Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 et 18K19903, Core-2-core program, et Beyond AI institute.

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	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

Dans le cadre de ce protocole, un brevet a été autorisé à Jiksak Bioengineering, Inc. qui a été fondée par Jiro Kawada.

Ce protocole décrit la formation d’un organoïde de nerf moteur (MNO) qui a un faisceau d’axone étendu à partir d’un sphéroïde de neurone moteur généré à partir des cellules humaines d’iPS. Le faisceau d’axons formé est épais, flexible et bien organisé dans les structures unidirectionnelles. En disséquant le faisceau d’axones, la protéine axonale et l’ARN de haute pureté peuvent être obtenus suffisamment pour des analyses biochimiques. L’activité neuronale peut être mesurée en faisceaux d’axone et en sphéroïdes avec imagerie calcique. La contamination des protéines nucléaires et dendritiques dans le lysate axonal n’a pas été détectée par le ballonnement occidental, démontrant que notre méthode séparait efficacement les axones des corps cellulaires et des dendrites.
Un des avantages de ce protocole est la différenciation rapide et la génération de MNO équipé d’un faisceau d’axons, dans lequel tous les processus peuvent être effectués en 4 semaines avec le protocole 3D et 5-6 semaines en utilisant le protocole 2D. Ceci est court par rapport à d’autres protocoles qui prennent généralement 3-4 semaines pour simplement différencier en MN des cellules souches embryonnaires et des cellules iPS17 et il faut 2-4 semaines supplémentaires pour obtenir l’allongement axonal. Le protocole 3D est généralement préféré au protocole 2D en raison du temps de différenciation plus court, de la diminution des étapes et de la réduction des risques techniques sans l’étape de dissociation par rapport au protocole 2D. La puce de culture tissulaire microfluidique a été conçue de manière à ce que les axones de MNS puissent s’allonger vers l’autre compartiment par le microcanal, ce qui facilite la formation d’un faisceau d’axones en induisant des interactions axo-axonales et des affinités entre les axones. En raison de la simple mise en place expérimentale, tous les protocoles décrits ici peuvent non seulement être exécutés par des bioingénieurs, qui sont familiers avec la manipulation d’une puce de culture tissulaire, mais aussi des biologistes et des neuroscientifiques qui ne sont pas familiers avec les microfluidiques et les techniques de microfabrication. Il convient de noter que les étapes 1 et 2 peuvent également être effectuées à l’aide d’un service de fabrication externe.
Une des étapes critiques pour accomplir le protocole est un changement séquentiel de milieu culturel. Il est conseillé de changer complètement le milieu de culture à chaque étape de la différenciation afin que les facteurs dans le milieu dépensé ne perturbent pas la différenciation MN. Un autre point critique de ce protocole est de maintenir les cellules iPS indifférenciées de bonne qualité. La qualité de la culture cellulaire iPS initiale affecte considérablement l’efficacité d’obtenir des neurones moteurs et MNO. Un autre point est que le diamètre du MNS doit être plus petit que la taille du trou de la puce (1,5 mm). Les sphéroïdes plus grands ne peuvent pas entrer dans la chambre, et éprouvent potentiellement la nécrose hypoxique grave dans la partie centrale. La taille des MNS peut être contrôlée en modifiant un nombre initial d’ensemencement de cellules iPS (en protocole 3D) ou de neurones moteurs (en protocole 2D). La densité d’ensemencement des cellules doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire iPS.
Des dispositifs microfluidiques compartimentés avec des microgrooves et de petits filtres à pores ont été largement utilisés pour séparer les axones des corps cellulaires et des dendrites. Cette technique peut également séparer les axones des corps cellulaires et le dendrite, avec une abondance supérieure d’axones dans les tissus groupés. Par rapport aux autres méthodes, une limitation majeure de cette méthode est qu’elle ne peut pas séparer deux médias culturels différents dans la conception actuelle de la puce de culture tissulaire, ce qui entrave la capacité de co-culture de deux cellules différentes qui nécessitent deux médias distincts. Une autre limitation est que la puce PDMS mis restriction prédéterminée sur la taille du tissu. Un sphéroïde plus grand que le trou ne peut pas entrer dans la chambre, et le faisceau d’axons ne peut pas devenir plus épais que la largeur du canal microfluidique.
Cette méthode peut être appliquée à d’autres types de neurones. Notre groupe a montré la capacité de modéliser un tractus cérébral en utilisant une méthode modifiée combinée avec des techniques organoïdescérébrales 18. Des sphéroïdes corticals ont été introduits dans les deux compartiments et les axones se sont spontanément allongés réciproquement vers chaque sphéroïde, et plus tard un faisceau d’axon s’est formé spontanément. En conséquence, deux sphéroïdes corticals peuvent être reliés par un faisceau d’axons, et le tissu pourrait être obtenu comme une seule pièce. Ceci démontre que l’approche est fortement polyvalente pour former des tissus de faisceau d’axone indépendamment des types neuronaux de cellules. Dans ce protocole, les cellules humaines d’iPS ont été employées, cependant, d’autres cellules souches comprenant les cellules humaines d’ES et les cellules souches neurales humaines peuvent être employées avec des modifications au protocole présenté. Les sphéroïdes 3D des neurones peuvent être générés par divers protocoles19,20. Cette méthode de fabrication de tissus avec un faisceau d’axons peut potentiellement être combinée à l’avenir avec les autres protocoles de différenciation pour la fabrication de sphéroïdes MN 3D. En outre, l’épaisseur et la longueur du faisceau d’axons peuvent être contrôlées en changeant simplement la largeur et la hauteur des microcanaux de la puce de culture tissulaire pour les développements futurs.
Nous croyons que ce protocole peut être utilisé pour le dépistage et le dépistage des drogues et peut contribuer à la compréhension des mécanismes sous-jacents au développement et aux maladies des fascicles d’axon.

