Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 en 18K19903, Core-2-core program en Beyond AI institute.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

In een deel van dit protocol is een patent verleend aan Jiksak Bioengineering, Inc. dat is opgericht door Jiro Kawada.

Dit protocol beschrijft de vorming van een motorische zenuw organoïde (MNO) die een axon bundel uitgebreid van een motor neuron sferoïde gegenereerd uit menselijke iPS cellen. De gevormde axonbundel is dik, flexibel en goed georganiseerd in unidirectionele structuren. Door de axonbundel te ontleden, kunnen hoogzuiver axon-eiwit en RNA voldoende worden verkregen voor biochemische analyses. Neuronale activiteit kan worden gemeten in axonbundels en sferoïden met calciumbeeldvorming. Verontreiniging van nucleaire en dendritische eiwitten in het axonale lysaat werd niet gedetecteerd door westerse vlekken, wat aantoont dat onze methode axonen efficiënt scheidde van cellichamen en dendrieten.
Een van de voordelen van dit protocol is de snelle differentiatie en generatie van MNO uitgerust met een axon bundel, waarbij alle processen in 4 weken kunnen worden uitgevoerd met het 3D protocol en 5-6 weken met behulp van het 2D protocol. Dit is kort in vergelijking met andere protocollen die meestal 3-4 weken duren om eenvoudigweg te differentiëren in MN van embryonale stamcellen en iPS-cellen17 en het duurt nog eens 2-4 weken om axonale verlenging te verkrijgen. Het 3D-protocol heeft over het algemeen de voorkeur boven het 2D-protocol vanwege de kortere differentiatietijd, minder stappen en verminderde technische risico's zonder de dissociatiestap in vergelijking met het 2D-protocol. De op microfluïdische basis gebaseerde weefselkweekchip is zo ontworpen dat de axoonen van MNS zich via het microkanaal naar het andere compartiment kunnen verlengen, wat de vorming van een bundel axoonen vergemakkelijkt door axo-axonale interacties en affiniteit tussen axonen te induceren. Vanwege de eenvoudige experimentele opzet kunnen alle hier beschreven protocollen niet alleen worden uitgevoerd door bio-ingenieurs, die bekend zijn met de manipulatie van een weefselkweekchip, maar ook biologen en neurowetenschappers die niet bekend zijn met microfluïdische en microfabricatietechnieken. Opgemerkt moet worden dat stappen 1 en 2 ook kunnen worden uitgevoerd met behulp van een externe fabricageservice.
Een van de kritieke stappen om het protocol te bereiken is een opeenvolgende verandering van cultuurmedium. Het wordt geadviseerd om het cultuurmedium bij elke stap tijdens de differentiatie volledig te veranderen, zodat factoren in het gebruikte medium de MN-differentiatie niet verstoren. Een ander kritiek punt van dit protocol is om ongedifferentieerde iPS-cellen in goede kwaliteit te houden. De kwaliteit van de initiële iPS-celcultuur heeft een aanzienlijke invloed op de efficiëntie om motorneuronen en MNO te verkrijgen. Een ander punt is dat de diameter van MNS kleiner moet zijn dan de grootte van het gat van de chip (1,5 mm). Grotere sferoïden kunnen de kamer niet binnendringen en kunnen ernstige hypoxische necrose in het middelste deel ervaren. De grootte van MNS'en kan worden geregeld door een eerste zaaigetal van iPS-cellen (in 3D-protocol) of motorneuronen (in 2D-protocol) te wijzigen. De zaaidichtheid van cellen moet worden geoptimaliseerd voor elke iPS-cellijn.
Gecompartimenteerde microfluïdische apparaten met microgrooves en kleine poriefilters zijn veel gebruikt om axonen te scheiden van cellichamen en dendrieten. Deze techniek kan ook axonen scheiden van cellichamen en dendriet, met superieure overvloed aan axonen in gebundelde weefsels. In vergelijking met de andere methoden is een belangrijke beperking van deze methode dat het twee verschillende kweekmedia niet kan scheiden in het huidige ontwerp van de weefselkweekchip, wat het vermogen van co-cultuur van twee verschillende cellen die twee verschillende media vereisen, belemmert. Een andere beperking is dat de PDMS-chip vooraf bepaalde beperking op de grootte van het weefsel heeft geplaatst. Een sferoïde groter dan het gat kan de kamer niet binnendringen en de axonbundel kan niet dikker worden dan de breedte van het microfluïdische kanaal.
Deze methode kan worden toegepast op andere soorten neuronen. Onze groep heeft aangetoond dat het mogelijk is om een hersenkanaal te modelleren met behulp van een aangepaste methode in combinatie met cerebrale organoïde technieken18. Corticale sferoïden werden geïntroduceerd in beide compartimenten en de axonen spontaan verlengd wederkerig naar elke sferoïde, en vervolgens een axon bundel spontaan gevormd. Als gevolg hiervan kunnen twee corticale sferoïden worden verbonden via een axonbundel en kan het weefsel als één stuk worden verkregen. Dit toont aan dat de aanpak zeer veelzijdig is om axon bundelweefsels te vormen, ongeacht neuronale celtypen. In dit protocol werden menselijke iPS-cellen gebruikt, maar andere stamcellen, waaronder menselijke ES-cellen en menselijke neurale stamcellen, kunnen worden gebruikt met wijzigingen in het gepresenteerde protocol. 3D-sferoïden van neuronen kunnen worden gegenereerd door verschillende protocollen19,20. Deze methode om weefsels te maken met een axonbundel kan in de toekomst mogelijk worden gecombineerd met de andere differentiatieprotocollen voor het maken van 3D MN-sferoïde. Bovendien kunnen de dikte en de lengte van de axonbundel worden geregeld door eenvoudigweg de breedte en hoogte van microkanalen van de weefselkweekchip te wijzigen voor toekomstige ontwikkelingen.
Wij geloven dat dit protocol kan worden gebruikt voor drugstests en screening en kan bijdragen aan het begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en ziekten van axon fascicles.

