Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

وقد دعمت هذه الدراسة من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) المنح في المعونة للبحث العلمي 17H05661 و 18K19903 ، Core-2- الأساسية ، و ما وراء معهد الذكاء الاصطناعي.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

في جزء من هذا البروتوكول، تم ترخيص براءة اختراع لشركة Jiksak للهندسة الحيوية، Inc. التي أسسها جيرو كاوادا.

يصف هذا البروتوكول تشكيل الجهاز العضوي العصبي الحركي (MNO) الذي يحتوي على حزمة محور عصبي ممتدة من الخلايا العصبية الحركية التي تم إنشاؤها من خلايا iPS البشرية. حزمة محور عصبي شكلت سميكة، مرنة، ومنظمة تنظيما جيدا في هياكل أحادي الاتجاه. عن طريق تشريح حزمة محور عصبي، يمكن الحصول على البروتين المحوري عالية النقاوة والرنا بما فيه الكفاية للتحليلات الكيميائية الحيوية. يمكن قياس نشاط الخلايا العصبية في حزم المحاور وspheroids مع تصوير الكالسيوم. لم يتم اكتشاف تلوث البروتينات النووية والتشعبية في lysate محور عصبي من قبل النشاف الغربي ، مما يدل على أن طريقتنا فصل المحاور بكفاءة من أجسام الخلايا والتشعبات.
واحدة من مزايا هذا البروتوكول هو التمايز السريع وتوليد MNO مجهزة حزمة محور عصبي، والتي يمكن أن يتم كل العمليات في 4 أسابيع مع بروتوكول 3D و 5-6 أسابيع باستخدام بروتوكول 2D. هذا هو قصيرة بالمقارنة مع بروتوكولات أخرى والتي عادة ما يستغرق 3-4 أسابيع لمجرد التفريق في MN من الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا iPS17 ويستغرق إضافية 2-4 أسابيع للحصول على استطالة محور عصبي. ويفضل البروتوكول ثلاثي الأبعاد عموماً على البروتوكول الثاني الأبعاد بسبب قصر وقت التمايز، والخطوات الأقل، وتقليل المخاطر التقنية دون خطوة الانفصام مقارنة بالبروتوكول الثاني. تم تصميم رقاقة زراعة الأنسجة القائمة على microfluidic بطريقة بحيث يمكن لمحور عصبي MNS الإطالة نحو المقصورة الأخرى من خلال القناة الدقيقة ، مما يسهل تشكيل حزمة من المحاور عن طريق تحفيز التفاعلات المحورية والتقارب بين المحاور. بسبب مجموعة تجريبية بسيطة، وجميع البروتوكولات المذكورة هنا لا يمكن أن يؤديها فقط من قبل الهندسة الحيوية، الذين هم على دراية التلاعب من رقاقة ثقافة الأنسجة، ولكن أيضا علماء الأحياء وعلماء الأعصاب الذين ليسوا على دراية microfluidics وتقنيات microfabrication. وتجدر الإشارة إلى أن الخطوات 1 و 2 يمكن أيضا أن تنفذ باستخدام خدمة تصنيع خارجي.
