Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Diese Studie wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 und 18K19903, Core-2-Core-Programm und Beyond AI Institute unterstützt.

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In einem Teil dieses Protokolls wurde Jiksak Bioengineering, Inc., das von Jiro Kawada gegründet wurde, ein Patent lizenziert.

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung eines Motornervenorganoids (MNO), das ein Axonbündel hat, das aus einem motorischen Neuronensphäroid aus menschlichen iPS-Zellen ausgefahren wird. Das geformte Axonbündel ist dick, flexibel und in unidirektionalen Strukturen gut organisiert. Durch die Sezieren des Axonbündels können hochreines axonales Protein und RNA ausreichend für biochemische Analysen gewonnen werden. Die neuronale Aktivität kann in Axonbündeln und Sphäroiden mit Kalziumbildgebung gemessen werden. Eine Kontamination von kerntechnischen und dendritischen Proteinen im axonalen Lysat wurde durch westliches Blotting nicht nachgewiesen, was zeigt, dass unsere Methode Axone effizient von Zellkörpern und Dendriten trennte.
Einer der Vorteile dieses Protokolls ist die schnelle Differenzierung und Generierung von MNO mit einem Axonbündel, in dem alle Prozesse in 4 Wochen mit dem 3D-Protokoll und 5-6 Wochen mit dem 2D-Protokoll durchgeführt werden können. Dies ist kurz im Vergleich zu anderen Protokollen, die in der Regel 3-4 Wochen dauern, um einfach in MN von embryonalen Stammzellen und iPS-Zellen17 zu unterscheiden, und es dauert zusätzliche 2-4 Wochen, um axonale Dehnung zu erhalten. Das 3D-Protokoll wird aufgrund der kürzeren Differenzierungszeit, weniger Schritten und reduzierten technischen Risiken ohne den Dissoziationsschritt im Vergleich zum 2D-Protokoll in der Regel gegenüber dem 2D-Protokoll bevorzugt. Der mikrofluidische Gewebekulturchip wurde so konzipiert, dass sich die Axone von MNS durch den Mikrokanal zum anderen Fach hin ausziehen können, was die Bildung eines Bündels von Axonen erleichtert, indem axo-axonale Wechselwirkungen und Affinität zwischen Axonen induzieren. Aufgrund des einfachen Versuchsaufbaus können alle hier beschriebenen Protokolle nicht nur von Bioingenieuren durchgeführt werden, die mit der Manipulation eines Gewebekulturchips vertraut sind, sondern auch von Biologen und Neurowissenschaftlern, die mit Mikrofluidik und Mikrofabrikationstechniken nicht vertraut sind. Es sollte beachtet werden, dass die Schritte 1 und 2 auch mithilfe eines externen Fertigungsdienstes ausgeführt werden können.
Einer der entscheidenden Schritte zum Ausführen des Protokolls ist ein sequenzieller Wechsel des Kulturmediums. Es wird empfohlen, das Kulturmedium bei jedem Schritt während der Differenzierung vollständig zu ändern, damit Faktoren im verbrauchten Medium die MN-Differenzierung nicht stören. Ein weiterer kritischer Punkt dieses Protokolls ist die Aufrechterhaltung undifferenzierter iPS-Zellen in guter Qualität. Die Qualität der anfänglichen iPS-Zellkultur wirkt sich signifikant auf die Effizienz bei der Gewinnung von motorischen Neuronen und MNO aus. Ein weiterer Punkt ist, dass der Durchmesser von MNS kleiner sein sollte als die Größe der Bohrung des Chips (1,5 mm). Größere Sphäroide können nicht in die Kammer gelangen und können im Mittelteil eine schwere hypoxische Nekrose erleben. Die Größe von MNSs kann gesteuert werden, indem eine anfängliche Aussaatanzahl von iPS-Zellen (im 3D-Protokoll) oder motorischen Neuronen (im 2D-Protokoll) geändert wird. Die Sädichte der Zellen sollte für jede iPS-Zelllinie optimiert werden.