Spinale motorische neuronen (MN) strekken axonen uit naar skeletspieren om de beweging van het lichaam te regelen. Hun axonale trajecten zijn sterk georganiseerd en gereguleerd in het ontwikkelingsproces. Ondanks vele studies over axon uitbreiding en begeleiding1, worden de mechanismen voor georganiseerde axon bundelvorming nog onderzocht. Axonen van motorneuronen worden vaak beschadigd door neurodegeneratieve ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS)2, maar pathofysiologische mechanismen van de schade aan axon fascicles worden slecht begrepen. Zo is een fysiologisch en pathologisch model vereist om axonbundelvorming en regressie in het veld te recapituleren.
Een menselijk stamcel-afgeleid motorneuron is een veelbelovend platform voor het begrijpen van de ontwikkeling en ziekten zoals ALS3. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen) kunnen worden gebruikt om ziekten te modelleren met behulp van van de patiënt afgeleide cellen. Tot op heden zijn verschillende differentiatiemethoden van pluripotente stamcellen in MN gerapporteerd4,5,6. Axonen van neuronen in de tweedimensionale cultuur zijn echter willekeurig georiënteerd en vatten niet samen in vivo micromilieu binnen zich ontwikkelende zenuwen waarin axo-axonale interacties unidirectioneel worden geassembleerd7. Om dit probleem op te lossen, hebben we een techniek ontwikkeld om een driedimensionaal weefsel te genereren dat lijkt op motorische zenuw uit menselijke iPS-cellen8, en het weefsel benoemd als motorische zenuw organoïde (MNO). De MNO bestaat uit cellichamen in een motorneuron sferoïde (MNS) en een axonale fascicle die zich uitstrekt uit de sferoïde. De axonen in de fascicle zijn unidirectioneel georiënteerd, wat lijkt op axonen bij het ontwikkelen van motorische zenuwen. Daarom bieden MNOs op unieke wijze een fysiologisch axonaal micromilieu, wat niet werd gedaan door andere eerder ontwikkelde neuronale kweekmethoden.
In dit protocol beschrijven we methoden voor weefselkweekchips fabricage, snelle motorneuron differentiatie en motorische zenuw organoïde vorming in ontwikkelde chips. Onze weefselkweekchip is heel eenvoudig en bevat alleen een compartiment voor het accepteren van een sferoïde, een microkanaal voor het vormen van een axonbundel en een compartiment voor het huisvesten van axonterminals. Het apparaat bevat geen complexe structuren, waaronder microgrooves of microporefilters die vaak worden gebruikt om axonen en cellichamen te scheiden op maat9,10. Daarom kunnen onze apparaten eenvoudig worden gefabriceerd door de stappen te volgen die in dit protocol worden beschreven als er een fotolithografie-installatie beschikbaar is.
Snelle differentiatie van menselijke iPS-cellen wordt bereikt met een geoptimaliseerde combinatie van inducerende en patroonfactoren (SB431542, LDN-193189, retinoïnezuur (RA) en gladgestreken agonist (SAG)) en versnellingsfactoren (SU5402 en DAPT). Er is gemeld dat de combinatie van SU5402 en DAPT de differentiatie van perifere neuronen en neurale crestcellenversnelt 11. In dit protocol bieden we drie verschillende methoden om MBO's te genereren, zodat lezers kunnen beslissen over een methode die het meest geschikt is voor hun behoeften. We raden aan om differentiatie van menselijke iPS-cellen uit te voeren na het vormen van een sferoïde (de 3D-methode), omdat het gedifferentieerde MNS rechtstreeks in een weefselkweekchip kan worden overgebracht. Als alternatief kunnen menselijke iPS-cellen worden onderscheiden in motorneuronen in de monolaagse (2D) cultuur en vervolgens worden gemaakt in driedimensionale motorneuronen sferoïden zoals we eerder meldden8. We hebben het protocol bijgewerkt en met de driedimensionale differentiatiemethode die in dit protocol wordt beschreven, kan de overgang van 2D naar 3D worden vermeden en kunnen MBO's worden verkregen met kortere differentiatietijd, minder stappen en verminderde technische risico's zonder de dissociatiestap. Commercieel verkrijgbare neuronen kunnen ook worden gebruikt om MNS te genereren om de tijd voor differentiatie te verkorten.