إحدى الخطوات الهامة لإنجاز البروتوكول هو تغيير تسلسلي من الوسيطة الثقافة. ينصح بتغيير الوسط الثقافي بشكل كامل في كل خطوة أثناء التمايز بحيث لا تخل العوامل في الوسط المستهلك بتمايز MN. نقطة أخرى هامة من هذا البروتوكول هو الحفاظ على خلايا iPS غير متمايزة في نوعية جيدة. جودة ثقافة خلية iPS الأولية تؤثر بشكل كبير على كفاءة الحصول على الخلايا العصبية الحركية و MNO. نقطة أخرى هي أن قطر MNS يجب أن يكون أصغر من حجم ثقب الرقاقة (1.5 ملم). لا يمكن أن يدخل الزفير الكبير الغرفة ، ويحتمل أن تواجه نخر نقص الأكسجة الشديد في الجزء الأوسط. يمكن التحكم في حجم MNSs عن طريق تغيير عدد البذر الأولي من خلايا iPS (في بروتوكول 3D) أو الخلايا العصبية الحركية (في بروتوكول 2D). يجب تحسين كثافة البذر من الخلايا لكل خط خلية iPS.
وقد استخدمت على نطاق واسع أجهزة microfluidic مجزأة مع microgrooves ومرشحات المسام الصغيرة لفصل المحاور من الهيئات الخلوية dendrites. ويمكن لهذه التقنية أيضا فصل محاور من الأجسام الخلوية وdendrite، مع وفرة متفوقة من المحاور في الأنسجة المجمعة. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى ، أحد القيود الرئيسية لهذه الطريقة هو أنه لا يمكن فصل اثنين من وسائل الإعلام ثقافة مختلفة في التصميم الحالي لرقاقة ثقافة الأنسجة ، مما يعوق القدرة على الثقافة المشتركة من خليتين مختلفتين تتطلب اثنين من وسائل الإعلام المتميزة. وثمة قيد آخر هو أن رقاقة PDMS وضع قيود محددة سلفا على حجم الأنسجة. لا يمكن أن يدخل الزفير أكبر من الثقب الغرفة ، ولا يمكن أن تنمو حزمة محور عصبي أكثر سمكًا من عرض قناة microfluidic.
يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع أخرى من الخلايا العصبية. وقد أظهرت مجموعتنا القدرة على نموذج الجهاز الدماغي باستخدام طريقة معدلة جنبا إلى جنب مع تقنيات organoid الدماغية18. تم إدخال كرويات القشرية في كل من المقصورات والمحاور الممدود تلقائياً نحو كل كروية، وبعد ذلك حزمة محور عصبي شكلت تلقائياً. ونتيجة لذلك، يمكن توصيل اثنين من كرويات القشرية من خلال حزمة محور عصبي، ويمكن الحصول على الأنسجة كقطعة واحدة. وهذا يدل على أن النهج هو تنوعا للغاية لتشكيل أنسجة حزمة محور عصبي بغض النظر عن أنواع الخلايا العصبية. في هذا البروتوكول، تم استخدام الخلايا iPS البشرية، ومع ذلك، يمكن استخدام الخلايا الجذعية الأخرى بما في ذلك الخلايا ES البشرية والخلايا الجذعية العصبية البشرية مع تعديلات على البروتوكول المقدم. يمكن توليد 3D spheroids من الخلايا العصبية من بروتوكولات متنوعة19,20. هذه الطريقة لصنع الأنسجة مع حزمة محور عصبي يمكن أن يكون من المحتمل أن تكون مجتمعة في المستقبل مع بروتوكولات التمايز الأخرى لصنع 3D MN spheroid. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التحكم في سمك وطول حزمة محور عصبي ببساطة عن طريق تغيير عرض وارتفاع microchannels من رقاقة ثقافة الأنسجة للتطورات المستقبلية.
ونعتقد أن هذا البروتوكول يمكن استخدامه لاختبار المخدرات وفحصها ويمكن أن يسهم في فهم الآليات التي تقوم عليها عملية تطوير والأمراض في إطار إطار منابع المحاور.

