Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
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इस अध्ययन को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) ग्रांट-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च 17H05661 और 18K19903, कोर-2-कोर प्रोग्राम और बियॉन्ड एआई इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित किया गया था।

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इस प्रोटोकॉल के हिस्से में, एक पेटेंट को जिक्साक बायोइंजीनियरिंग, इंक को लाइसेंस दिया गया है जिसकी स्थापना जिरो कावाड़ा द्वारा की गई थी।

यह प्रोटोकॉल एक मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड (MNO) के गठन का वर्णन करता है जिसमें मानव आईपीएस कोशिकाओं से उत्पन्न मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड से विस्तारित एक एक्सॉन बंडल होता है। गठित अक्षतंप बंडल एकदिशात्मक संरचनाओं में मोटी, लचीला और अच्छी तरह से संगठित है। अक्षतंश को विच्छेदन करके, उच्च शुद्धता वाले अक्षीय प्रोटीन और आरएनए को जैव रासायनिक विश्लेषणों के लिए पर्याप्त रूप से प्राप्त किया जा सकता है। न्यूरोनल गतिविधि को कैल्शियम इमेजिंग के साथ अक्षतंखों और गोलाकार में मापा जा सकता है। एक्सोनल लैसेट में परमाणु और डेंड्रिटिक प्रोटीन के संदूषण का पता पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा नहीं लगाया गया था, यह प्रदर्शित करता है कि हमारी विधि कुशलतापूर्वक कोशिका निकायों और डेंड्रिट्स से अक्षों को अलग करती है।
इस प्रोटोकॉल के फायदों में से एक एक्सॉन बंडल से लैस एमनो का तेजी से भेदभाव और उत्पादन है, जिसमें सभी प्रक्रियाओं को 3डी प्रोटोकॉल और 2डी प्रोटोकॉल का उपयोग करके 5-6 सप्ताह के साथ 4 सप्ताह में किया जा सकता है। यह अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में कम है जो आम तौर पर भ्रूणस्टेम कोशिकाओं और आईपीएस कोशिकाओं 17 से एमएन में अंतर करने के लिए3-4 सप्ताह लगते हैं और अक्षीय विस्तार प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त 2-4 सप्ताह लगते हैं। 2डी प्रोटोकॉल की तुलना में कम भेदभाव समय, कम चरणों और कम तकनीकी जोखिमों के कारण 3डी प्रोटोकॉल को आम तौर पर 2डी प्रोटोकॉल पर पसंद किया जाता है। माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित ऊतक संस्कृति चिप को इस तरीके से डिजाइन किया गया था ताकि एमएनएस के अक्षों को माइक्रोचैनल के माध्यम से दूसरे डिब्बे की ओर बढ़ाया जा सके, जो एक्सो-एक्सोनल इंटरैक्शन और एक्सॉन के बीच आत्मीयता को प्रेरित करके एक्सोन के बंडल के गठन की सुविधा प्रदान करता है। सरल प्रयोगात्मक सेट-अप के कारण, यहां वर्णित सभी प्रोटोकॉल न केवल बायोइंजीनर्स द्वारा किए जा सकते हैं, जो ऊतक संस्कृति चिप के हेरफेर से परिचित हैं, बल्कि जीवविज्ञानी और न्यूरोसाइंटिस्ट भी हैं जो माइक्रोफ्लुइडिक्स और माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों से परिचित नहीं हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बाहरी निर्माण सेवा का उपयोग करके चरण 1 और 2 भी किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण कदमों में से एक संस्कृति माध्यम का अनुक्रमिक परिवर्तन है । यह सलाह दी जाती है कि भेदभाव के दौरान प्रत्येक चरण में संस्कृति माध्यम को पूरी तरह से बदल दिया जाए ताकि खर्च किए गए माध्यम के कारक एमएन भेदभाव को परेशान न