Om een MNO te genereren, kweekten we een MNS in de weefselkweekchip. De axonen verlengen zich van de sferoïde en strekken zich uit tot de microkanaal waarin axonen zich unidirectioneel verzamelen en uitlijnen. Dit vergemakkelijkt axo-axonale interactie en spontane vorming van een strak geassembleerd unidirectioneel bundelweefsel van axonen in de microkanaal, wat uniek wordt bereikt door dit protocol, terwijl spontane bundelvorming of begeleide axonale oriëntatie alleen kan worden bereikt door andere protocollen12,13,14. In een typisch experiment migreren maar weinig cellen van sferoïden naar de microkanaal en blijven de meeste cellen in de buurt van sferoïden. Met deze methode kunnen axonen spontaan worden gescheiden van de sferoïden zonder gebruik te maken van grootteafhankelijke fysieke barrières (bijv. microgrooves of microporefilters) om axonen van cellichamen te scheiden.
De resulterende MNO kan worden onderworpen aan verschillende onderzoeken, waaronder morfologische, biochemische en fysische analyses. Het cellichaam en de uitgebreide axonbundel kunnen fysiek worden geïsoleerd door te snijden en kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd voor downstream-experimenten, bijvoorbeeld biochemische tests. Biologische materialen, waaronder RNA en eiwit, kunnen worden geïsoleerd uit slechts een paar axonbundels voor regelmatige biochemische tests, waaronder RT-PCR en western blotting. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van motorische zenuw organoïde uit iPS-cellen, dat een aantrekkelijk fysiologisch en pathologisch model biedt om het mechanisme te bestuderen dat ten grondslag ligt aan de ontwikkeling en ziekte van axon fascicles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Een fascicle van axonen is een van de belangrijkste structurele motieven die in het zenuwstelsel worden waargenomen. Verstoring van axon fascicles kan ontwikkelings- en neurodegeneratieve ziekten veroorzaken. Hoewel talrijke studies van axonen zijn uitgevoerd, is ons begrip van vorming en disfunctie van axon fascicles nog steeds beperkt vanwege het gebrek aan robuuste driedimensionale in vitro modellen. Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de snelle generatie van een motorische zenuw organoïde (MNO) uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) in een op microfluïdische basis gebaseerde weefselkweekchip. Ten eerste wordt de fabricage van chips die voor de methode worden gebruikt, beschreven. Uit menselijke iPS-cellen wordt een motorneuron sferoïde (MNS) gevormd. Vervolgens wordt de gedifferentieerde MNS overgezet naar de chip. Daarna groeien axonen spontaan uit de sferoïde en assembleren ze zich tot een fascicle in een microkanaal dat in de chip is uitgerust, wat een MNO-weefsel genereert dat een bundel axonen draagt die uit de sferoïde zijn verlengd. Voor de downstreamanalyse kunnen MNO's uit de te repareren chip worden gehaald voor morfologische analyses of ontleed voor biochemische analyses, evenals calciumbeeldvorming en multi-elektrode array-opnamen. MBO's die met dit protocol worden gegenereerd, kunnen het testen en screenen van geneesmiddelen vergemakkelijken en kunnen bijdragen aan het begrijpen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en ziekten van axon-fascicles.

