Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 og 18K19903, Core-2-core program, og Beyond AI institut.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

I en del af denne protokol, et patent er blevet licenseret til Jiksak Bioengineering, Inc., som blev grundlagt af Jiro Kawada.

Denne protokol beskriver dannelsen af en motor nerve organoid (MNO), som har en axon bundt forlænget fra en motor neuron sfæroid genereret fra menneskelige iPS celler. Det dannede axonbundt er tykt, fleksibelt og velorganiseret i ensrettede strukturer. Ved at dissekere axonbundtet kan der opnås axonalt protein og RNA med høj renhed tilstrækkeligt til biokemiske analyser. Neuronal aktivitet kan måles i axon bundter og sfæroider med calcium billeddannelse. Forurening af nukleare og dendritiske proteiner i axonal lysatet blev ikke opdaget ved vestlig blotting, hvilket viser, at vores metode effektivt adskilt axoner fra cellelegemer og dendritter.
En af fordelene ved denne protokol er den hurtige differentiering og generering af MNO udstyret med et axonbundt, hvor alle processer kan udføres på 4 uger med 3D-protokollen og 5-6 uger ved hjælp af 2D-protokollen. Dette er kort i forhold til andre protokoller, som typisk tager 3-4 uger blot at differentiere til MN fra embryonale stamceller og iPS-celler17, og det tager yderligere 2-4 uger at opnå axonal forlængelse. 3D-protokollen foretrækkes generelt frem for 2D-protokollen på grund af den kortere differentieringstid, færre trin og reducerede tekniske risici uden dissociationstrinnet sammenlignet med 2D-protokollen. Den mikrofluidic-baserede vævskultur chip blev designet på en måde, så axoner af MNS kan forlænge mod det andet rum gennem mikrokanalen, hvilket letter dannelsen af et bundt axoner ved at fremkalde axo-axonale interaktioner og affinitet mellem axoner. På grund af den enkle eksperimentelle opsætning kan alle de protokoller, der er beskrevet her, ikke kun udføres af bioengineers, der er bekendt med manipulation af en vævskulturchip, men også biologer og neuroforskere, der ikke er bekendt med mikrofluidics og mikrofabrikationsteknikker. Det skal bemærkes, at trin 1 og 2 også kan udføres ved hjælp af en ekstern fabrikationsservice.
Et af de kritiske skridt til at opnå protokollen er en sekventiel ændring af kulturmediet. Det anbefales helt at ændre kulturmediet på hvert trin under differentieringen, så faktorer i det brugte medium ikke forstyrrer MN-differentieringen. Et andet kritisk punkt i denne protokol er at opretholde udifferentierede iPS-celler i god kvalitet. Kvaliteten af den oprindelige iPS cellekultur påvirker effektiviteten for at opnå motoriske neuroner og MNO. Et andet punkt er, at diameteren af MNS skal være mindre end størrelsen af hullet i chippen (1,5 mm). Større sfæroider kan ikke komme ind i kammeret, og potentielt opleve svær hypoxisk nekrose i den midterste del. Størrelsen af MNS'er kan styres ved at ændre et indledende såningsnummer af iPS-celler (i 3D-protokol) eller motoriske neuroner (i 2D-protokol). Cellernes såtæthed skal optimeres for hver iPS-cellelinje.
Opdelte mikrofluidiske enheder med mikrogrooves og små porefiltre er i vid udstrækning blevet brugt til at adskille axoner fra cellelegemer og dendritter. Denne teknik kan også adskille axoner fra celle organer og dendrite, med overlegen overflod af axoner i bundtet væv. Sammenlignet med de andre metoder er en væsentlig begrænsning af denne metode, at den ikke kan adskille to forskellige kulturmedier i det nuværende design af vævskulturchippen, hvilket hindrer evnen til medkultur af to forskellige celler, der kræver to forskellige medier. En anden begrænsning er, at PDMS-chippen sætter forudbestemt begrænsning på vævets størrelse. En kugleformet større end hullet kan ikke komme ind i kammeret, og axonbundtet kan ikke blive tykkere end bredden af mikrofluidisk kanal.
Denne metode kan anvendes til andre typer af neuroner. Vores gruppe har vist evne til at modellere en cerebral tarmkanalen ved hjælp af en modificeret metode kombineret med cerebral organoid teknikker18. Kortikale sfæroider blev introduceret i både rum og axoner spontant langstrakt gensidigt mod hver sfæroid, og efterfølgende en axon bundt dannet spontant. Som følge heraf kan to kortikale sfæroider forbindes gennem et axonbundt, og vævet kan opnås som et stykke. Dette viser, at tilgangen er meget alsidig til at danne axon bundtvæv uanset neuronale celletyper. I denne protokol blev der imidlertid anvendt menneskelige iPS-celler, men andre stamceller, herunder menneskelige ES-celler og menneskelige neurale stamceller, kan bruges med ændringer af den præsenterede protokol. 3D-sfæroider af neuroner kan genereres af forskellige protokoller19,20. Denne metode til fremstilling af væv med en axon bundt kan potentielt kombineres i fremtiden med de andre differentiering protokoller for at gøre 3D MN sfæroid. Derudover kan tykkelsen og længden af axonbundtet styres ved blot at ændre bredden og højden af vævskulturchippen til fremtidig udvikling.
Vi mener, at denne protokol kan bruges til test og screening af lægemidler og kan bidrage til forståelsen af de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen og sygdomme i axon fascicles.