करें। इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण बिंदु अच्छी गुणवत्ता में अविभेदित आईपीएस कोशिकाओं को बनाए रखना है। प्रारंभिक आईपीएस सेल संस्कृति की गुणवत्ता मोटर न्यूरॉन्स और MNO प्राप्त करने के लिए दक्षता को काफी प्रभावित करती है। एक और बात यह है कि एमएनएस का व्यास चिप (1.5 मिमी) के छेद के आकार से छोटा होना चाहिए। बड़े स्फेरॉइड कक्ष में प्रवेश नहीं कर सकते हैं, और संभावित रूप से केंद्र भाग में गंभीर हाइपोक्सिक नेक्रोसिस का अनुभव करते हैं। एमएनएस के आकार को आईपीएस कोशिकाओं (3डी प्रोटोकॉल में) या मोटर न्यूरॉन्स (2डी प्रोटोकॉल में) की प्रारंभिक सीडिंग संख्या को बदलकर नियंत्रित किया जा सकता है। कोशिकाओं के सीडिंग घनत्व प्रत्येक आईपीएस सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
माइक्रोग्रूव्स और छोटे पोर फिल्टर के साथ कंपार्टमेंटलाइज्ड माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का व्यापक रूप से सेल निकायों और डेंड्राइट्स से एक्सोन को अलग करने के लिए उपयोग किया गया है। यह तकनीक बंडल ऊतकों में एक्सॉन की बेहतर बहुतायत के साथ सेल निकायों और डेंड्राइट से एक्सॉन को भी अलग कर सकती है। अन्य तरीकों की तुलना में, इस विधि की एक प्रमुख सीमा यह है कि यह ऊतक संस्कृति चिप के वर्तमान डिजाइन में दो अलग-अलग संस्कृति मीडिया को अलग नहीं कर सकता है, जो दो अलग-अलग कोशिकाओं की सह-संस्कृति की क्षमता में बाधा डालता है जिसके लिए दो अलग-अलग मीडिया की आवश्यकता होती है। एक और सीमा यह है कि पीडीएमएस चिप ऊतक के आकार पर पूर्व निर्धारित प्रतिबंध डाल दिया । छेद से बड़ा एक गोलाकार कक्ष में प्रवेश नहीं कर सकता है, और अक्षतंप बंडल माइक्रोफ्लुइडिक चैनल की चौड़ाई से मोटा नहीं हो सकता है।
इस विधि को अन्य प्रकार के न्यूरॉन्स पर लागू किया जा सकता है। हमारे समूह ने सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड तकनीकों के साथ संयुक्त विधि का उपयोग करके सेरेब्रल ट्रैक्ट को मॉडल करने की क्षमता दिखाई है18 कॉर्टिकल स्फेरॉइड दोनों डिब्बों में पेश किए गए थे और एक्सोन अनायास प्रत्येक स्फेरॉइड की ओर पारस्परिक रूप से विस्तारित होते थे, और बाद में एक अक्षतंप बंडल अनायास ही बनता था। नतीजतन, दो कॉर्टिकल गोलाकार एक एक्सॉन बंडल के माध्यम से जोड़ा जा सकता है, और ऊतक को एक टुकड़े के रूप में प्राप्त किया जा सकता है। यह दर्शाता है कि दृष्टिकोण न्यूरोनल सेल प्रकारों की परवाह किए बिना एक्सोन बंडल ऊतकों को बनाने के लिए अत्यधिक बहुमुखी है। इस प्रोटोकॉल में, मानव आईपीएस कोशिकाओं का उपयोग किया गया था, हालांकि, मानव ईएस कोशिकाओं और मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं सहित अन्य स्टेम कोशिकाओं का उपयोग प्रस्तुत प्रोटोकॉल में संशोधनों के साथ किया जा सकता है। न्यूरॉन्स के 3डी गोलाकार विविध प्रोटोकॉल19,20द्वारा उत्पन्न किए जा सकते हैं । एक्सॉन बंडल के साथ ऊतकों को बनाने की इस विधि को भविष्य में 3डी एमएन स्फेरॉइड बनाने के लिए अन्य भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, एक्सॉन बंडल की मोटाई और लंबाई को भविष्य के विकास के लिए ऊतक संस्कृति चिप के माइक्रोचैनल की चौड़ाई और ऊंचाई को बदलकर नियंत्रित किया जा सकता है।
हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग दवा परीक्षण और स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है और यह अक्षों के फैक्स के विकास और रोगों में अंतर्निहित तंत्र की समझ में योगदान दे सकता है ।

