Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Questo studio è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 e 18K19903, dal programma Core-2-core e dall'istituto Beyond AI.

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

In parte di questo protocollo, un brevetto è stato concesso in licenza a Jiksak Bioengineering, Inc.

Questo protocollo descrive la formazione di un organoide del nervo motorio (MNO) che ha un fascio di assoni esteso da uno sferoide del motoneurone generato da cellule iPS umane. Il fascio di assoni formato è spesso, flessibile e ben organizzato in strutture unidirezionali. Sezionando il fascio di assoni, la proteina assonale ad alta purezza e l'RNA possono essere ottenuti a sufficienza per le analisi biochimiche. L'attività neuronale può essere misurata in fasci di assioni e sferoidi con imaging del calcio. La contaminazione delle proteine nucleari e dendritiche nel lisato assonale non è stata rilevata dall'assorbimento occidentale, dimostrando che il nostro metodo separava efficacemente gli assoni dai corpi cellulari e dai dendriti.
Uno dei vantaggi di questo protocollo è la rapida differenziazione e generazione di MNO dotato di un bundle axon, in cui tutti i processi possono essere eseguiti in 4 settimane con il protocollo 3D e 5-6 settimane utilizzando il protocollo 2D. Questo è breve rispetto ad altri protocolli che in genere richiedono 3-4 settimane per differenziarsi semplicemente in MN dalle cellule staminali embrionali e dalle cellule iPS17 e ci vogliono altre 2-4 settimane per ottenere l'allungamento assonale. Il protocollo 3D è generalmente preferito rispetto al protocollo 2D a causa del tempo di differenziazione più breve, meno passaggi e rischi tecnici ridotti senza il passaggio di dissociazione rispetto al protocollo 2D. Il chip di coltura tissutale a base microfluidica è stato progettato in modo che gli assoni di MNS possano allungarsi verso l'altro compartimento attraverso il microcanale, il che facilita la formazione di un fascio di assoni inducendo interazioni asso-assonali e affinità tra assoni. A causa del semplice set-up sperimentale, tutti i protocolli qui descritti possono essere eseguiti non solo dai bioingegneri, che hanno familiarità con la manipolazione di un chip di coltura tissutale, ma anche da biologi e neuroscienziati che non hanno familiarità con le tecniche di microfluidica e microfabbricazione. Va notato che i passaggi 1 e 2 possono essere eseguiti anche utilizzando un servizio di fabbricazione esterno.
Uno dei passaggi critici per realizzare il protocollo è un cambiamento sequenziale del mezzo di coltura. Si consiglia di cambiare completamente il mezzo di coltura ad ogni fase durante la differenziazione in modo che i fattori nel mezzo speso non disturbino la differenziazione MN. Un altro punto critico di questo protocollo è mantenere le celle iPS indifferenziate in buona qualità. La qualità della coltura cellulare iPS iniziale influisce significativamente sull'efficienza per ottenere motoneuroni e MNO. Un altro punto è che il diametro di MNS dovrebbe essere inferiore alle dimensioni del foro del truciolo (1,5 mm). Gli sferoidi più grandi non possono entrare nella camera e potenzialmente sperimentano una grave necrosi ipossia nella parte centrale. La dimensione degli MNS può essere controllata modificando un numero iniziale di seeding di cellule iPS (nel protocollo 3D) o motoneuroni (nel protocollo 2D). La densità di semina delle cellule deve essere ottimizzata per ogni linea cellulare iPS.
Dispositivi microfluidici compartimentati con microgroovi e piccoli filtri porosi sono stati ampiamente utilizzati per separare gli assoni dai corpi cellulari e dai dendriti. Questa tecnica può anche separare gli assoni dai corpi cellulari e dalla dendrite, con un'abbondanza superiore di assoni nei tessuti raggruppati. Rispetto agli altri metodi, una delle principali limitazioni di questo metodo è che non può separare due diversi mezzi di coltura nell'attuale progettazione del chip di coltura tissutale, che ostacola la capacità di co-coltura di due cellule diverse che richiedono due mezzi distinti. Un'altra limitazione è che il chip PDMS ha posto restrizioni predeterminate sulle dimensioni del tessuto. Uno sferoide più grande del foro non può entrare nella camera, e il fascio di assoni non può diventare più spesso della larghezza del canale microfluidico.