Spinal motor neuroner (MN) udvide axoner til skeletmuskler til at kontrollere kroppens bevægelse. Deres axonale baner er højt organiserede og regulerede i udviklingsprocessen. På trods af mange undersøgelser af axonforlængelse og vejledning1undersøges der stadig mekanismer til organiseret axonbundtdannelse. Axoner af motoriske neuroner er ofte beskadiget af neurodegenerative sygdomme som amyotrofisk lateral sklerose (ALS)2, men patofysiologiske mekanismer af skaden på axon fascicles er dårligt forstået. Således kræves en fysiologisk og patologisk model til at opsummere axon bundtdannelse og regression i marken.
En menneskelig stamcelle-afledt motor neuron er en lovende platform for forståelse af udvikling og sygdomme som ALS3. Menneskeskabte pluripotente stamceller (iPS-celler) kan bruges til at modellere sygdomme ved hjælp af patient-afledte celler. Til dato er forskellige differentieringsmetoder fra pluripotente stamceller til MN blevet rapporteret4,5,6. Imidlertid er axoner af neuroner i todimensionel kultur tilfældigt orienteret og sammenfatter ikke in vivo mikromiljø inden for udvikling af nerver, hvor axoner er ensrettet samlet gennem tætte axo-axonale interaktioner7. For at løse dette problem har vi udviklet en teknik til at generere et tredimensionelt væv, der ligner motornerven fra menneskelige iPS-celler8, og navngivet vævet som motornerveorganoid (MNO). MNO består af cellelegemer placeret i en motor neuron sfæroid (MNS) og en axonal fascicle forlænget ud fra kugleformet. Axonerne i fascicleen er ensrettet, hvilket ligner axoner i udviklingen af motoriske nerver. Derfor giver MPO'er unikt et fysiologisk axonalt mikromiljø, som ikke blev udført af andre tidligere udviklede neuronale kulturmetoder.
I denne protokol beskriver vi metoder til vævskultur chips fabrikation, hurtig motor neuron differentiering, og motor nerve organoid dannelse i udviklede chips. Vores vævskulturchip er meget enkel, og den indeholder kun et rum til accept af en kugleformet, en mikrokanal til dannelse af et axonbundt og et rum til boliger axonterminaler. Enheden indeholder ikke komplekse strukturer, herunder mikrogrooves eller micropore filtre, der ofte bruges til at adskille axoner og cellelegemer efter størrelse9,10. Derfor kan vores enheder let fremstilles ved at følge de trin, der er beskrevet i denne protokol, hvis en fotolitografiopsætning er tilgængelig.
Hurtig differentiering af menneskelige iPS-celler opnås med en optimeret kombination af inducerende og mønstrende faktorer (SB431542, LDN-193189, retinosyre (RA) og glattet agonist (SAG)) og accelerationsfaktorer (SU5402 og DAPT). Det er blevet rapporteret, at kombinationen af SU5402 og DAPT fremskynder differentieringen af perifere neuroner og neurale crest celler11. I denne protokol tilbyder vi tre forskellige metoder til at generere MPO'er, så læserne kan beslutte sig for en metode, der passer bedst til deres behov. Vi anbefaler at udføre differentiering af menneskelige iPS-celler efter at have dannet en sfæroid (3D-metoden), da den differentierede MNS kan overføres direkte til en vævskulturchip. Alternativt kan menneskelige iPS-celler differentieres til motoriske neuroner i monolayer (2D) kultur og derefter oprettes i tredimensionelle motor neuron-sfæroider, som vi tidligere rapporterede8. Vi har opdateret protokollen, og med den tredimensionelle differentieringsmetode, der er beskrevet i denne protokol, kan overgangen fra 2D til 3D undgås, og MPO'er kan opnås med kortere differentieringstid, færre trin og reducerede tekniske risici uden dissociationstrinet. Kommercielt tilgængelige neuroner kan også bruges til at generere MNS for at reducere tiden til differentiering.
For at generere en MNO dyrkede vi en MNS i vævskulturchippen. Axonerne forlænges fra kugleformen og strækker sig ind i mikrokanalen, hvor axoner samles og justeres ensrettet. Dette letter axo-axonal interaktion og spontan dannelse af et tæt samlet ensrettet bundtvæv af axoner i mikrokanalen, hvilket unikt opnås ved denne protokol, mens enten spontan bundtdannelse eller styret axonal orientering alene kan opnås ved andre protokoller12,13,14. I et typisk eksperiment migrerer få celler ud fra sfæroider til mikrokanalen, og de fleste celler forbliver i nærheden af sfæroider. Denne metode gør det muligt spontant at adskille axoner fra spheroiderne uden at anvende størrelsesafhængige fysiske barrierer (f.eks. mikrogrooves eller microporefiltre) til at adskille axoner fra cellelegemer.
Den resulterende MNO kan underkastes forskellige undersøgelser, herunder morfologiske, biokemiske og fysiske analyser. Cellekroppen og det udvidede axonbundt kan fysisk isoleres ved skæring og kan analyseres separat til downstream-eksperimenter, f.eks. biokemiske assays. Biologiske materialer, herunder RNA og protein kan isoleres fra blot et par axon bundter til regelmæssige biokemiske assays herunder RT-PCR og vestlige blotting. Her beskriver vi en protokol til generering af motornerveorganoid fra iPS-celler, som tilbyder en attraktiv fysiologisk og patologisk model til at studere den mekanisme, der ligger til grund for udvikling og sygdom af axon fascicles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