Les neurones moteurs rachidiens (MN) étendent les axones aux muscles squelettiques pour contrôler le mouvement du corps. Leurs trajectoires axonales sont très organisées et réglementées dans le processus de développement. En dépit de beaucoup d’études sur l’extension d’axon et laconduite 1,des mécanismes pour la formation organisée de faisceau d’axon sont toujours à l’étude. Les axones des motoneurones sont souvent endommagés par des maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA)2, mais les mécanismes pathophysiologiques des dommages sur les fascicles d’axone sont mal compris. Ainsi, un modèle physiologique et pathologique pour récapituler la formation et la régression des faisceaux d’axons est nécessaire sur le terrain.
Un neurone moteur dérivé de cellules souches humaines est une plate-forme prometteuse pour comprendre le développement et les maladies telles que laSLA 3. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (cellules iPS) peuvent être utilisées pour modéliser les maladies à l’aide de cellules dérivées du patient. À ce jour, diverses méthodes de différenciation des cellules souches pluripotentes en MN ont étésignalées 4,5,6. Cependant, les axones des neurones dans la culture bidimensionnelle sont aléatoirement orientés et ne récapitulent pas le microenvironnement in vivo dans les nerfs en développement dans lesquels les axones sont unidirectionnelment assemblés par des interactions axo-axonales denses7. Pour surmonter ce problème, nous avons développé une technique pour générer un tissu tridimensionnel ressemblant au nerf moteur des cellules humaines d’iPS8,et avons nommé le tissu comme organoïde de nerf moteur (MNO). Le MNO se compose de corps cellulaires situés dans un sphéroïde de neurone moteur (MNS) et d’un fascicle axonal étendu hors du sphéroïde. Les axones du fascicle sont orientés de façon unidirectionnelle, ce qui ressemble à des axones dans le développement des nerfs moteurs. Par conséquent, les MNOs fournissent uniquement un microenvironnement axonal physiologique, qui n’a pas été fait par d’autres méthodes précédemment développées de culture neuronale.
Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour la fabrication de puces de culture de tissu, la différenciation rapide de neurone moteur, et la formation organoïde de nerf moteur dans les puces développées. Notre puce de culture tissulaire est très simple, et elle ne contient qu’un compartiment pour accepter un sphéroïde, un microcanal pour former un faisceau d’axons, et un compartiment pour loger les terminaux axons. L’appareil ne contient pas de structures complexes, y compris des microgrooves ou des filtres micropore qui sont souvent utilisés pour séparer les axones et les corps cellulaires partaille 9,10. Par conséquent, nos appareils peuvent être facilement fabriqués en suivant les étapes décrites dans ce protocole si une configuration de photolithographie est disponible.
La différenciation rapide des cellules iPS humaines est obtenue grâce à une combinaison optimisée de facteurs d’induction et de modelage (SB431542, LDN-193189, acide rétinoïque (RA) et de facteurs agonistes lissés (SAG)) et d’accélération (SU5402 et DAPT). Il a été rapporté que la combinaison de SU5402 et DAPT accélère la différenciation des neurones périphériques et des cellules de crêteneurale 11. Dans ce protocole, nous offrons trois méthodes différentes pour générer des MNOs, afin que les lecteurs puissent décider d’une méthode la plus adaptée à leurs besoins. Nous recommandons d’effectuer la différenciation des cellules iPS humaines après la formation d’un sphéroïde (la méthode 3D), puisque le MNS différencié peut être transféré directement dans une puce de culture tissulaire. Alternativement, les cellules iPS humaines peuvent être différenciées en neurones moteurs dans la culture monocouche (2D), puis créées en sphéroïdes tridimensionnels de neurone moteur comme nous l’avonsprécédemment rapporté 8. Nous avons mis à jour le protocole, et avec la méthode de différenciation tridimensionnelle décrite dans ce protocole, la transition de la 2D à la 3D peut être évitée et les MNOs peuvent être obtenus avec un temps de différenciation plus court, moins d’étapes et des risques techniques réduits sans l’étape de dissociation. Les neurones disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés pour générer du MNS afin de réduire le temps de différenciation.
Pour générer un MNO, nous avons cultivé un MNS dans la puce de culture tissulaire. Les axones s’allongent du sphéroïde et s’étendent dans le microcanal dans lequel les axones se rassemblent et s’alignent unidirectionnellement. Ceci facilite l’interaction axo-axonal et la formation spontanée d’un tissu unidirectionnel étroitement assemblé de faisceau des axones dans le microcanal, qui est particulièrement réalisé par ce protocole, alors que la formation spontanée de faisceau ou l’orientation axonale guidée seule peut être réaliséepar d’autres protocoles 12,13,14. Dans une expérience typique, peu de cellules migrent des sphéroïdes vers le microcanal et la plupart des cellules restent à proximité des sphéroïdes. Cette méthode permet aux axones d’être séparés spontanément des sphéroïdes sans utiliser de barrières physiques dépendantes de la taille (p. ex., microgrooves ou filtres à micropore) pour séparer les axones des corps cellulaires.
Le MNO qui en résulte peut faire l’objet de divers examens, y compris des analyses morphologiques, biochimiques et physiques. Le corps cellulaire et le faisceau étendu d’axons peuvent être physiquement isolés en coupant et peuvent être analysés séparément pour des expériences en aval, par exemple, des analyses biochimiques. Les matériaux biologiques, y compris l’ARN et les protéines, peuvent être isolés de quelques faisceaux d’axons pour des analyses biochimiques régulières, y compris la RT-PCR et le ballonnement occidental. Ici, nous décrivons un protocole pour générer des organoïdes de nerf moteur des cellules d’iPS, qui offre un modèle physiologique et pathologique attrayant pour étudier le mécanisme sous-jacent au développement et à la maladie des fascicles d’axon.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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three-dimensional motor nerve organoid generation

