Name: measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2020-08-06T16:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Maiken Visti mükemmel teknik yardım için teşekkür edilir. Bu çalışma kısmen Danimarka Dışişleri Bakanlığı'ndan bir hibe (MAVARECA II; 17-02-KU) tarafından finanse edilmiş ve Danida Burs Merkezi tarafından yönetilmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.

Burada sunulan sonuçlar için kullanılan insan serumu örnekleri ayrı bir çalışmada toplanmıştır19. Koleksiyon, Gana Üniversitesi Noguchi Memorial Institute for Medical Research Kurumsal İnceleme Kurulu (çalışma 038/10-11) ve Danimarka'nın Başkenti Bölgesel Araştırma Etik Komiteleri (H-4-2013-083 protokolü) tarafından onaylanmıştır.
1. Parazit kültürü
NOT: İnsan patojenlerinin kullanımı yla ilgili yerel yönetmelik...

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Report+-+2018.">World Malaria Report - 2018.</a> World Health Organization. , (2018).</li><li>Pierce, S. K., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Malaria+Day+2009:+What+malaria+knows+about+the+immune+system+that+immunologists+still+do+not.">World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not.</a> Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).</li><li>Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancy-associated+malaria:+Parasite+binding,+natural+immunity+and+vaccine+development.">Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development.</a> International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+surface+antigen-specific+IgG+and+protection+against+clinical+consequences+of+pregnancy-associated+Plasmodium+falciparum+malaria.">Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria.</a> Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+variant+surface+antigens+of+plasmodium+falciparum+-Infected+erythrocytes+are+associated+with+protection+from+treatment+failure+and+the+development+of+anemia+in+pregnancy.">Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).</li><li>Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Antibodies+and+Protection+against+Blood-stage+Malaria.">Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria.</a> Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).</li><li>Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+effector+functions+in+malaria+and+other+parasitic+diseases:+a+few+needles+and+many+haystacks.">Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks.</a> Immunology &amp; Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsonic+activity+of+human+immune+serum+on+in+vitro+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+infected+red+blood+cells+by+monocytes.">Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes.</a> Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).</li><li>Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-Parasitized+Erythrocytes+by+Human+Polymorphonuclear+Leukocytes.">Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes.</a> The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).</li><li>Jaworowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+human+immunodeficiency+virus+type+1+coinfection,+anemia,+and+levels+and+function+of+antibodies+to+variant+surface+antigens+in+pregnancy-associated+malaria.">Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).</li><li>Ata&#237;de, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+that+induce+phagocytosis+of+malaria+infected+erythrocytes:+Effect+of+HIV+infection+and+correlation+with+clinical+outcomes.">Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes.</a> PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunisation+with+recombinant+PfEMP1+domains+elicits+functional+rosette-inhibiting+and+phagocytosis-inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum.">Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum.</a> PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).</li><li>Ghumra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+strain-transcending+antibodies+against+Group+A+PfEMP1+surface+antigens+from+virulent+malaria+parasites.">Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets+of+antibodies+against+erythrocytes+in+malaria+immunity.">Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).</li><li>Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+inducing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+upon+immunization+with+a+recombinant+PfEMP1+NTS+DBL1&#945;+domain.">Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1&#945; domain.</a> Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).</li><li>Chan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+point+in+protein+trafficking+by+Plasmodium+falciparum+determines+the+expression+of+major+antigens+on+the+surface+of+infected+erythrocytes+targeted+by+human+antibodies.">A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).</li><li>Quintana, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+in+children+with+malaria+to+PfEMP1,+RIFIN+and+SURFIN+expressed+at+the+Plasmodium+falciparum+parasitized+red+blood+cell+surface.">Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).</li><li>Hommel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+antibody+functional+activity+and+strain-specificity+of+vaccine+candidates+for+malaria+in+pregnancy+using+in+vitro+phagocytosis+assays.">Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays.</a> Parasites &amp; Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).</li><li>Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+responses+to+pregnancy-restricted+and+-unrestricted+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+membrane+protein+1+antigens+in+Ghanaian+women+naturally+exposed+to+malaria+parasites.">B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites.</a> Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).</li><li>Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+to+serum+for+cultivation+of+Plasmodium+falciparum+in+vitro.">An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pregnancy-associated+malaria-specific+B+cells+target+polymorphic,+conformational+epitopes+in+VAR2CSA.">Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA.</a> Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).</li><li>Staalsoe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+Plasmodium+falciparum+3D7+for+expression+of+variant+surface+antigens+associated+with+severe+malaria+in+African+children.">In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children.</a> Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).</li><li>Chan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+PfEMP1-VAR2CSA+translation+by+a+Plasmodium+translation-enhancing+factor.">Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor.</a> Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).</li><li>Barfod, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+immunity+to+Plasmodium+falciparum+malaria+by+IgM+masking+of+protective+IgG+epitopes+in+infected+erythrocyte+surface-exposed+PfEMP1.">Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).</li><li>Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Malaria Research. , (2013).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+malaria+microscopy.+Part+I.+Learner's+Guide.">Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide.</a> World Health Organization. , (1991).</li><li>Tsuchiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+monocyte-like+cell+line+THP-1+expresses+FcyRl+and+Fc'yRIl.">The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl.</a> Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).</li><li>Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+IgG+Fc+receptor+expression+induced+by+phorbol+12-myristate+13-acetate+treatment+of+THP-1+monocytic+leukemia+cells.">Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells.</a> Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).</li><li>Ata&#237;de, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+improved+phagocytosis+assay+to+evaluate+the+effect+of+HIV+on+specific+antibodies+to+pregnancy-associated+malaria.">Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria.</a> PloS One. 5 (5), 10807 (2010).</li></ol>