Motorneuronen werden binnen 12-14 dagen gedifferentieerd in 3D-differentiatieprocedures(figuur 4 en figuur 5). Belangrijk is dat meer dan 60% van de cellen motorneuronmarker HB9 uitdrukte tijdens de differentiatie. Immunohistochemie onthulde dat ongeveer 80% van de cellen in het MNS SMI32-positieve motorneuronen waren. HB9 en SMI32 zijn de gevestigde motorneuronmarkers in een vroeg stadium15,16. De expressie van HB9 en SMI32 zijn de belangrijkste parameters die moeten worden bevestigd om de cellulaire identiteit van motorneuronen te garanderen. Na de introductie van een MNS in de cultuurchip strekken axonen zich uit in het kanaal en vormt zich een axonbundel. Omdat microkanalen dienen als fysieke gidsen, verlengen axonen zich uit het MNS en vormen ze een bundel door axo-axonale interactie (figuur 6A). Het is essentieel om de vorming van de axonbundel te bevestigen door microscopische observatie om de generatie van een MNO te bevestigen. Een succesvolle MNO draagt een axonenbundel breder dan 50 μm en weinig geïsoleerde axonen uit de bundel in het kanaal. De eerste rek van axonen kan 24 uur na de introductie van de sferoïde worden waargenomen. Binnen de volgende 3-4 dagen bereikten de axonen het centrum van de microkanaal en bereiken vervolgens binnen nog eens 10 dagen het andere uiteinde (figuur 6A). Bijgevolg assembleerden en vormden de axonen een rechte en unidirectionele bundel in 2-3 weken in een chip, en neuronale activiteiten werden daarna waargenomen.
Motorische zenuworganoïden kunnen uit de chip worden verzameld door het PDMS los te maken van het microscoopglas voor biologische analyse (figuur 6B). Axonbundels en cellichamen kunnen worden ontleed en geïsoleerd door te snijden met een chirurgisch mes of pincet onder een microscoop (figuur 6B). Deze biologische materialen, waaronder RNA en eiwit, kunnen worden gebruikt voor regelmatige biochemische tests zoals RT-PCR en western blotting. In axonbundels van MBO's worden nucleaire of dendritische makereiwitten niet gedetecteerd in westerse vlekken (figuur 6C).
In combinatie met een calciumindicator (Fluo-4 AM) kan neuronale activiteit worden vastgelegd in de weefselkweekchip. Spontane activiteit van motorneuronen in de sferoïde en de axonbundel werden waargenomen binnen de MNO. Ook werden de neurale activiteiten waargenomen met behulp van een multi-elektrode array systeem.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figuur 1: De dimensie van PDMS weefselkweekchip. (A) Fotomasker van de weefselkweekchip. (B) Afmetingen van microkanaal in de weefselkweekchip. De diameter van de basiskamer voor het vasthouden van motorneuronenferoïd is 2 mm en het gat van PDMS boven de kamer is 1,5 mm. De breedte en hoogte van een microkanaaloverbrugging van twee kamers zijn beide 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figuur 2: Schematische illustratie van motorische neuron differentiatie. (A) De differentiatiestappen hadden betrekking op neurale inductie, patroonvorming in motorneuronenlijn en rijping van motorneuronen. (B) Twee opties om motorneuron sferoïde (MNS) te maken van iPS-cellen: 3D-protocol en een 2D-protocol met dissociatiestap van motorneuronen. Motorische zenuw organoïde (MNO) kan worden verkregen door beide protocollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figuur 3: Stap voor stap protocol voor keldermembraan matrix coating en motor neuron sferoïde introductie. (A) Keldermembraanmatrixcoating in het kanaal van de weefselkweekchip. (B) MNS introductie in het gat van de chip. (C) Cultuurmediumverandering door aspiratie van uitgeput medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figuur 4: 2D en 3D motor neuron differentiatie. (A) Tijdscursus van representatieve 3D MNS-differentiatie (3D-protocol). De grootte van de MNS nam in de loop van de tijd geleidelijk toe. Schaalbalk: 500 μm. (B) Tijdsverloop van 2D-differentiatie op -D2, D0, D1, D6, D12 (2D-protocol). Schaalbalk: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figuur 5: Karakterisering van motorneuronen. (A) (Links) Een cryosection van een MNS bevlekt met SMI-32 antilichaam en DAPI. (Midden) Een fasecontrastbeeld van opnieuw geplateerde MNS op een met keldermembraanmatrix bedekt oppervlak. Axonale verlenging werd waargenomen. (Rechts) Axonen van opnieuw geplateerde MNS bevlekt met Synapsin I en Tuj1 antilichamen. Schaalbalk: 500 μm (links en midden) en 50μm (rechts). (B) Een representatief beeld van 2D-motorneuronen immunostained met Tuj- en HB9-antilichamen. Schaalbalk: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figuur 6: Karakterisering van een motorische zenuw organoïde (MNO) gegenereerd in een cultuurchip. (A) Representatieve beelden van axon rek en dikke axon bundelvorming op D32. Schaalbalk: 500 μm. (B) Immunostaining van motorische zenuw organoïde (MNO) door SMI-32 en DAPI. Axonen en cellichamen kunnen worden geïsoleerd door fysiek te snijden. Schaalbalk: 1 mm. (C) Zuiverheid van het eiwit uit axonen en cellichamen gekwantificeerd door western blotting. MAP2, een dendritische marker, werd niet gedetecteerd in axonaal eiwit, terwijl axonale marker Tau1 is verrijkt in het axonale eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Dit protocol biedt een uitgebreide procedure om menselijke iPS-cel-afgeleide motorische zenuw organoïde te fabriceren door spontane assemblage van een robuuste bundel axonen uitgebreid van een sferoïde in een weefselkweekchip.

Driedimensionale motorische zenuw organoïde generatie

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protocol voor drie-dimensionale confocale Morfometrische Analyse van Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

Fiberverbindingen van de aanvullende motorruimte herzien: Methode van vezeldissectie, DTI en driedimensionale documentatie

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generatie en langdurig onderhoud van zenuwvrije<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Grootschalige driedimensionale beeldvorming van cellulaire organisatie in de Neocortex muis

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Driedimensionale vorm modellering en analyse van Hersenstructuren

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse voor de functionele evaluatie in het Rattenmodel van Sciatische Zenuwbrekerletsel

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Zuivering van fibroblasten en Schwann cellen van sensorische en motorische zenuwen in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...