Questo metodo può essere applicato ad altri tipi di neuroni. Il nostro gruppo ha dimostrato di essere in grado di modellare un tratto cerebrale utilizzando un metodo modificato combinato con le tecniche organoidicerebrali 18. Gli sferoidi corticali furono introdotti in entrambi i compartimenti e gli assoni si allungarono spontaneamente reciprocamente verso ogni sferoide, e successivamente un fascio di assoni si formò spontaneamente. Di conseguenza, due sferoidi corticali possono essere collegati attraverso un fascio di assoni, e il tessuto potrebbe essere ottenuto come un unico pezzo. Ciò dimostra che l'approccio è altamente versatile per formare tessuti a fascio di assoni indipendentemente dai tipi di cellule neuronali. In questo protocollo, le cellule iPS umane sono state utilizzate, tuttavia, altre cellule staminali tra cui cellule ES umane e cellule staminali neurali umane possono essere utilizzate con modifiche al protocollo presentato. Gli sferoidi 3D dei neuroni possono essere generati da diversiprotocolli 19,20. Questo metodo di produzione di tessuti con un fascio di assoni può potenzialmente essere combinato in futuro con gli altri protocolli di differenziazione per la produzione di sferoide MN 3D. Inoltre, lo spessore e la lunghezza del fascio di assoni possono essere controllati semplicemente cambiando la larghezza e l'altezza dei microcanali del chip di coltura tissutale per sviluppi futuri.
Riteniamo che questo protocollo possa essere utilizzato per il test e lo screening dei farmaci e possa contribuire alla comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo e delle malattie dei fascicoli degli assoni.

I motoneuroni spinali (MN) estendono gli assoni ai muscoli scheletrici per controllare il movimento del corpo. Le loro traiettorie assonali sono altamente organizzate e regolate nel processo di sviluppo. Nonostante molti studi sull'estensione e la guidadell'assone 1,i meccanismi per la formazione organizzata di fasci di assione sono ancora in fase di studio. Gli assoni dei motoneuroni sono spesso danneggiati da malattie neurodegenerative come la sclerosi laterale amiotrofica (SSN)2, ma i meccanismi fisiopatologici del danno sui fascicoli dell'assone sono poco compresi. Pertanto, è necessario un modello fisiologico e patologico per ricapitolare la formazione e la regressione del fascio di assione nel campo.
Un motoneurone derivato dalle cellule staminali umane è una piattaforma promettente per comprendere lo sviluppo e malattie come la SSA3. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (cellule iPS) possono essere utilizzate per modellare le malattie utilizzando cellule derivate dal paziente. Ad oggi, sono stati riportati vari metodi di differenziazione dalle cellule staminali pluripotenti alla MN4,5,6. Tuttavia, gli assoni di neuroni in coltura bidimensionale sono orientati casualmente e non ricapitolano microambiente in vivo all'interno dei nervi in via di sviluppo in cui gli assoni sono assemblati unidirezionale attraverso dense interazioni assio-assonali7. Per superare questo problema, abbiamo sviluppato una tecnica per generare un tessuto tridimensionale simile al nervo motorio dalle cellule iPS umane 8 eabbiamo chiamatoil tessuto organoide del nervo motorio (MNO). L'MNO è costituito da corpi cellulari situati in uno sferoide del motoneurone (MNS) e un fasclo assonale esteso fuori dallo sferoide. Gli assoni nel fasccolo sono orientati in modo unidirezionale, che assomiglia agli assoni nello sviluppo dei nervi motori. Pertanto, gli MNO forniscono in modo univoco un microambiente assonale fisiologico, che non è stato fatto da altri metodi di coltura neuronale precedentemente sviluppati.
In questo protocollo, descriviamo i metodi per la fabbricazione di chip di coltura tissutale, la rapida differenziazione dei motoneuroni e la formazione organoide del nervo motorio nei chip sviluppati. Il nostro chip di coltura tissutale è molto semplice e contiene solo uno scomparto per accettare uno sferoide, un microcanale per formare un fascio di assoni e uno scomparto per l'alloggiamento dei terminali degli assoni. Il dispositivo non contiene strutture complesse tra cui microgrooves o filtri micropore che vengono spesso utilizzati per separare assoni e corpi cellulari per dimensioni9,10. Quindi i nostri dispositivi possono essere facilmente fabbricati seguendo i passaggi descritti in questo protocollo se è disponibile una configurazione fotolitografica.
La rapida differenziazione delle cellule iPS umane si ottiene con una combinazione ottimizzata di fattori di induzione e patterning (SB431542, LDN-193189, acido retinoico (RA) e agonista levigato (SAG)) e fattori di accelerazione (SU5402 e DAPT). È stato riferito che la combinazione di SU5402 e DAPT accelera la differenziazione dei neuroni periferici e delle cellule della crestaneurale 11. In questo protocollo, offriamo tre diversi metodi per generare MNO, in modo che i lettori possano decidere un metodo più adatto alle loro esigenze. Si consiglia di eseguire la differenziazione delle cellule iPS umane dopo aver formato uno sferoide (il metodo 3D), poiché l'MNS differenziato può essere trasferito direttamente in un chip di coltura tissutale. In alternativa, le cellule iPS umane possono essere differenziate in motoneuroni in coltura monostrato (2D), e quindi create in sferoidi dei motoneuroni tridimensionali come abbiamoprecedentemente riportato 8. Abbiamo aggiornato il protocollo e, con il metodo di differenziazione tridimensionale descritto in questo protocollo, la transizione dal 2D al 3D può essere evitata e gli MNO possono essere ottenuti con tempi di differenziazione più brevi, meno passaggi e rischi tecnici ridotti senza la fase di dissociazione. I neuroni disponibili in commercio possono anche essere utilizzati per generare MNS per ridurre i tempi di differenziazione.