स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स (एमएन) शरीर की गति को नियंत्रित करने के लिए कंकाल की मांसपेशियों को एक्सोन का विस्तार करता है। उनके अक्षीय प्रक्षेप पथ विकास प्रक्रिया में अत्यधिक संगठित और विनियमित होते हैं । अक्षत विस्तार और मार्गदर्शन1पर कई अध्ययनों के बावजूद, संगठित अक्षतंश बंडल गठन के लिए तंत्र अभी भी जांच के अधीन हैं। मोटर न्यूरॉन्स के एक्सॉन अक्सर न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) 2 से क्षतिग्रस्तहोतेहैं, लेकिन एक्सॉन फासिकल्स पर नुकसान के रोगविज्ञानी तंत्र खराब समझ जाते हैं। इस प्रकार, क्षेत्र में एक्सॉन बंडल गठन और प्रतिगमन को फिर से शुरू करने के लिए एक शारीरिक और रोग मॉडल की आवश्यकता होती है।
एक मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन एएलएस3जैसे विकास और बीमारियों को समझने के लिए एक आशाजनक मंच है। मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस कोशिकाओं) रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग कर रोगों मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आज तक, बहुलपके स्टेम कोशिकाओं से एमएन में विभिन्न विभेदन विधियों की सूचना दी गई है4,5,6। हालांकि, दो आयामी संस्कृति में न्यूरॉन्स के अक्षों बेतरतीब ढंग से उन्मुख होते हैं और विकासशील नसों के भीतर वीवो माइक्रोएनवायरमेंट में पुनः रीकैपिटल नहीं होते हैं जिसमें अक्षों को एकदिशात्मक रूप से घने अक्षीय रूप से इकट्ठा किया जाता है7। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, हमने मानव आईपीएस कोशिकाओं8से मोटर तंत्रिका जैसी त्रि-आयामी ऊतक उत्पन्न करने के लिए एक तकनीक विकसित की है, और ऊतक को मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड (MNO) के रूप में नामित किया है। MNO सेल एक मोटर न्यूरॉन स्पेरोइड (एमएनएस) में स्थित निकायों और एक अक्षीय fascicle स्फेरॉइड से बाहर बढ़ाया होते हैं । फेसिकल में एक्सॉन एकदिशात्मक रूप से उन्मुख होते हैं, जो मोटर नसों के विकास में अक्षों जैसा दिखता है। इसलिए, एमएनओ विशिष्ट रूप से एक शारीरिक अक्षीय माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान करते हैं, जो किसी अन्य पहले विकसित न्यूरोनल संस्कृति विधियों द्वारा नहीं किया गया था।
इस प्रोटोकॉल में, हम विकसित चिप्स में ऊतक संस्कृति चिप्स निर्माण, रैपिड मोटर न्यूरॉन भेदभाव, और मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड गठन के तरीकों का वर्णन करते हैं। हमारे ऊतक संस्कृति चिप बहुत सरल है, और यह केवल एक गोलाकार, एक अक्षतंश बनाने के लिए एक माइक्रोचैनल, और आवास अक्षतंप टर्मिनलों के लिए एक डिब्बे को स्वीकार करने के लिए एक डिब्बे शामिल हैं । इस उपकरण में माइक्रोग्रोव या माइक्रोपोर फिल्टर सहित जटिल संरचनाएं नहीं हैं जिनका उपयोग अक्सर9,10के आकार के अक्षों और कोशिका निकायों को अलग करने के लिए किया जाता है । इसलिए हमारे उपकरणों को आसानी से इस प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों का पालन करके गढ़ा जा सकता है अगर एक फोटोलिथोग्राफी सेटअप उपलब्ध है ।
