteras som absolutvärde eller som den relativa fagocytos som beräknas som en procentsats med den positiva kontrollen som maximum.THP-1-cellerna bör kontrolleras med jämna mellanrum för FC gamma receptor yta uttryck genom flöde cytometri. Cellerna ska vara negativa för CD16, och positiva för CD32 och CD64. I detta opsonization experiment, var THP-1 cellerna gated först enligt deras framåt och sida scatter profiler, att tillåta kvantifiering av andelen ethidium bromid-märkta celler, vägledande för celler som har fagocytized minst en antikropp opsonized infekterade erytrocyt.De negativa kontrollproverna bör alla generera en enda negativ topp i FL3-kanalen, med få händelser som observerats i ethidiumbromidmarkören. Följaktligen bör medelvärdet av fagocytosvärdena, både som absoluta ethidiumbromid-positiva THP- 1-celler och som relativa fagocytosprocent, vara mycket låga. Den positiva kontrollen bör däremot generera spår med två toppar, en negativ topp och en klart positiv och välseparerad topp som ligger inom ethidiumbromidmarkören.Medelvärdet av fagocytosvärdena är normalt högst för den positiva kontrollen, följt av den malariaexponerade kvinnliga poolen och de enda malariaexponerade kvinnokontrollerna. Även om denna metod ger ett konsekvent resultat har avvikelser i de justerade linjernas lutningskoefficient observerats. Därför rekommenderas användning av relativa värden, särskilt om det inte är möjligt att köra alla prover i ett enda experiment.Var noga med att noggrant planera experimentet i förväg, förbereda både THP-1-cellerna och parasiterna därefter, med endast trofoocyter med en renhet som är större än 80%Dessutom, se till att alltid inkludera lämpliga kontroller, för att möjliggöra kvaliteten på experimentet som skall bedömas och underlätta dataanalys.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Val av Plasmodium falciparum Parasiter för Cytoadhesion till Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infektion modell för att studera<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions in Human primära monocyt-härledda Immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Ett enkelt protokoll för trombocyter-medierad klumpande av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infekterade erytrocyter i ett resurssvaga inställning

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Sent skede-infekterade erytrocyter genom magnetiska organ

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Rening av<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites för användning i opsoniserande Antibody analyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In vivo Bedömning av gnagare Plasmodium parasitemia och Merozoite Invasion av flödescytometri

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Metoder för att undersöka den reglerande roll små RNA och Ribosomalt Beläggning av<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flödescytometri-baserad analys för övervakning av NK cellfunktioner

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Bedöma Retinal mikrogliaceller fagocytos<em&gt; In Vivo</em&gt; Med hjälp av en flödescytometri-baserad analys

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Ett flöde flödescytometri-baserade cytotoxicitet analys för bedömning av människans NK cellsaktivitet

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...