Unterteilte mikrofluidische Geräte mit Mikrorillen und kleinen Porenfiltern wurden häufig verwendet, um Axone von Zellkörpern und Dendriten zu trennen. Diese Technik kann auch Axone von Zellkörpern und Dendriten trennen, mit überlegener Fülle von Axonen in gebündeltem Gewebe. Im Vergleich zu den anderen Methoden besteht eine wesentliche Einschränkung dieser Methode darin, dass sie nicht zwei verschiedene Kulturmedien in der aktuellen Gestaltung des Gewebekulturchips trennen kann, was die Fähigkeit der Kokultur zweier unterschiedlicher Zellen behindert, die zwei unterschiedliche Medien erfordern. Eine weitere Einschränkung ist, dass der PDMS-Chip eine vorbestimmte Beschränkung der Größe des Gewebes vorgegeben hat. Ein Sphäroid, das größer als das Loch ist, kann nicht in die Kammer gelangen, und das Axonbündel kann nicht dicker als die Breite des mikrofluidischen Kanals werden.
Diese Methode kann auf andere Arten von Neuronen angewendet werden. Unsere Gruppe hat gezeigt, dass sie in der Lage ist, einen Zerebralparesetrakt mit einer modifizierten Methode in Kombination mit zerebralen Organoidtechniken zu modellieren18. Kortikale Sphäroide wurden in beide Fächer eingeführt und die Axone spontan wechselseitig zu jedem Sphäroid gestreckt, und in der Folge bildete sich spontan ein Axonbündel. Dadurch können zwei kortikale Sphäroide durch ein Axonbündel verbunden werden, und das Gewebe konnte als ein Stück erhalten werden. Dies zeigt, dass der Ansatz sehr vielseitig ist, um Axon-Bündelgewebe unabhängig von neuronalen Zelltypen zu bilden. In diesem Protokoll wurden menschliche iPS-Zellen verwendet, jedoch können andere Stammzellen, einschließlich menschlicher ES-Zellen und menschlicher neuronaler Stammzellen, mit Änderungen am vorgestellten Protokoll verwendet werden. 3D-Sphäroide von Neuronen können durch verschiedene Protokolle19,20erzeugt werden. Diese Methode der Herstellung von Geweben mit einem Axon-Bundle kann möglicherweise in Der Zukunft mit den anderen Differenzierungsprotokollen für die Herstellung von 3D MN Sphäroid kombiniert werden. Darüber hinaus können die Dicke und Länge des Axonbündels durch einfache Änderung der Breite und Höhe der Mikrokanäle des Gewebekulturchips für zukünftige Entwicklungen gesteuert werden.
Wir glauben, dass dieses Protokoll für Arzneimitteltests und -screenings verwendet werden kann und zum Verständnis der Mechanismen beitragen kann, die der Entwicklung und Denkkrankheiten von Axonfaszien zugrunde liegen.

Spinale motorische Neuronen (MN) erweitern Axone auf Skelettmuskeln, um die Körperbewegung zu steuern. Ihre axonalen Bahnen sind im Entwicklungsprozess hoch organisiert und reguliert. Trotz vieler Studien über Axonverlängerung und Anleitung1werden die Mechanismen für die organisierte Axonbündelbildung noch untersucht. Axone von motorischen Neuronen werden oft durch neurodegenerative Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS)2geschädigt, aber pathophysiologische Mechanismen der Schäden an Axonfascicles sind schlecht verstanden. Daher ist ein physiologisches und pathologisches Modell zur Rekapitulation der Axonbündelbildung und Regression im Feld erforderlich.
Ein menschliches, von Stammzellen abgeleitetes motores Neuron ist eine vielversprechende Plattform, um die Entwicklung und Krankheiten wie ALS3zu verstehen. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) können verwendet werden, um Krankheiten mit Patienten-abgeleiteten Zellen zu modellieren. Bis heute wurden verschiedene Differenzierungsmethoden von pluripotenten Stammzellen in MN4,5,6berichtet. Axone von Neuronen in zweidimensionaler Kultur sind jedoch zufällig orientiert und rekapitulieren nicht in vivo Mikroumgebung innerhalb sich entwickelnder Nerven, in denen Axone durch dichte axo-axonale Wechselwirkungen unidirektional zusammengesetzt werden7. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine Technik entwickelt, um ein dreidimensionales Gewebe zu erzeugen, das dem motorischen Nerv aus den menschlichen iPS-Zellen8ähnelt, und das Gewebe als Motornervenorganoid (MNO) bezeichnet. Das MNO besteht aus Zellkörpern, die sich in einem motorischen Neuronensphäroid (MNS) und einem axonalen Faszikel befinden, das aus dem Sphäroid ausgestreckt ist. Die Axone im Faszikel sind unidirektional ausgerichtet, was Axonen bei der Entwicklung von Motornerven ähnelt. Daher bieten MNOs auf einzigartige Weise eine physiologische axonale Mikroumgebung, was von keiner anderen zuvor entwickelten neuronalen Kulturmethode durchgeführt wurde.