Per generare un MNO, abbiamo coltivato un MNS nel chip di coltura tissutale. Gli assoni si allungano dallo sferoide e si estendono nel microcanale in cui gli assoni si riuniscono e si allineano unidirezionali. Ciò facilita l'interazione asso-assionale e la formazione spontanea di un fascio unidirezionale strettamente assemblato di assoni nel microcanale, che è ottenuto in modo univoco da questo protocollo, mentre la formazione spontanea di fasci o l'orientamento assonale guidato da solo possono essere raggiuntida altri protocolli 12,13,14. In un esperimento tipico, poche cellule migrano dagli sferoidi al microcanale e la maggior parte delle cellule rimane negli sferoidi vicini. Questo metodo permette agli assoni di essere separati spontaneamente dagli sferoidi senza utilizzare barriere fisiche dipendenti dalle dimensioni (ad esempio, microgroovi o filtri a micropore) per separare gli assoni dai corpi cellulari.
L'MNO risultante può essere sottoposto a vari esami, tra cui analisi morfologiche, biochimiche e fisiche. Il corpo cellulare e il fascio esteso di assoni possono essere fisicamente isolati tagliando e possono essere analizzati separatamente per esperimenti a valle, ad esempio test biochimici. I materiali biologici tra cui RNA e proteine possono essere isolati da pochi fasci di assoni per test biochimici regolari tra cui RT-PCR e macchia occidentale. Qui descriviamo un protocollo per generare organoide nervoso motorio dalle cellule iPS, che offre un modello fisiologico e patologico attraente per studiare il meccanismo alla base dello sviluppo e della malattia dei fascicoli assoni.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Un fasccle di assoni è uno dei principali motivi strutturali osservati nel sistema nervoso. L'interruzione delle fascole di assone potrebbe causare malattie dello sviluppo e neurodegenerative. Sebbene siano stati condotti numerosi studi sugli assoni, la nostra comprensione della formazione e della disfunzione dei fasccoli assoni è ancora limitata a causa della mancanza di robusti modelli tridimensionali in vitro. Qui descriviamo un protocollo passo-passo per la rapida generazione di un organoide del nervo motorio (MNO) da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPS) in un chip di coltura tissutale a base microfluidica. In primo luogo, viene descritta la fabbricazione di chip utilizzati per il metodo. Dalle cellule iPS umane si forma uno sferoide dei motoneuroni (MNS). Successivamente, l'MNS differenziato viene trasferito nel chip. Successivamente, gli assoni crescono spontaneamente dallo sferoide e si assemblano in un fasclo all'interno di un microcanale equipaggiato nel chip, che genera un tessuto MNO che trasporta un fascio di assoni estesi dallo sferoide. Per l'analisi a valle, gli MNO possono essere prelevati dal chip per essere fissati per analisi morfologiche o sezionati per analisi biochimiche, nonché per l'imaging del calcio e registrazioni di array multi-elettrodi. Gli MNO generati con questo protocollo possono facilitare il test e lo screening dei farmaci e possono contribuire alla comprensione dei meccanismi alla base dello sviluppo e delle malattie dei fascicoli dell'assone.

I motoneuroni sono stati differenziati entro 12-14 giorni nelle procedure di differenziazione 3D (Figura 4 e Figura 5). È importante sottolineare che più del 60% delle cellule ha espresso il marcatore del motoneurone HB9 durante la differenziazione. L'immunoistochimica ha rivelato che circa l'80% delle cellule nell'MNS erano motoneuroni positivi all'SMI32. HB9 e SMI32 sono i marcatori dei motoneuroni in fase inizialestabiliti 15,16. L'espressione di HB9 e SMI32 sono i parametri chiave che devono essere confermati per garantire l'identità cellulare dei motoneuroni. Dopo l'introduzione di un MNS nel chip di coltura, gli assoni si estendono nel canale e si forma un fascio di assoni. A causa dei microcanali che fungono da guide fisiche, gli assoni si allungano dall'MNS e formano un fascio per interazione assio-assionale (Figura 6A). È essenziale confermare la formazione del fascio di assoni mediante osservazione microscopica per confermare la generazione di un MNO. Un MNO di successo porta un fascio di assoni più largo di 50 μm e pochi assoni isolati fuori dal fascio nel canale. L'allungamento iniziale degli assoni può essere osservato 24 ore dopo l'introduzione dello sferoide. Entro i successivi 3-4 giorni, gli assoni raggiunsero il centro del microcanale per poi raggiungere l'altra estremità entro altri 10 giorni(Figura 6A). Di conseguenza, gli assoni si assemblarono e formarono un fascio dritto e unidirezionale in 2-3 settimane in un chip, e le attività neuronali furono osservate in seguito.