En fascicle af axoner er en af de vigtigste strukturelle motiver observeret i nervesystemet. Forstyrrelse af axon fascicles kan forårsage udviklingsmæssige og neurodegenerative sygdomme. Selv om der er gennemført talrige undersøgelser af axoner, er vores forståelse af dannelse og dysfunktion af axon fascicles stadig begrænset på grund af manglen på robuste tredimensionelle in vitro-modeller. Her beskriver vi en trinvis protokol for den hurtige generation af en motornerveorganoid (MNO) fra human inducerede pluripotente stamceller (iPS) celler i en mikrofluidisk-baseret vævskulturchip. For det første beskrives fremstilling af chips, der anvendes til metoden. Fra menneskelige iPS-celler dannes en motor neuron sfæroid (MNS). Dernæst overføres den differentierede MNS til chippen. Derefter vokser axoner spontant ud af kugleformet og samles i en fascicle i en mikrokanal udstyret i chippen, som genererer et MNO-væv, der bærer et bundt axoner forlænget fra kugleformet. Til downstream-analysen kan MPO'er tages ud af chippen, der skal fastgøres til morfologiske analyser eller dissekeres til biokemiske analyser, samt calciumbilleddannelse og multielektrode array-optagelser. MNOs genereret med denne protokol kan lette test og screening af lægemidler og kan bidrage til forståelsen af mekanismer, der ligger til grund for udvikling og sygdomme i axon fascicles.