In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden für die Gewebekultur-Chips-Herstellung, schnelle motorische Neurondifferenzierung und motorische Nervenorganoidbildung in entwickelten Chips. Unser Gewebekultur-Chip ist sehr einfach, und er enthält nur ein Fach zum Akzeptieren eines Sphäroids, einen Mikrokanal zur Bildung eines Axonbündels und ein Fach für das Gehäuse von Axonklemmen. Das Gerät enthält keine komplexen Strukturen, einschließlich Mikrogrooves oder Mikroporenfilter, die häufig verwendet werden, um Axone und Zellkörper nach Größe9,10zu trennen. Daher können unsere Geräte einfach hergestellt werden, indem Sie die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte befolgen, wenn ein Photolithographie-Setup verfügbar ist.
Eine schnelle Differenzierung menschlicher iPS-Zellen wird durch eine optimierte Kombination von Induzierenden und Musterfaktoren (SB431542, LDN-193189, Retinoinsäure (RA) und geglätteten Agonisten (SAG)) und Beschleunigungsfaktoren (SU5402 und DAPT) erreicht. Es wurde berichtet, dass die Kombination von SU5402 und DAPT die Differenzierung von peripheren Neuronen und neuronalen Kammzellenbeschleunigt 11. In diesem Protokoll bieten wir drei verschiedene Methoden zur Generierung von MNOs an, damit Leser sich für eine Methode entscheiden können, die ihren Bedürfnissen am besten entspricht. Wir empfehlen die Differenzierung menschlicher iPS-Zellen nach der Bildung eines Sphäroids (die 3D-Methode), da das differenzierte MNS direkt in einen Gewebekulturchip übertragen werden kann. Alternativ können menschliche iPS-Zellen in monolayer (2D)-Kultur in motorische Neuronen unterschieden und dann zu dreidimensionalen motorischen Neuronsphäroiden erzeugt werden, wie wir zuvor berichteten8. Wir haben das Protokoll aktualisiert, und mit der in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Differenzierungsmethode kann der Übergang von 2D zu 3D vermieden werden und MNOs können mit kürzerer Differenzierungszeit, weniger Schritten und reduzierten technischen Risiken ohne den Dissoziationsschritt erhalten werden. Kommerziell erhältliche Neuronen können auch verwendet werden, um MNS zu generieren, um die Zeit für differenzierung zu reduzieren.
Um ein MNO zu generieren, haben wir ein MNS im Gewebekulturchip kultiviert. Die Axone verlängern sich aus dem Sphäroid und erstrecken sich in den Mikrokanal, in dem sich Axone unidirektional sammeln und ausrichten. Dies erleichtert die axo-axonale Interaktion und spontane Bildung eines eng zusammengesetzten unidirektionalen Bündelgewebes von Axonen im Mikrokanal, das durch dieses Protokoll einzigartig erreicht wird, während entweder eine spontane Bündelbildung oder eine geführte axonale Orientierung allein durch andere Protokolle12,13,14erreicht werden kann. In einem typischen Experiment wandern nur wenige Zellen aus Sphäroiden zum Mikrokanal und die meisten Zellen bleiben in der Nähe von Sphäroiden. Diese Methode ermöglicht es, Axone spontan von den Sphäroiden zu trennen, ohne größenabhängige physikalische Barrieren (z. B. Mikronuten oder Mikroporenfilter) zu verwenden, um Axone von Zellkörpern zu trennen.