Gli organoidi nervosi motori possono essere raccolti dal truciolo staccando il PDMS dal vetro del microscopio per l'analisi biologica (Figura 6B). I fasci di assone e i corpi cellulari possono essere sezionati e isolati tagliando utilizzando un coltello chirurgico o una pinzetta al microscopio (Figura 6B). Questi materiali biologici tra cui RNA e proteine possono essere utilizzati per regolari saggi biochimici come RT-PCR e western blotting. Nei fasci di axon di MNO, le proteine del produttore nucleare o dendritico non vengono rilevate nell'assorbimento occidentale (Figura 6C).
In combinazione con un indicatore di calcio (Fluo-4 AM), l'attività neuronale può essere catturata nel chip di coltura tissutale. L'attività spontanea dei motoneuroni nello sferoide e nel fascio di assoni è stata osservata all'interno dell'MNO. Inoltre, le attività neurali sono state osservate utilizzando un sistema array multi-elettrodo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figura 1: La dimensione del chip di coltura tissutale PDMS. (A) Fotomaschera del chip di coltura tissutale. (B) Dimensioni del microcanale nel chip di coltura tissutale. Il diametro della camera di base per trattenere lo sferoide del motoneurone è di 2 mm e il foro del PDMS sopra la camera è di 1,5 mm. La larghezza e l'altezza di un microcanale che collega due camere sono entrambe di 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figura 2: Illustrazione schematica della differenziazione dei motoneuroni. (A) Le fasi di differenziazione hanno comportato l'induzione neurale, il patterning nel lignaggio dei motoneuroni e la maturazione dei motoneuroni. (B) Due opzioni per creare lo sferoide dei motoneuroni (MNS) dalle cellule iPS: il protocollo 3D e un protocollo 2D con fase di dissociazione dei motoneuroni. L'organoide del nervo motorio (MNO) può essere ottenuto da entrambi i protocolli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figura 3: Protocollo passo dopo passo per il rivestimento della matrice della membrana basale e l'introduzione dello sferoide del motoneurone. (A) Rivestimento a matrice di membrana basale nel canale del chip di coltura tissutale. (B) Introduzione MNS nel foro del truciolo. (C) Variazione media della coltura mediante aspirazione di mezzi esauriti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figura 4: Differenziazione dei motoneuroni 2D e 3D. (A) Corso di tempo di differenziazione rappresentativa 3D MNS (protocollo 3D). Le dimensioni dell'MNS sono gradualmente aumentate nel tempo. Barra di scala: 500 μm. (B) Corso di tempo della differenziazione 2D su -D2, D0, D1, D6, D12 (protocollo 2D). Barra di scala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figura 5: Caratterizzazione dei motoneuroni. (A) (Sinistra) Una criosezione di un MNS macchiato con anticorpo SMI-32 e DAPI. (Al centro) Immagine a contrasto di fase di MNS rilato su una superficie rivestita di matrice a membrana basale. È stato osservato l'allungamento assonale. (A destra) Assoni di MNS pentiti macchiati con anticorpi Synapsin I e Tuj1. Barra di scala: 500 μm (sinistra e centrale) e 50μm (destra). (B) Un'immagine rappresentativa dei motoneuroni 2D immunososteniati con anticorpi Tuj e HB9. Barra di scala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figura 6: Caratterizzazione di un organoide del nervo motorio (MNO) generato in un chip di coltura. (A) Immagini rappresentative dell'allungamento dell'assone e della formazione di fasci di assione spessi su D32. Barra di scala: 500 μm. (B) Immunostaining of motor nerve organoid (MNO) di SMI-32 e DAPI. Assoni e corpi cellulari possono essere isolati tagliando fisicamente. Barra di scala: 1 mm. (C) Purezza della proteina da assoni e corpi cellulari quantificati dall'assorbimento occidentale. MAP2, un marcatore dendritico, non è stato rilevato nella proteina assonale, mentre il marcatore assonale Tau1 è arricchito nella proteina assonale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Questo protocollo fornisce una procedura completa per fabbricare organoide del nervo motorio derivato dalle cellule iPS umane attraverso l'assemblaggio spontaneo di un robusto fascio di assoni estesi da uno sferoide in un chip di coltura tissutale.

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