الخلايا العصبية الحركية الشوكية (MN) توسيع محاورها إلى عضلات الهيكل العظمي للسيطرة على حركة الجسم. ومساراتها المحورية منظمة ومنظمة تنظيماً عالياً في العملية الإنمائية. على الرغم من العديد من الدراسات على تمديد محور عصبي والتوجيه1، لا تزال آليات تشكيل حزمة محور عصبي منظمة قيد التحقيق. غالبًا ما تتضرر أكسونات الخلايا العصبية الحركية بسبب الأمراض العصبية التنكسية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS)2، ولكن الآليات الفسيولوجية للأمراض المرضية للضرر على كراسات المحاور غير مفهومة بشكل جيد. وهكذا ، هناك حاجة إلى نموذج فسيولوجي والمرضي لتكخيم تشكيل حزمة المحاور والتراجع في هذا المجال.
الخلايا العصبية الحركية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية هي منصة واعدة لفهم التنمية والأمراض مثل ALS3. يمكن استخدام الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان (خلايا iPS) في نمذجة الأمراض باستخدام الخلايا المشتقة من المريض. حتى الآن، تم الإبلاغ عن طرق مختلفة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى MN4و5و6. ومع ذلك، محاور عصبية في ثقافة ثنائية الأبعاد موجهة بشكل عشوائي ولا تتكخي في بيئة حيوية في داخل الأعصاب النامية التي يتم تجميعها محاور عصبية أحادية من خلال التفاعلات المحورية الكثيفة7. للتغلب على هذه المسألة، قمنا بتطوير تقنية لتوليد نسيج ثلاثي الأبعاد يشبه العصب الحركي من خلايا iPSالبشرية 8، وسمى الأنسجة كعضوي العصب الحركي (MNO). و MNO يتكون من خلايا الهيئات الموجودة في الخلايا العصبية الحركية spheroid (MNS) وملوسمية محور عصبي تمتد من spheroid. المحاور في الكروسة موجهة نحو اتجاه أحادي الاتجاه ، والتي تشبه المحاور في تطوير الأعصاب الحركية. ومن ثم، توفر MNOs بيئة مجهرية فيزيولوجية فريدة، وهو ما لم يتم من قبل أي أساليب أخرى لثقافة الخلايا العصبية تم تطويرها سابقًا.
في هذا البروتوكول، ونحن وصف أساليب لرقائق زراعة الأنسجة تلفيق، وتمايز الخلايا العصبية الحركية السريعة، وتشكيل الجهاز العصبية الحركية في رقائق المتقدمة. لدينا رقاقة ثقافة الأنسجة بسيطة جدا، وأنه يحتوي على مقصورة فقط لقبول spheroid، وميكنانيل لتشكيل حزمة محور عصبي، ومقصورة لمحطات محور عصبي الإسكان. لا يحتوي الجهاز على هياكل معقدة بما في ذلك ميكروغروف أو مرشحات micropore التي غالباً ما تستخدم لفصل المحاور والهيئات الخلية من الحجم9،10. ومن ثم أجهزتنا يمكن أن تكون ملفقة بسهولة باتباع الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول إذا كان إعداد التصوير الضوئي متاحًا.
يتم تحقيق التمايز السريع من خلايا iPS البشرية مع مزيج الأمثل من عوامل الحث والنقش (SB431542، LDN-193189، حمض الريتينويك (RA)، والمجانى الممهدة (SAG)) وعوامل التسارع (SU5402 وDAPT). وقد أفيد أن الجمع بين SU5402 وDAPT يسرع تمايز الخلايا العصبية الطرفية والخلايا العصبية11. في هذا البروتوكول، نقدم ثلاث طرق مختلفة لتوليد MNOs، بحيث يمكن للقراء أن يقرروا طريقة أكثر ملاءمة لاحتياجاتهم. نوصي بإجراء تمايز خلايا iPS البشرية بعد تشكيل spheroid (طريقة 3D) ، حيث يمكن نقل MNS المتمايزة مباشرة إلى شريحة ثقافة الأنسجة. بدلا من ذلك، يمكن تمييز الخلايا iPS الإنسان في الخلايا العصبية الحركية في ثقافة monolayer (2D)، ومن ثم خلق في الخلايا العصبية الحركية ثلاثية الأبعاد spheroids كما أبلغنا سابقا8. لقد قمنا بتحديث البروتوكول، ومع طريقة التمايز ثلاثي الأبعاد الموصوفة في هذا البروتوكول، يمكن تجنب الانتقال من ثنائية الأبعاد إلى ثلاثية الأبعاد ويمكن الحصول على MNOs بوقت تمايز أقصر، وخطوات أقل، وتقليل المخاطر التقنية دون خطوة الانفصام. ويمكن أيضا أن الخلايا العصبية المتاحة تجاريا يمكن استخدامها لتوليد MNS لتقليل الوقت للتمايز.
لتوليد MNO، نحن مثقف MNS في رقاقة ثقافة الأنسجة. تتمدد المحاور من الزاوي وتمتد إلى القناة الدقيقة التي تتجمع فيها المحاور وتحاذي أحادي الاتجاه. وهذا يسهل التفاعل المحوري وتشكيل عفوي من مجموعة مجمعة بإحكام نسيج من المحاور في القنوات الدقيقة، والتي تتحقق بشكل فريد من قبل هذا البروتوكول، في حين إما تشكيل حزمة عفوية أو توجيه محور عصبي التوجه وحده يمكن تحقيقه من قبل بروتوكولات أخرى12،13،14. في تجربة نموذجية، تنتقل خلايا قليلة من الـ spheroids إلى القنوات الدقيقة، وتبقى معظم الخلايا على شكل خلايا سفيرية قريبة. تسمح هذه الطريقة بعزل المحاور بشكل عفوي عن الزائر دون استخدام حواجز مادية تعتمد على الحجم (مثل ميكروغروف أو مرشحات ميكروبور) لفصل المحاور عن أجسام الخلايا.
يمكن أن تخضع MNO الناتجة إلى فحوصات مختلفة، بما في ذلك التحليلات المورفولوجية والبيوكيميائية والفيزيائية. يمكن عزل جسم الخلية وحزمة المحور الموسعة من الناحية الجسدية عن طريق القطع ويمكن تحليلها بشكل منفصل للتجارب المصب، على سبيل المثال، الميكيميا الحيوية. المواد البيولوجية بما في ذلك الحمض النووي الريبي والبروتين يمكن عزلها من مجرد حزم محور عصبي قليلة للمقايس الكيميائية الحيوية العادية بما في ذلك RT-PCR وغرب النشاف. هنا ، نحن وصف بروتوكول لتوليد الجهاز العصبية الحركية من خلايا iPS ، والذي يقدم نموذجًا فسيولوجيًا ومرضيًا جذابًا لدراسة الآلية الكامنة في التطور ومرض كراسات المحاور.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