मानव आईपीएस कोशिकाओं का तेजी से भेदभाव उत्प्रेरण और पैटर्निंग कारकों (SB431542, एलडीएन-193189, रेटिनोइक एसिड (आरए), और चिकनी एगोनिस्ट (एसएजी)) और त्वरण कारकों (SU5402 और DAPT) के अनुकूलित संयोजन के साथ हासिल किया जाता है। यह सूचित किया गया है कि SU5402 और DAPT के संयोजन से परिधीय न्यूरॉन्स और तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं के भेदभाव में तेजी आती है11. इस प्रोटोकॉल में, हम एमएनओ उत्पन्न करने के लिए तीन अलग-अलग तरीके प्रदान करते हैं, ताकि पाठक अपनी आवश्यकताओं के लिए सबसे उपयुक्त विधि पर निर्णय ले सकें। हम एक स्फेरॉइड (3डी विधि) बनाने के बाद मानव आईपीएस कोशिकाओं के भेदभाव को करने की सलाह देते हैं, क्योंकि विभेदित एमएनएस को सीधे ऊतक संस्कृति चिप में स्थानांतरित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, मानव आईपीएस कोशिकाओं को मोनोलेयर (2D) संस्कृति में मोटर न्यूरॉन्स में विभेदित किया जा सकता है, और फिर त्रि-आयामी मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड में बनाया जा सकता है जैसा कि हमने पहले8रिपोर्ट की थी। हमने प्रोटोकॉल को अपडेट किया है, और इस प्रोटोकॉल में वर्णित त्रि-आयामी भेदभाव विधि के साथ, 2D से 3 डी तक संक्रमण से बचा जा सकता है और एमएनओ को कम भेदभाव समय, कम कदमों और कम तकनीकी जोखिमों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध न्यूरॉन्स भी भेदभाव के लिए समय को कम करने के लिए MNS उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
एक MNO उत्पन्न करने के लिए, हम ऊतक संस्कृति चिप में एक एमएनएस सुसंस्कृत। एक्सोन स्पेरोइड से बढ़ जाते हैं और माइक्रोचैनल में विस्तारित होते हैं जिसमें अक्षों को इकट्ठा किया जाता है और एकदिशात्मक रूप से संरेखित किया जाता है। यह सूक्ष्मचैनल में एक्सोन के कसकर इकट्ठे किए गए एकिश्शियन बंडल ऊतक के एक्सो-एक्सोनल इंटरैक्शन और सहज गठन की सुविधा प्रदान करता है, जो इस प्रोटोकॉल द्वारा विशिष्ट रूप से प्राप्त किया जाता है, जबकि या तो सहज बंडल गठन या निर्देशित अक्षीय अभिविन्यास अकेले अन्य प्रोटोकॉल12,13,14द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। एक विशिष्ट प्रयोग में, कुछ कोशिकाएं गोलाकार से माइक्रोचैनल में माइग्रेट होती हैं और अधिकांश कोशिकाएं पास के स्फेरॉइड रहती हैं। यह विधि कोशिका निकायों से एक्सोन को अलग करने के लिए आकार-निर्भर शारीरिक बाधाओं (जैसे, माइक्रोग्रूव्स या माइक्रोपोर फिल्टर) का उपयोग किए बिना एक्सोन को अनायास स्फेरॉइड से अलग करने की अनुमति देती है।
परिणामी MNO को विभिन्न परीक्षाओं के अधीन किया जा सकता है, जिसमें रूपात्मक, जैव रासायनिक और शारीरिक विश्लेषण शामिल हैं। सेल शरीर और विस्तारित एक्सॉन बंडल को काटने से शारीरिक रूप से अलग किया जा सकता है और डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए अलग से विश्लेषण किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, जैव रासायनिक परख। आरएनए और प्रोटीन सहित जैविक सामग्रियों को आरटी-पीसीआर और पश्चिमी ब्लॉटिंग सहित नियमित जैव रासायनिक परख के लिए कुछ एक्सॉन बंडलों से अलग किया जा सकता है। यहां, हम आईपीएस कोशिकाओं से मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो एक्सॉन फैक्स के अंतर्निहित विकास और रोग का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक शारीरिक और रोग मॉडल प्रदान करता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