Un fascicle d’axones est l’un des principaux motifs structurels observés dans le système nerveux. La perturbation des fascicles d’axon pourrait causer des maladies développementales et neurodégénératives. Bien que de nombreuses études d’axones aient été menées, notre compréhension de la formation et du dysfonctionnement des fascicles d’axon est encore limitée en raison de l’absence de modèles in vitro tridimensionnels robustes. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour la génération rapide d’un organoïde de nerf moteur (MNO) des cellules pluripotentes induites par l’homme de tige (iPS) dans une puce microfluidique de culture de tissu. Tout d’abord, la fabrication des puces utilisées pour la méthode est décrite. À partir de cellules iPS humaines, un sphéroïde de neurone moteur (MNS) est formé. Ensuite, le MNS différencié est transféré dans la puce. Par la suite, les axones se développent spontanément à partir du sphéroïde et s’assemblent en un fascicle dans un microcanal équipé de la puce, qui génère un tissu MNO transportant un faisceau d’axones étendus à partir du sphéroïde. Pour l’analyse en aval, les ONM peuvent être retirés de la puce pour être fixés pour des analyses morphologiques ou disséqués pour des analyses biochimiques, ainsi que pour l’imagerie calcique et les enregistrements de réseaux d’électrodes multiples. Les ONN générés par ce protocole peuvent faciliter le dépistage et le dépistage des drogues et contribuer à la compréhension des mécanismes sous-jacents au développement et aux maladies des fascicles d’axon.