إنّ كَرَسَة المحاور هي واحدة من الزخارف الهيكلية الرئيسية التي لوحظت في الجهاز العصبي. يمكن أن يسبب اضطراب كراسات المحاور الرئيسية أمراضًا تنموية وعصبية تنكسية. على الرغم من أن العديد من الدراسات التي أجريت على محاور عصبية قد أجريت، فهمنا لتشكيل والخلل الوظيفي من كراسات محور عصبي لا يزال محدودا بسبب عدم وجود نماذج قوية ثلاثية الأبعاد في المختبر. هنا، نحن وصف بروتوكول خطوة بخطوة للجيل السريع من الجهاز العضوي العصب الحركي (MNO) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPS) المستحثة من الإنسان في رقاقة زراعة الأنسجة القائمة على ميكروفلويديك. أولا ، يتم وصف تصنيع رقائق المستخدمة في الطريقة. من خلايا iPS البشرية ، يتم تشكيل الخلايا العصبية الحركية (MNS). بعد ذلك، يتم نقل MNS متمايزة في رقاقة. بعد ذلك ، تنمو المحاور تلقائيًا من الزنجي وتتجمع في كراسة داخل قناة صغيرة مجهزة في الشريحة ، والتي تولد أنسجة MNO تحمل حزمة من المحاور الممتدة من الزفير. لتحليل المصب، يمكن إخراج MNOs من الشريحة ليتم إصلاحها للتحليلات المورفولوجية أو تشريحها للتحليلات الكيميائية الحيوية، وكذلك تصوير الكالسيوم وتسجيلات صفيف متعدد الأقطاب. ويمكن أن تيسر المنظمات غير الحكومية التي تولدت بهذا البروتوكول اختبار المخدرات وفحصها، ويمكن أن تسهم في فهم الآليات الكامنة في تطوير والأمراض الناجمة عن كراسات المحاور.