एक्सॉन का एक फासिकल तंत्रिका तंत्र में देखे जाने वाले प्रमुख संरचनात्मक रूपांकनों में से एक है। एक्सोन फासिक्स के व्यवधान से विकासात्मक और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियां हो सकती हैं। यद्यपि एक्सॉन के कई अध्ययन किए गए हैं, लेकिन एक्सॉन फैक्स के गठन और शिथिलता की हमारी समझ अभी भी मजबूत त्रि-आयामी इन विट्रो मॉडल की कमी के कारण सीमित है। यहां, हम माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित ऊतक संस्कृति चिप में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं से एक मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड (MNO) की तेजी से उत्पादन के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, विधि के लिए उपयोग किए जाने वाले चिप्स के निर्माण का वर्णन किया गया है। मानव आईपीएस कोशिकाओं से, एक मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड (एमएनएस) बनता है। इसके बाद, विभेदित एमएनएस को चिप में स्थानांतरित कर दिया जाता है। इसके बाद, एक्सॉन अनायास स्पेरोइड से बाहर निकलते हैं और चिप में सुसज्जित माइक्रोचैनल के भीतर एक फैक्सल में इकट्ठा होते हैं, जो स्पफेरोइड से विस्तारित एक्सॉन के बंडल को ले जाने वाले MNO ऊतक उत्पन्न करता है। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए, एमएनएनओ को चिप से बाहर निकाला जा सकता है, जो जैव रासायनिक विश्लेषणों के साथ-साथ कैल्शियम इमेजिंग और मल्टी-इलेक्ट्रोड सरणी रिकॉर्डिंग के लिए रूपात्मक विश्लेषणों के लिए तय किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न एमएनओ दवा परीक्षण और स्क्रीनिंग की सुविधा दे सकते हैं और अक्षों के फैक्स के विकास और रोगों में अंतर्निहित तंत्र की समझ में योगदान कर सकते हैं।