Burada sunulan protokol daha önce tanımlanmış ve thp-1 hücreleri tarafından opsonizasyon ve fagositoz indüklemek için P. falciparum IEs yüzeyini hedefleyen antikorların kapasitesini ölçmek için12,15,17,31 kullanılmıştır. Burada sunulan sonuçlar, P. falciparum endemik bölgede yaşayan kadınların plazma/serumunda doğal olarak edinilmiş VAR2CSA spesifik ant...

Sıtma, Plasmodiumcinsinin beş farklı türüyle enfeksiyon anına bağlı olarak insanlarda meydana gelen vektör kaynaklı bir hastalıktır. En yaygın türler P. falciparum, aynı zamanda en morbidite ve mortalite sorumludur1. Sıtma klinik sunumu asemptomatik veya benign enfeksiyonlardan komplike/ağır hastalıklara kadar değişmekteolup, ikincisi çoğunlukla beş yaşın altındaki çocuklarda görülür. P. falciparum maruz steril bağışıklık neden olmaz, ancak endemik bölgelerde yaşayan bireyler yavaş yavaş klinik hastalığa karşı bağışıklık geliştirmek. Koruma yaşa/maruziyete bağlıdır ve bağışıklık normalde yaşamın ilk 5-10 döneminde elde edilir2. Plasental sıtma (PM) olarak bilinen klinik bir sunumda gebelik sırasında şiddetli sıtma meydana gelebileceğinden yetişkin kadınlar önemli bir istisnadır. PM kürtaj, ölü doğum, erken doğum, düşük doğum ağırlığı, fetal ölüm ve maternal anemi önemli bir nedenidir. PM direnci art arda gebelikler üzerinde gelişir3. PM'den korunma, plasentada IE sekestrasyonu sağlayan4,5kondroitin sülfat A 'ya (CSA) bağlanan enfekte eritrosit (IE) yüzey antijenine karşı antikor ların elde edilmesiyle ilişkilidir. Antikorlar çeşitli fonksiyonel faaliyetler gerçekleştiren koruma aracılık(6,,7)Fagositagozis indüklemek için IEs opsonizasyonu da dahil olmak üzere. Erken in vitro çalışmalar antikorların fagositozyoluylamonosit varlığında P. falciparum büyümesini sınırlayabilir gösterdi 8,9. Daha yeni çalışmalar fagositoz indükleyen antikorların daha yüksek düzeyde daha iyi gebelik sonuçları ile ilişkili olduğunu göstermiştir (HIV co-enfeksiyon bağlamında)10,11, doğal olarak elde edilen bağışıklık yanıtı bu efektör fonksiyonun alaka gösteren.
Burada insan plazmasında/serumunda bulunan antikorların bu işlevini ölçmek için, VAR2CSA'yı teksit hattı THP-1 ile birlikte in vitro kültürlü IE'ler kullanarak bir protokol saklıyız. Titredaha önce kullanılmıştır11,12,13,14,15,16,17,,18 ve daha önceki mikroskop tabanlı protokollere göre geliştirilmiş ve daha kolay bir yaklaşım olarak kabul edilir8, antikor daha küçük hacimlerde kullanarak tek bir çalışmaantikor örneklerinin daha büyük sayıda test sağlar ve sıkıcı ve önyargılı mikroskop sayma kaçınarak beri. Tayın birden fazla laboratuvar tarafından kullanılmasına ve yürütülmesi yeterince basit olmasına rağmen, dikkatli bir planlama ve hazırlık gerektirir, bu nedenle ayrıntılı bir protokol laboratuvarlar ve araştırmacılar tarafından daha önce deneyimi olmayan uygulamalara izin verir. Örnek olarak, doğal olarak elde edilen PM'ye özgü bağışıklığı olan kadınlardan toplanan serumda bulunan antikorlarla opsonize edilmiş VAR2CSA'yı ifade eden geç evre senkronize edilmiş IE'leri kullanıyoruz. Ancak protokol, ister doğal maruzkalma ister aşılama ile indüklenen, IE yüzeyinde bulunan herhangi bir parazit antijenine antikorların işlevselliğini test etmek için kolayca değiştirilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well cell culture plates, round bottom with lid</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11021-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlbuMAX-II (5%)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Blood Cells antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34858</td>
			<td>Prepare 2&#65533;&#65533;l aliquots and freeze a -20&#176;C. Use one aliquot per experiment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1510</td>
			<td>Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC500 flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099-141</td>
			<td>Heat inactivate before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD16</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555406 or 556618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD32</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC mouse anti-human CD64</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowLogic software</td>
			<td>Inivai technologies</td>
			<td></td>
			<td>Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin (10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxanthine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS CS-column and accesories</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parasite culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50&#181;g/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 culture medium</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vario MACS magnet</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring naturally acquired phagocytosis-inducing antibodies to plasmodium falciparum parasites by a flow cytometry-based assay