تم تمييز الخلايا العصبية الحركية في غضون 12-14 يوما في إجراءات التمايز 3D(الشكل 4 والشكل 5). الأهم من ذلك, أكثر من 60٪ من الخلايا أعرب علامة الخلايا العصبية الحركية HB9 خلال التمايز. كشفت الكيمياء المناعية أن ما يقرب من 80٪ من الخلايا في MNS كانت الخلايا العصبية الحركية الإيجابية SMI32. HB9 و SMI32 هي المنشأة في مرحلة مبكرة علامات الخلايا العصبية الحركية15,16. التعبير عن HB9 وSMI32 هي المعايير الرئيسية التي تحتاج إلى تأكيد لضمان الهوية الخلوية للخلايا العصبية الحركية. بعد إدخال MNS في رقاقة الثقافة ، تمتد المحاور إلى القناة ونماذج حزمة محور عصبي. بسبب microchannels بمثابة أدلة المادية، axons الإطالة من MNS وتشكيل حزمة من التفاعل محور عصبي(الشكل 6A). من الضروري التأكد من تشكيل حزمة محور عصبي من خلال المراقبة المجهرية لتأكيد توليد MNO. ويحمل MNO الناجح حزمة محور عصبي أوسع من 50 ميكرومتر وعدد قليل من المحاور المعزولة من الحزمة في القناة. ويمكن ملاحظة الإطالة الأولية للمحور بعد 24 ساعة من إدخال الزفير. في غضون 3-4 أيام القادمة ، وصلت المحاور إلى مركز القناة الدقيقة ثم تصل إلى الطرف الآخر في غضون 10 أيام إضافية (الشكل 6A). وبالتالي، جمعت محاور عصبية وشكلت حزمة مستقيمة و أحادية الاتجاه في 2-3 أسابيع في رقاقة، ولوحظت الأنشطة العصبية بعد ذلك.
يمكن جمع الأعضاء العصبية الحركية من رقاقة عن طريق فصل PDMS من الزجاج المجهر للتحليل البيولوجي(الشكل 6B). يمكن تشريح حزم أكسون والهيئات الخلية وعزلها عن طريق قطع باستخدام سكين جراحية أو ملاقط تحت المجهر (الشكل 6B). ويمكن استخدام هذه المواد البيولوجية بما في ذلك الحمض النووي الريبي والبروتين للمقايس الكيميائية الحيوية العادية مثل RT-PCR وغرب النشاف. في حزم محور عصبي من MNOs، لا يتم الكشف عن البروتينات صانع النووية أو التشعب في النشاف الغربية(الشكل 6C).
في تركيبة مع مؤشر الكالسيوم (Fluo-4 AM), يمكن التقاط نشاط الخلايا العصبية في رقاقة ثقافة الأنسجة. لوحظ النشاط التلقائي للخلايا العصبية الحركية في spheroid وحزمة محور عصبي داخل MNO. أيضا، لوحظت الأنشطة العصبية باستخدام نظام صفيف متعدد الأقطاب.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> الشكل 1: البعد من رقاقة ثقافة الأنسجة PDMS. (أ) Photomask من رقاقة ثقافة الأنسجة. (ب) أبعاد microchannel في رقاقة ثقافة الأنسجة. قطر الغرفة الأساسية لعقد الخلايا العصبية الحركية spheroid هو 2 مم وثقب PDMS فوق الغرفة هو 1.5 ملم. العرض والارتفاع من microchannel سد غرفتين كلاهما 150 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> الشكل 2: رسم تخطيطي لتمايز الخلايا العصبية الحركية. (أ)وشملت خطوات التمايز التعريفي العصبي، والنقش في سلالة الخلايا العصبية الحركية، ونضج الخلايا العصبية الحركية. (ب) خيارين لإنشاء الخلايا العصبية الحركية spheroid (MNS) من خلايا iPS: بروتوكول 3D، وبروتوكول 2D مع خطوة تفكك الخلايا العصبية الحركية. يمكن الحصول على الجهاز العضوي العصبية الحركية (MNO) بواسطة كلا البروتوكولين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> الشكل 3: خطوة بخطوة بروتوكول لطلاء مصفوفة غشاء الطابق السفلي والخلايا العصبية الحركية spheroid مقدمة. (A) الطابق السفلي غشاء مصفوفة الطلاء في قناة رقاقة ثقافة الأنسجة. (B) MNS إدخال في ثقب الرقاقة. (ج)الثقافة متوسطة التغير من خلال طموح المتوسط المنهك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> الشكل 4: 2D و 3D تمايز الخلايا العصبية الحركية. (أ) المسار الزمني للتمايز MNS 3D التمثيلي (بروتوكول ثلاثي الأبعاد). ازداد حجم MNS تدريجيا مع مرور الوقت. شريط مقياس: 500 μm. (ب) المسار الزمني للتمايز 2D على -D2, D0, D1, D6, D12 (بروتوكول 2D). شريط مقياس: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> الشكل 5: توصيف الخلايا العصبية الحركية. (A) (يسار) اكشن من MNS ملطخة بالأجسام المضادة SMI-32 و DAPI. (وسط) صورة على النقيض من المرحلة من MNS أعيد طلائها على سطح مكسو بالغشاء السفلي. لوحظت اطالة أكسونال. (يمين) أكسونات من MNS إعادة طلاء ملطخة مع الأجسام المضادة سينابسين الأول و Tuj1. شريط مقياس: 500 ميكرومتر (يسار ووسط) و50μm (يمين). (B) صورة تمثيلية من الخلايا العصبية الحركية 2D المثبطة مع الأجسام المضادة Tuj و HB9. مقياس شريط: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> الشكل 6: توصيف الجهاز العضوي العصبي الحركي (MNO) الذي تم إنشاؤه في شريحة الثقافة. (أ)صور تمثيلية من مُزَمّة المحاور ومحور التركيز السميك على D32. شريط مقياس: 500 μm. (ب) المناعة من الجهاز العضوي العصبية الحركية (MNO) بواسطة SMI-32 و DAPI. يمكن عزل أجهزة أكسون وأجساد الخلايا عن طريق القطع الجسدي. شريط مقياس: 1 مم . (C) نقاء البروتين من محاور والهيئات الخلية كميا بواسطة النشاف الغربية. لم يتم اكتشاف MAP2، وهو علامة تشعبية، في بروتين محور عصبي، في حين أن علامة الـ Tau1 المحورية غنية في بروتين محور المحور. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