मोटर न्यूरॉन्स 3 डी भेदभाव प्रक्रियाओं (चित्रा 4 और चित्रा 5)में12-14 दिनों के भीतर विभेदित किया गया । महत्वपूर्ण बात, कोशिकाओं के ६०% से अधिक भेदभाव के दौरान मोटर न्यूरॉन मार्कर HB9 व्यक्त की । इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से पता चला कि एमएनएस में लगभग 80% कोशिकाएं SMI32-पॉजिटिव मोटर न्यूरॉन्स थीं। एचबी9 और SMI32 स्थापित प्रारंभिक चरण मोटर न्यूरॉन मार्कर15,16हैं । एचबी9 और SMI32 की अभिव्यक्ति प्रमुख पैरामीटर हैं जिन्हें मोटर न्यूरॉन्स की सेलुलर पहचान सुनिश्चित करने के लिए पुष्टि करने की आवश्यकता है। संस्कृति चिप में एक एमएनएस की शुरूआत के बाद, अक्षतंप चैनल और एक अक्षतंप बंडल रूपों में विस्तार । भौतिक गाइड के रूप में सेवारत माइक्रोचैनल के कारण, एमसीएन एमएनएस से बढ़कर एक्सो-एक्सोनल इंटरैक्शन(चित्रा 6A)द्वारा एक बंडल बनाते हैं। MNO की पीढ़ी की पुष्टि करने के लिए सूक्ष्म अवलोकन द्वारा अक्षतंप बंडल के गठन की पुष्टि करना आवश्यक है। एक सफल MNO चैनल में बंडल से बाहर ५० μm और कुछ अलग अक्षों से व्यापक एक अक्षतंतरी बंडल भालू । एक्सोन की प्रारंभिक विस्तार स्फेरॉइड की शुरुआत के 24 घंटे बाद देखा जा सकता है। अगले 3-4 दिनों के भीतर, अक्षतंवर माइक्रोचैनल के केंद्र तक पहुंच गया और फिर एक अतिरिक्त 10 दिनों(चित्रा 6A)के भीतर दूसरे छोर तक पहुंचता है। नतीजतन, अक्षतंप इकट्ठे हुए और एक चिप में 2-3 सप्ताह में एक सीधे और एकदिशात्मक बंडल का गठन किया, और उसके बाद न्यूरोनल गतिविधियों को देखा गया।
मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड को जैविक विश्लेषण(चित्रा 6B)के लिए माइक्रोस्कोप ग्लास से पीडीएमएस को अलग करके चिप से एकत्र किया जा सकता है। एक्सोन बंडलों और सेल निकायों को माइक्रोस्कोप(चित्रा 6B)के नीचे सर्जिकल चाकू या चिमटी का उपयोग करके काटकर अलग किया जा सकता है। आरएनए और प्रोटीन सहित इन जैविक सामग्रियों का उपयोग नियमित जैव रासायनिक परख जैसे आरटी-पीसीआर और पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए किया जा सकता है। एमएनओ के अक्षतंशों में वेस्टर्न ब्लॉटिंग(चित्रा 6सी)में न्यूक्लियर या डेंड्रिटिक मेकर प्रोटीन का पता नहीं लगाया जाता है।
कैल्शियम इंडिकेटर (फ्लू-4 एएम) के संयोजन में, टिश्यू कल्चर चिप में न्यूरोनल गतिविधि को कैप्चर किया जा सकता है। स्पेरोइड और एक्सोन बंडल में मोटर न्यूरॉन्स की सहज गतिविधि MNO के भीतर देखी गई। इसके अलावा, बहु-इलेक्ट्रोड सरणी प्रणाली का उपयोग करके तंत्रिका गतिविधियों को देखा गया।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> चित्रा 1: पीडीएमएस ऊतक संस्कृति चिप का आयाम। }टिश्यू कल्चर चिप का फोटोमास्क। (ख)टिश्यू कल्चर चिप में माइक्रोचैनल के आयाम। मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड रखने के लिए बेस चैंबर का व्यास 2 मिमी है और चैंबर के ऊपर पीडीएमएस का छेद 1.5 मिमी है। दो कक्षों को पाटने वाले माइक्रोचैनल की चौड़ाई और ऊंचाई दोनों 150 माइक्रोन हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> चित्रा 2: मोटर न्यूरॉन भेदभाव का योजनाबद्ध चित्रण। (क)विभेदन चरणों में तंत्रिका प्रेरण, मोटर न्यूरॉन वंश में पैटर्निंग और मोटर न्यूरॉन्स की परिपक्वता शामिल थी । (ख)आईपीएस कोशिकाओं से मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड (एमएनएस) बनाने के लिए दो विकल्प: 3डी प्रोटोकॉल, और मोटर न्यूरॉन्स के वियोजन चरण के साथ एक 2डी प्रोटोकॉल। मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड (MNO) दोनों प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> चित्रा 3: बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग और मोटर न्यूरॉन स्फेरॉइड परिचय के लिए कदम से कदम प्रोटोकॉल। (A)टिश्यू कल्चर चिप के चैनल में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग। (ख)एमएनएस चिप के छेद में परिचय । (ग)समाप्त माध्यम की आकांक्षा से संस्कृति माध्यम परिवर्तन । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> चित्रा 4: 2D और 3D मोटर न्यूरॉन भेदभाव। (A)प्रतिनिधि 3डी एमएनएस विभेदन (3 डी प्रोटोकॉल) का समय पाठ्यक्रम। समय के साथ मनसे का आकार धीरे-धीरे बढ़ता गया। स्केल बार: 500 माइक्रोन। (ख) -D2, D0, D1, D6, D12 (2D प्रोटोकॉल) पर 2डी भेदभाव का समय पाठ्यक्रम। स्केल बार: 500 माइक्रोन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> चित्रा 5: मोटर न्यूरॉन्स का लक्षण वर्णन। (A)(बाएं) एसएमआई-३२ एंटीबॉडी और DAPI के साथ दाग एक एमएनएस का एक क्रायोसेक्शन । (मध्य) एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित सतह पर replated MNS की एक चरण के विपरीत छवि । एक्सोनल एल्गेशन मनाया गया। (दाएं) सिनैपसिन I और Tuj1 एंटीबॉडी के साथ दाग वाले एमएनएस के एक्सॉन। स्केल बार: 500 माइक्रोन (बाएं और मध्य) और 50μm (दाएं)। (ख)2डी मोटर न्यूरॉन्स की एक प्रतिनिधि छवि तुज और एचबी9 एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोडांग । स्केल बार: 200 माइक्रोन। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> चित्रा 6: संस्कृति चिप में उत्पन्न मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड (MNO) का लक्षण वर्णन। (A)D32 पर अक्षत विस्तार और मोटी अक्षतंपन बंडल गठन की प्रतिनिधि छवियां । स्केल बार: 500 माइक्रोन। (ख)स्मिया-32 और डीएपीआई द्वारा मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड (एमएनओ) का इम्यूनोस्टेटिंग। एक्सॉन और सेल निकायों को शारीरिक रूप से काटने से अलग किया जा सकता है। स्केल बार: 1 मिमी(C)एक्सोन और सेल निकायों से प्रोटीन की शुद्धता पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा निर्धारित। MAP2, एक डेंड्रिटिक मार्कर, अक्षीय प्रोटीन में पता नहीं चला था, जबकि अक्षीय मार्कर Tau1 अक्षीय प्रोटीन में समृद्ध है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