Protokol, VAR2CSA'ya özgü doğal olarak edinilmiş IgG antikorları tarafından opsonize edilen Plasmodium falciparumenfekte eritrositlerin (IEs) akış sitometri tabanlı fagositoz testinin nasıl kurulup çalıştırılabildiğini açıklamaktadır. VAR2CSA, plasentadaki IE'lerin seçici sekansasyonuna aracılık eden ve plasental sıtma (PM) adı verilen hamile kadınlarda ciddi bir sıtma formuna neden olabilecek parazit antijenidir. PM'den korunma, plasental sekestrasyonu inhibe ederek ve/veya fagositoz için IE'leri opsonize ederek çalıştığına inanılan VAR2CSA spesifik antikorlar aracılık eder. Taht, VAR2CSA'yı ifade etmek için in vitro olarak seçilen geç evre senkronize IE'ler, doğal olarak edinilmiş PM spesifik bağışıklığı olan kadınlardan plazma/serum-antikorları ve fagositik hücre hattı THP-1'i kullanır. Ancak protokol, ister doğal maruzkalma ister aşılama ile indüklenen, IE yüzeyinde bulunan herhangi bir parazit antijenine antikorların işlevselliğini test etmek için kolayca değiştirilebilir. Titre, sıtmada antikor aracılı bağışıklığın önemli bir fonksiyonel yönünüiyi tekrarlanabilirlik ile basit ve yüksek iş letimatisi değerlendirme sunar. Bu nedenle, özellikle Sahra-altı Afrika'da, tropik bölgelerde morbidite ve mortalitenin önemli bir nedeni olan P. falciparum sıtmasına karşı klinik bağışıklığı değerlendirirken yararlıdır.

Burada ayrıntılı olarak31 tarif edilmiş ve kullanılan bir protokol sunmak11,12,13,14,15,16,17,18 THP-1 hücreleri tarafından opsonizasyon ve fagosityolis indüklemek için P. falciparum IEs yüzeyini hedefleyen antikor...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay at JoVE.com

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Bu protokolün genel amacı, plasmodium falciparum enfeksiyonuna doğal olarak maruz kalan bireylerin sera veya plazmasında bulunan antikorların kapasitesinin nasıl ölçüleceklerine, parazit enfekte eritrositlerin (IEs) fagositozunu opsonize etmek ve indüklemek tir.