يوفر هذا البروتوكول إجراءً شاملاً لتلفيق الجهاز العضوي العصبي الحركي المشتق من الخلايا البشرية من خلال التجميع التلقائي لحزمة قوية من المحاور المُمددة من الزفير في شريحة ثقافة الأنسجة.

ثلاثي الأبعاد موتور العصب الجهازية جيل

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

محرك عانى من قطع الأعصاب والوقت الفاصل بين التصوير من السلوكيات الخلايا الغروية في اسماك الزرد لايف

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

بروتوكول للثلاثي الأبعاد متحد البؤر تحليل المظهرية من النجمية

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

تصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال البشرية

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

وصلات الألياف من منطقة السيارات التكميلية إعادة النظر: منهجية تشريح الألياف، وزارة التجارة والصناعة، وثلاثة الأبعاد وثائق

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

توليد وصيانة طويلة الأجل خالية من الأعصاب<em&gt; حيدرة</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

في فيفو تتبع في محطة Presynaptic الأعصاب الحركية المورفولوجية جزيء واحد

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

تصوير ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع من المنظمة الخلوية في اللحاء الجديد الماوس

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

نمذجة الاشكال ثلاثية الابعاد وتحليل هياكل المخ

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D تحليل الحركية للتقييم الوظيفي في نموذج الفئران من عرق النسا الأعصاب سحق الإصابة

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

تنقية الخلايا الليفية وخلايا شوان من الأعصاب الحسية والحركية في المختبر

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...