Les neurones moteurs ont été différenciés dans les 12 à 14 jours dans les procédures de différenciation 3D (figure 4 et figure 5). Fait important, plus de 60% des cellules ont exprimé le marqueur de neurone moteur HB9 pendant la différenciation. L’immunohistochimie a indiqué qu’approximativement 80% des cellules dans le MNS étaient des neurones moteurs SMI32-positifs. HB9 et SMI32 sont les marqueurs établis de neurones moteurs à un stadeprécoce 15,16. L’expression de HB9 et SMI32 sont les paramètres clés qui doivent être confirmés pour assurer l’identité cellulaire des neurones moteurs. Après l’introduction d’un MNS dans la puce de culture, les axones s’étendent dans le canal et un faisceau d’axons se forme. En raison de microcanaux servant de guides physiques, les axones s’allongent du MNS et forment un faisceau par interaction axo-axonale (Figure 6A). Il est essentiel de confirmer la formation du faisceau d’axons par observation microscopique pour confirmer la génération d’un MNO. Un MNO réussi porte un faisceau d’axons plus large que 50 μm et peu d’axones isolés hors du faisceau dans le canal. L’allongement initial des axones peut être observé 24 heures après l’introduction du sphéroïde. Dans les 3 à 4 jours suivants, les axones ont atteint le centre du microcanal, puis atteignent l’autre extrémité dans un délai supplémentaire de 10 jours (figure 6A). Par conséquent, les axones se sont assemblés et ont formé un faisceau droit et unidirectionnel en 2-3 semaines dans une puce, et des activités neuronales ont été observées par la suite.
Les organoïdes nerveux moteurs peuvent être prélevés sur la puce en détachant le PDMS du verre microscope pour analyse biologique (figure 6B). Les faisceaux d’axoons et les corps cellulaires peuvent être disséqués et isolés en coupant à l’aide d’un couteau chirurgical ou d’une pince à épiler au microscope (figure 6B). Ces matériaux biologiques, y compris l’ARN et les protéines, peuvent être utilisés pour des analyses biochimiques régulières telles que la RT-PCR et le ballonnement occidental. Dans les faisceaux d’axons d’ONN, les protéines nucléaires ou dendritiques ne sont pas détectées dans les ballonnements occidentaux (figure 6C).
En combinaison avec un indicateur de calcium (Fluo-4 AM), l’activité neuronale peut être capturée dans la puce de culture tissulaire. L’activité spontanée des neurones moteurs dans le sphéroïde et le faisceau d’axone ont été observées dans le MNO. En outre, les activités neuronales ont été observées à l’aide d’un système de réseau multi-électrodes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figure 1 : La dimension de la puce de culture tissulaire PDMS. (A) Photomask de la puce de culture tissulaire. (B) Dimensions du microcanal dans la puce de culture tissulaire. Le diamètre de la chambre de base pour tenir le sphéroïde de neurone moteur est de 2 mm et le trou de PDMS au-dessus de la chambre est de 1,5 mm. La largeur et la hauteur d’un microcanal faisant le pont entre deux chambres sont toutes deux de 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figure 2 : Illustration schématique de la différenciation des neurones moteurs. (A) Les étapes de différenciation ont impliqué l’induction neuronale, le modelage dans la lignée de neurone moteur, et la maturation des neurones moteurs. (B) Deux options pour créer des sphéroïdes neurones moteurs (MNS) à partir de cellules iPS: protocole 3D, et un protocole 2D avec étape de dissociation des neurones moteurs. Organoïde nerveux moteur (MNO) peut être obtenu par les deux protocoles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figure 3 : Protocole étape par étape pour le revêtement matriciel membranaire du sous-sol et l’introduction sphéroïde des neurones moteurs. (A) Revêtement matricielle membranaire du sous-sol dans le canal de la puce de culture tissulaire. (B) Introduction MNS dans le trou de la puce. (C) Changement de milieu culturel par aspiration de médium épuisé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figure 4 : Différenciation des neurones moteurs 2D et 3D. (A) Cours du temps de différenciation représentative 3D MNS (protocole 3D). La taille du MNS a progressivement augmenté au fil du temps. Barre d’échelle : 500 μm. (B) Cours du temps de différenciation 2D sur -D2, D0, D1, D6, D12 (protocole 2D). Barre d’échelle : 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figure 5 : Caractérisation des motoneurones. (A) (Gauche) Une cryosection d’un MNS taché d’anticorps SMI-32 et de DAPI. (Milieu) Une image de contraste de phase de MNS replaqué sur une surface matricielle de membrane de sous-sol- enduite. L’allongement axonal a été observé. (Droite) Axones de MNS replaqué souillés avec des anticorps Synapsin I et Tuj1. Barre d’échelle : 500 μm (gauche et milieu) et 50μm (droite). (B) Une image représentative des neurones moteurs 2D immunotachés avec des anticorps Tuj et HB9. Barre d’échelle : 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figure 6 : Caractérisation d’un organoïde nerveux moteur (MNO) généré dans une puce de culture. (A) Images représentatives de l’allongement de l’axon et de la formation épaisse de faisceaux d’axons sur D32. Barre d’échelle : 500 μm. (B) Immunostaining de l’organoïde de nerf moteur (MNO) par SMI-32 et DAPI. Les axones et les corps cellulaires peuvent être isolés en coupant physiquement. Barre d’échelle : 1 mm. (C) Pureté de la protéine des axones et des corps cellulaires quantifiés par ballonnement occidental. MAP2, un marqueur dendritique, n’a pas été détecté dans la protéine axonale, tandis que le marqueur axonal Tau1 est enrichi en protéine axonale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Ce protocole fournit une procédure complète pour fabriquer l’organoïde humain de nerf moteur iPS cellule-dérivée par l’assemblage spontané d’un faisceau robuste d’axones étendus d’un sphéroïde dans une puce de culture de tissu.

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