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Bu protokol, plazmodium falciparum enfekte eritrositlerin fagositozunun opsonize edilip indükleme yeteneğini ölçmeye olanak sağlar. Doğal olarak parazit enfeksiyonuna maruz kalan bireylerin serumunda bulunan antikorlar ve parazit antijenleri ile bağışıklama ile indüklenenler test edilebilir. Prosedürü benimle göstermek Maiken Visti olacak, laboratuvarımdan bir teknisyen.Bir fagositoz analizi için bir THP-1 hücre kültürü kurmak için, deneme den bir gün önce 25 santimetre kare kültür şişesi ve 2.5 kat 10 thp bir hücre kültürü orta mililitre başına beşinci hücrelere bir konsantrasyon hücreleri tohum. Deney günü, deney bloğundan en az bir saat önce, 150 mikrolitre steril 2%FBS'lik, 96 kuyulu plakaların en altına, her kuyuda PBS'de. Orta-geç evre trophozoit-enfekte eritrositler hasat ve arınma için, parazit kültür orta 10 mililitre paketlenmiş P falciparum parazit kültürü yaklaşık 1.2 mililitre hazırlamak, en az% 5 paraziti ile ve manyetik bir sütun eklemek.50 mililitre parazit kültür ortamı ile sütunu yıkayın. Enfekte eritrositleri uzaklaştırmak için, kolonmıknatıstan çıkarın ve 50 mililitre parazit kültür ortamıyla yıkayın. Sonra, santrifüj ile enfekte eritrosittoplamak ve sayma için taze parazit kültür ortamı bir mililitre pelet resuspend.Saflaştırılmış enfekte eritrosit süspansiyonuna 3,3 kat 10 ile ethidyum bromür içeren parazit kültür ortamında mililitre başına yedinci hücrelere, mililitre başına 2,5 mikrogramlık son konsantrasyona ayarlayın. Ardından, plakayı bir atık kabına vurarak bloklama çözümlerini 96 kuyulu bir plakadan çıkarın. Sonra bir kağıt havlu üzerinde herhangi bir fazlalık çıkarın ve ethidium bromür etiketi enfekte eritrosit süspansiyon 30 mikrolitre ekleyin ama bir iyi plakanın üst yarısında.Boş kuyuya 30 mikrolitre parazit kültür ortamı ekleyin ve odayı ışıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, her kuyuya 170 mikrolitre parazit kültür ortamı ekleyin ve enfekte eritrositleri santrifüj le plakanın altına çökün. Bir atık konteyner içine plaka flicking tarafından supernatant çıkarın ve ethidium bromür etiketli enfekte eritrositler iki kez daha yıkayın, iyi başına parazit kültür orta 200 mikrolitre ile, sadece gösterildiği gibi.İkinci yıkamadan sonra, peletleri rahatsız etmeden, her kuyudaki süpernatantın tüm hacmini dikkatlice çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Ve daha önce parazit kültür ortamında hazırlanan uygun kontroller ve test örnekleri de dahil olmak üzere 30 mikrolitre antikor çözeltisi içinde ethidium bromür etiketli enfekte eritrositleri yeniden askıya alın. Daha sonra, ışıktan korunan, 45 dakika boyunca 37 derece santigrat plaka yerleştirin.Enfekte eritrositler opsonized edilirken, santrifüj tarafından THP-1 hücreleri toplamak, ve taze 12 mililitre pelet resuspend, önceden ısıtılmış THP-1 hücre kültürü ortamı. İkinci bir santrifüjden sonra, sayım için THP-1 hücre kültür ortamının bir mililitresinde peleti yeniden askıya alın ve hücre konsantrasyonunu THP-1 hücre kültürü ortamındaki mililitre başına beşinci hücrelere beş katına 10'a ayarlayın. Engelleme çözeltisini ikinci 96 kuyuplakasından çıkarın ve her kuyuya 100 mikrolitre THP-1 hücresi ekleyin.Sonra, hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Opsonizasyon kuluçka sonunda, opsonizasyon plaka her kuyuya parazit kültür orta 170 mikrolitre ekleyin ve santrifüj ile plaka nın altına enfekte eritrositler tortu. Opsonize enfekte eritrositleri her kuyuda 200 mikrolitre parazit kültür ortamı ile iki kez yıkayın, ikinci yıkamadan sonra süpernatantı dikkatlice çıkarmak için çok kanallı pipet kullanın.Her kuyuda önceden ısıtılmış THP-1 hücre kültürü ortamının 100 mikrolitresinde opsonize edilmiş enfekte eritrositleri yeniden askıya alın ve her opsonize