Motorneuroner blev differentieret inden for 12-14 dage i 3D-differentieringsprocedurer(figur 4 og figur 5). Vigtigere er det, mere end 60% af cellerne udtrykt motor neuron markør HB9 under differentieringen. Immunhisokemi viste, at ca. 80% af cellerne i MNS var SMI32-positive motoriske neuroner. HB9 og SMI32 er de etablerede tidlige motor neuron markører15,16. Udtrykket af HB9 og SMI32 er de vigtigste parametre, der skal bekræftes for at sikre cellulær identitet motor neuroner. Efter indførelsen af en MNS i kulturen chip, axoner strækker sig ind i kanalen og en axon bundt former. På grund af mikrokanaler, der tjener som fysiske hjælpelinjer, forlænges axoner fra MNS og danner et bundt ved axo-axonal interaktion (Figur 6A). Det er vigtigt at bekræfte dannelsen af axonbundtet ved mikroskopisk observation for at bekræfte genereringen af en MNO. En vellykket MNO bærer en axon bundt bredere end 50 μm og få isolerede axoner ud af bundtet i kanalen. Indledende forlængelse af axoner kan observeres 24 timer efter indførelsen af kugleformet. Inden for de næste 3-4 dage nåede axonerne til midten af mikrokanalen og når derefter til den anden ende inden for yderligere 10 dage (Figur 6A). Derfor samledes axonerne og dannede et lige og ensrettet bundt på 2-3 uger i en chip, og neuronale aktiviteter blev observeret derefter.
Motoriske nerveorganoider kan opsamles fra chippen ved at løsne PDMS fra mikroskopglasset til biologisk analyse (Figur 6B). Axon bundter og cellelegemer kan dissekeres og isoleres ved at skære ved hjælp af en kirurgisk kniv eller pincet under et mikroskop (Figur 6B). Disse biologiske materialer, herunder RNA og protein kan bruges til regelmæssige biokemiske assays såsom RT-PCR og vestlige blotting. I axonbundter af MPO'er påvises der ikke nukleare eller dendritiske makerproteiner i vestlig blotting (Figur 6C).
I kombination med en calciumindikator (Fluo-4 AM) kan neuronal aktivitet fanges i vævskulturchippen. Spontan aktivitet af motoriske neuroner i kugleformet og axonbundtet blev observeret inden for MNO. De neurale aktiviteter blev også observeret ved hjælp af et multielektrodesystem.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figur 1: Dimensionen af PDMS-vævskulturchippen. (A)Fotomaske af vævskulturchippen. (B) Mikrokanalens dimensioner i vævskulturchippen. Diameteren af basiskammeret til at holde motor neuron sfæroid er 2 mm, og hullet i PDMS over kammeret er 1,5 mm. Bredden og højden af en mikrokanal, der forbinder to kamre, er begge 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk illustration af motorisk neurondifferentiering. (A) Differentiering trin involveret neurale induktion, mønstre i motor neuron afstamning, og modning af motoriske neuroner. (B) To muligheder for at skabe motor neuron sfæroid (MNS) fra iPS celler: 3D-protokol, og en 2D-protokol med dissociation trin af motor neuroner. Motornerve organoid (MNO) kan opnås ved begge protokoller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figur 3: Trin for trin protokol for kælder membran matrix belægning og motor neuron sfæroid introduktion. (A) Kældermembranmatrixbelægning i vævskulturchippens kanal. (B) MNS indføring i hullet på chippen. (C)Kultur medium forandring ved aspiration af udmattet medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figur 4: Differentiering af 2D- og 3D-motorneuroner. (A) Tidsforløb for repræsentativ 3D MNS-differentiering (3D-protokol). Størrelsen af MNS gradvist steget over tid. Skalastang: 500 μm. (B) Tidsforløb med 2D-differentiering på -D2, D0, D1, D6, D12 (2D-protokol). Skalastang: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figur 5: Karakterisering af motoriske neuroner. (A) (Venstre) En kryosection af en MNS farvet med SMI-32 antistof og DAPI. (I midten) Et fasekontrastbillede af replated MNS på en kældermembran matrixbelagt overflade. Axonal forlængelse blev observeret. (Til højre) Axoner af replated MNS farvet med Synapsin I og Tuj1 antistoffer. Skalabjælke: 500 μm (venstre og mellem) og 50μm (højre). (B) Et repræsentativt billede af 2D-motoriske neuroner immunostained med Tuj og HB9 antistoffer. Skalastang: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figur 6: Karakterisering af en motornerve organoid (MNO) genereret i en kultur chip. (A) Repræsentative billeder af axon forlængelse og tyk axon bundt dannelse på D32. Skalastang: 500 μm. (B) Immunostaining af motornerve organoid (MNO) af SMI-32 og DAPI. Axoner og cellelegemer kan isoleres ved fysisk skæring. Skalastang: 1 mm. (C) Renhed af proteinet fra axoner og cellelegemer kvantificeret ved vestlig blotting. MAP2, en dendritisk markør, blev ikke påvist i axonalt protein, mens axonal markør Tau1 er beriget med det axonale protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Denne protokol giver en omfattende procedure for fremstilling af humane iPS celle-afledte motoriske nerve organoid gennem spontan samling af en robust bundt axoner udvidet fra en sfæroid i en vævskultur chip.

Tre-dimensionelle Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve transection og Time-lapse Imaging af gliacelle Behaviors Live zebrafisk

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokol til tredimensionel Konfokal Morfometrisk Analyse af Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Tre-dimensionelle billedbehandling og analyse af mitochondrier i menneskelige Intraepidermal nervefibre

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

Fiberforbindelser af det supplerende motorområde revideret: Metodik for fiberdissektion, DTI og tredimensionel dokumentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generering og langvarig vedligeholdelse af nervefri<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Enkelt-molekyle sporing på Drosophila præsynaptiske motoriske Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Storstilet tredimensional billeddannelse af cellulære organisation i mus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Tredimensionel form modellering og analyse af hjernestrukturer

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse for funktionel evaluering i rottemodel af iskiasnerven crush skade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Rensning af fibroblaster og Schwann celler fra sensoriske og motoriske nerver i Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...