Das resultierende MNO kann verschiedenen Untersuchungen unterzogen werden, einschließlich morphologischer, biochemischer und physikalischer Analysen. Der Zellkörper und das verlängerte Axonbündel können durch Schneiden physikalisch isoliert und für nachgelagerte Experimente, z.B. biochemische Assays, separat analysiert werden. Biologische Materialien wie RNA und Protein können aus wenigen Axonbündeln für regelmäßige biochemische Tests wie RT-PCR und Western Blotting isoliert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Motornervenorganoid aus iPS-Zellen, das ein attraktives physiologisches und pathologisches Modell bietet, um den Mechanismus zu untersuchen, der der Entwicklung und Krankheit von Axonfascicles zugrunde liegt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Eine Faszikel von Axonen ist eines der wichtigsten strukturellen Motive im Nervensystem beobachtet. Eine Störung der Axonfaszien könnte entwicklungs- und neurodegenerative Erkrankungen verursachen. Obwohl zahlreiche Studien mit Axonen durchgeführt wurden, ist unser Verständnis der Bildung und Dysfunktion von Axonfascicles aufgrund des Mangels an robusten dreidimensionalen In-vitro-Modellen immer noch begrenzt. Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur schnellen Generierung eines Motornervenorganoids (MNO) aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) in einem mikrofluidischen Gewebekulturchip. Zunächst wird die Herstellung von Chips beschrieben, die für das Verfahren verwendet werden. Aus menschlichen iPS-Zellen wird ein motorischer Neuronsphäroid (MNS) gebildet. Als nächstes wird das differenzierte MNS in den Chip übertragen. Danach wachsen Axone spontan aus dem Sphäroid heraus und fügen sich in einem Mikrokanal, der im Chip ausgestattet ist, zu einem Faszikel zusammen, der ein MNO-Gewebe erzeugt, das ein Bündel von Axonen trägt, das aus dem Sphäroid ausgestreckt wird. Für die nachgelagerte Analyse können MNOs aus dem Chip entnommen werden, um für morphologische Analysen fixiert oder für biochemische Analysen sowie Kalzium-Bildgebung und Multi-Elektroden-Array-Aufnahmen seziert zu werden. Mit diesem Protokoll generierte MNOs können Arzneimitteltests und -screenings erleichtern und zum Verständnis der Mechanismen beitragen, die der Entwicklung und Erkrankungen von Axonfaszikeln zugrunde liegen.

Motorneuronen wurden innerhalb von 12-14 Tagen in 3D-Differenzierungsverfahren unterschieden (Abbildung 4 und Abbildung 5). Wichtig ist, dass mehr als 60% der Zellen während der Differenzierung den motorischen Neuronenmarker HB9 exprimiert haben. Die Immunhistochemie ergab, dass etwa 80% der Zellen im MNS SMI32-positive motorische Neuronen waren. HB9 und SMI32 sind die etablierten motorischen Neuronmarker im Frühstadium15,16. Die Expression von HB9 und SMI32 sind die wichtigsten Parameter, die bestätigt werden müssen, um die zelluläre Identität der motorischen Neuronen zu gewährleisten. Nach der Einführung eines MNS in den Kulturchip erstrecken sich Axone in den Kanal und ein Axonbündel bildet sich. Durch Mikrokanäle, die als physikalische Leitfäden dienen, erlängen sich Axone aus dem MNS und bilden ein Bündel durch axo-axonale Wechselwirkung (Abbildung 6A). Es ist wichtig, die Bildung des Axonbündels durch mikroskopische Beobachtung zu bestätigen, um die Erzeugung eines MNO zu bestätigen. Ein erfolgreiches MNO trägt ein Axonbündel, das breiter als 50 m ist, und wenige isolierte Axone aus dem Bündel im Kanal. Die anfängliche Dehnung der Axone kann 24 Stunden nach der Einführung des Sphäroids beobachtet werden. Innerhalb der nächsten 3-4 Tage erreichten die Axone die Mitte des Mikrokanals und erreichten dann innerhalb von weiteren 10 Tagen das andere Ende(Abbildung 6A). Folglich sammelten sich die Axone und bildeten ein gerades und unidirektionales Bündel in 2-3 Wochen in einem Chip, und danach wurden neuronale Aktivitäten beobachtet.
Motornervenorganoide können aus dem Chip gesammelt werden, indem das PDMS aus dem Mikroskopglas für die biologische Analyse abgelöst wird (Abbildung 6B). Axonbündel und Zellkörper können durch Schneiden mit einem chirurgischen Messer oder einer Pinzette unter dem Mikroskop seziert und isoliert werden (Abbildung 6B). Diese biologischen Materialien einschließlich RNA und Protein können für regelmäßige biochemische Tests wie RT-PCR und Western Blotting verwendet werden. In Axonbündeln von MNOs werden nukleare oder dendritische Herstellerproteine bei der westlichen Blotting nicht nachgewiesen (Abbildung 6C).