यह प्रोटोकॉल एक ऊतक संस्कृति चिप में एक गोलाकार से विस्तारित एक्सोन के एक मजबूत बंडल की सहज असेंबली के माध्यम से मानव आईपीएस सेल-व्युत्पन्न मोटर तंत्रिका ऑर्गेनॉइड बनाने के लिए एक व्यापक प्रक्रिया प्रदान करता है।

त्रि-आयामी मोटर नर्व ऑर्गेनॉइड जनरेशन

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

मोटर तंत्रिका transection और लाइव Zebrafish में Glial सेल व्यवहार के समय चूक इमेजिंग

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes की तीन आयामी Confocal morphometric विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

तीन आयामी इमेजिंग और मानव Intraepidermal तंत्रिका तंतुओं के भीतर Mitochondria का विश्लेषण

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

पूरक मोटर क्षेत्र की फाइबर कनेक्शन पर दोबारा गौर किया गया: फाइबर विच्छेदन, डीटीआई, और तीन आयामी दस्तावेजों का कार्यप्रणाली

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

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नर्व-मुक्त के निर्माण और दीर्घकालिक रखरखाव<em&gt; हाइड्रा</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

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An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

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The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

त्रि-आयामी आकार मॉडलिंग और मस्तिष्क संरचनाओं का विश्लेषण

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

सिस्टिक तंत्रिका क्रश चोट के चूहे मॉडल में कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए 3 डी काइनेमेटिक विश्लेषण

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

विट्रो में संवेदी और मोटर नसों से फाइब्रोब्लास्ट और श्वार्न कोशिकाओं का शुद्धिकरण

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...