edilmiş enfekte eritrosit süspansiyonunun 50 mikrolitresini fagositoz plakasındaki bir kuyuya aktarın. Tüm hücreler eklendiğinde, plakayı ışıktan korunan en fazla 40 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Kuluçka sonunda, fagositoz'u dört santigrat derecede santrifüjle durdurun.Supernatant çıkarın ve iyi başına oda sıcaklığında amonyum klorür lysing çözeltisi 150 mikrolitre ile pelet resuspend. Tam üç dakika sonra, lysis durdurmak için PBS% 2 FBS buz soğuk 100 mikrolitre ekleyin ve santrifüj ile bozulmamış hücreleri tortu. Daha sonra, temiz başına PBS taze buz soğuk 200 mikrolitre ile hücreleri üç kez yıkayın, yıkama başına.Son yıkamadan sonra, iyi başına PBS taze buz soğuk% 2 FBS 200 mikrolitre hücre pelet resuspend. Akış sitometrisi alımı ve analizi için, hücreleri hemen bir akış sitometresine yükleyin ve thp-1 hücrelerini kapamak için enfekte eritrositler olmadan kuyular için doğrusal ileri ve doğrusal yan dağılım çizimini kullanın. Bu kapıda 10.000 olay edinin ve ethidium bromür floresans yoğunluğunu ölçmek için bir histogram komplokurmak için pozitif kontrol ile opsonized enfekte eritrositler ile THP-1 hücreleri kullanın.Analiz için, enfekte eritrositler olmadan kuyular için doğrusal ileri karşı doğrusal yan dağılım çizimini açın ve THP-1 hücrelerini açın. Daha sonra, bir FL-3 histogram ı pozitif bir kapı ayarlayın ve ethidyum bromür-pozitif THP-1 hücrelerinin yüzdesini belirlemek için diğer örnek kuyuların üzerine bu kapıları kopyalayın. Test edilen her örnek için fagositoz mutlak değer olarak veya pozitif kontrolü maksimum olarak kullanarak yüzde olarak hesaplanan göreli fagositoz olarak rapor edilebilir.THP-1 hücreleri akış sitometrisi ile FC gama reseptör yüzey ekspresyonu için periyodik olarak kontrol edilmelidir. Hücreler CD16 için negatif, CD32 ve CD64 pozitif olmalıdır. Bu opsonizasyon deneyinde, THP-1 hücreleri ilk olarak ileri ve yan dağılım profillerine göre, ethidyum bromür etiketli hücrelerin yüzdesinin ölçülmesine izin vermek için, en az bir antikor enfekte eritrosit ezili mezhebine göre fagositize edilmiş hücrelerin göstergesi olarak geçitlendi.Negatif kontrol örneklerinin tümü FL3 kanalında tek bir negatif tepe oluşturmalıdır ve ethidyum bromür belirtecinde çok az olay gözlenmiştir. Buna göre, mutlak ethidyum bromür-pozitif THP-1 hücreleri ve göreceli fagositon yüzdesi olarak ortalama fagositoz değerleri çok düşük olmalıdır. Buna karşılık, pozitif kontrol iki tepe, negatif bir tepe ve açıkça pozitif ve iyi ayrılmış tepe ethidyum bromür belirteci içinde bulunan izleri oluşturmalıdır.Ortalama fagositoz değerleri normalde pozitif kontrol için en yüksek, sıtmaya maruz kalan kadın havuzu ve sıtmaya maruz kalan tek kadın kontrolleri takip. Bu metodoloji tutarlı sonuçlar üretse de, ayarlanan çizgilerin eğim katsayısında sapmalar gözlenmiştir. Bu nedenle, özellikle tüm örnekleri tek bir denemede çalıştırmak mümkün değilse, göreli değerlerin kullanılması önerilir.Deneyi önceden dikkatlice planladığından, hem THP-1 hücrelerini hem de parazitleri buna göre hazırladığından, sadece %80'den fazla saflığa sahip tropositler kullandığınızdan emin olun Ayrıca, deneyin kalitesinin değerlendirilmesine ve veri analizini kolaylaştırabilmek için her zaman uygun kontrolleri dahil etmeye hazır olun.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü<em&gt; Plasmodium falciparum</emBir kaynak Poor Setting&gt; ile enfekte Eritrosit

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Ayrılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emManyetik Yoluyla&gt; Geç Evre-enfekte Eritrositler

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

Akış Cytometry tarafından Kemirgen Plasmodium parazitemi Vivo Değerlendirilmesi ve Merozoit Invasion

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...