In Kombination mit einem Kalziumindikator (Fluo-4 AM) kann die neuronale Aktivität im Gewebekulturchip erfasst werden. Spontane Aktivität von motorischen Neuronen im Sphäroid und im Axonbündel wurde innerhalb des MNO beobachtet. Auch wurden die neuronalen Aktivitäten mit Hilfe eines Multi-Elektroden-Array-Systems beobachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Abbildung 1: Die Dimension des PDMS-Gewebekulturchips. (A) Fotomaske des Gewebekulturchips. (B) Abmessungen des Mikrokanals im Gewebekulturchip. Der Durchmesser der Basiskammer zum Halten des motorischen Neuronsphäroids beträgt 2 mm und das Loch von PDMS über der Kammer 1,5 mm. Die Breite und Höhe eines Mikrokanals, der zwei Kammern überbrückt, sind beide 150 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung der motorischen Neuronendifferenzierung. (A) Die Differenzierungsschritte beinhalteten die neuronale Induktion, die Musterung in die Motorneuronenlinie und die Reifung der motorischen Neuronen. (B) Zwei Optionen zum Erstellen von Motorneuronsphäroid (MNS) aus iPS-Zellen: 3D-Protokoll und ein 2D-Protokoll mit Dissoziationsschritt von motorischen Neuronen. Motornervenorganoid (MNO) kann durch beide Protokolle erhalten werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Abbildung 3: Schritt-für-Schritt-Protokoll für Keller-Membran-Matrix-Beschichtung und Motorneuron-Sphäroid-Einführung. (A) Kellermembran-Matrixbeschichtung im Kanal des Gewebekulturchips. (B) MNS-Einführung in das Loch des Chips. (C) Kulturmedium veränderung durch Streben nach erschöpftem Medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Abbildung 4: Differenzierung von 2D- und 3D-Motorneuronen. (A) Zeitverlauf der repräsentativen 3D-MNS-Differenzierung (3D-Protokoll). Die Größe des MNS nahm im Laufe der Zeit allmählich zu. Maßstabsleiste: 500 m. (B) Zeitverlauf der 2D-Differenzierung auf -D2, D0, D1, D6, D12 (2D-Protokoll). Maßstabsleiste: 500 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Abbildung 5: Charakterisierung der motorischen Neuronen. (A) (Links) Eine Kryosektion eines MNS, der mit SMI-32-Antikörper und DAPI gefärbt ist. (Mitte) Ein Phasenkontrastbild von neu beschichtetem MNS auf einer mit der Kellermembran beschichteten Oberfläche. Axonale Dehnung wurde beobachtet. (Rechts) Axone von replated MNS mit Synapsin I und Tuj1 Antikörpern gefärbt. Skalenbalken: 500 m (Links und Mitte) und 50 m (rechts). (B) Ein repräsentatives Bild von 2D-Motorneuronen, die mit Tuj- und HB9-Antikörpern immunostainiert sind. Maßstabsleiste: 200 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Abbildung 6: Charakterisierung eines Motornervenorganoids (MNO), das in einem Kulturchip erzeugt wird. (A) Repräsentative Bilder der Axondehnung und der dicken Axonbündelbildung auf D32. Maßstabsleiste: 500 m. (B) Immunostainierung des Motornervenorganoids (MNO) durch SMI-32 und DAPI. Axone und Zellkörper können durch physikalisch schneiden isoliert werden. Scale bar: 1 mm. (C) Reinheit des Proteins aus Axonen und Zellkörpern, quantifiziert durch western Blotting. MAP2, ein dendritischer Marker, wurde im axonalen Protein nicht nachgewiesen, während der axonale Marker Tau1 im axonalen Protein angereichert ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Dieses Protokoll bietet ein umfassendes Verfahren zur Herstellung des menschlichen iPS-Zell-abgeleiteten motorischen Nervenorganoids durch spontane Montage eines robusten Bündels von Axonen, das von einem Sphäroid in einem Gewebekulturchip erweitert wird.

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