Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Denne studien ble støttet av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 og 18K19903, Core-2-core program, og Beyond AI institute.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

I en del av denne protokollen har et patent blitt lisensiert til Jiksak Bioengineering, Inc. som ble grunnlagt av Jiro Kawada.

Denne protokollen beskriver dannelsen av en motor nerve organoid (MNO) som har en axon bunt utvidet fra en motor neuron sfæroid generert fra menneskelige iPS-celler. Den dannede axonbunten er tykk, fleksibel og godt organisert i enveisstrukturer. Ved å dissekere aksonbunten kan aksonprotein med høy renhet oppnås tilstrekkelig til biokjemiske analyser. Neuronal aktivitet kan måles i akson bunter og sfæroider med kalsium imaging. Kontaminering av kjernefysiske og dendrittiske proteiner i aksonalt lysat ble ikke oppdaget ved vestlig blotting, noe som viser at vår metode effektivt separerte aksoner fra cellelegemer og dendritter.
En av fordelene med denne protokollen er den raske differensieringen og genereringen av MNO utstyrt med en axon-bunt, der alle prosesser kan gjøres i 4 uker med 3D-protokollen og 5-6 uker ved hjelp av 2D-protokollen. Dette er kort sammenlignet med andre protokoller som vanligvis tar 3-4 uker å bare differensiere til MN fra embryonale stamceller og iPS-celler17, og det tar ytterligere 2-4 uker å oppnå aksonal forlengelse. 3D-protokollen foretrekkes vanligvis over 2D-protokollen på grunn av kortere differensieringstid, færre trinn og redusert teknisk risiko uten dissosiasjonstrinnet sammenlignet med 2D-protokollen. Den mikrofluidiske-baserte vevskulturbrikken ble designet på en måte slik at aksonene til MNS kan forlenge mot det andre rommet gjennom mikrokanal, noe som letter dannelsen av en bunt av aksoner ved å indusere aksonære interaksjoner og affinitet mellom aksoner. På grunn av det enkle eksperimentelle oppsettet kan alle protokollene som er beskrevet her ikke bare utføres av bioingeniører, som er kjent med manipulering av en vevskulturbrikke, men også biologer og nevrologer som ikke er kjent med mikrofluidiker og mikrofabrikasjonsteknikker. Det bør bemerkes at trinn 1 og 2 også kan utføres ved hjelp av en ekstern fabrikasjonstjeneste.
Et av de kritiske trinnene for å oppnå protokollen er en sekvensiell endring av kulturmedium. Det anbefales å fullstendig endre kulturmediet på hvert trinn under differensieringen, slik at faktorer i det brukte mediet ikke forstyrrer MN-differensieringen. Et annet kritisk punkt i denne protokollen er å opprettholde udifferensierte iPS-celler i god kvalitet. Kvaliteten på den første iPS cellekulturen påvirker effektiviteten betydelig for å oppnå motornevroner og MNO. Et annet poeng er at diameteren på MNS skal være mindre enn størrelsen på hullet på brikken (1,5 mm). Større sfæroider kan ikke komme inn i kammeret, og potensielt oppleve alvorlig hypoksisk nekrose i midtdelen. Størrelsen på MNSs kan kontrolleres ved å endre et innledende såing antall iPS-celler (i 3D-protokoll) eller motornevroner (i 2D-protokoll). Såetettheten av celler bør optimaliseres for hver iPS-cellelinje.
Kompartaliserte mikrofluidiske enheter med mikrogropotter og små porefiltre har blitt mye brukt til å skille aksoner fra cellelegemer og dendritter. Denne teknikken kan også skille aksoner fra cellelegemer og dendritt, med overlegen overflod av aksoner i buntet vev. Sammenlignet med de andre metodene, er en stor begrensning av denne metoden at den ikke kan skille to forskjellige kulturmedier i den nåværende utformingen av vevskulturbrikken, noe som hindrer evnen til co-kultur av to forskjellige celler som krever to forskjellige medier. En annen begrensning er at PDMS-brikken satte forhåndsbestemt begrensning på størrelsen på vevet. En sfæroid større enn hullet kan ikke komme inn i kammeret, og axon bunten kan ikke vokse tykkere enn bredden på mikrofluidisk kanal.
Denne metoden kan brukes på andre typer nevroner. Vår gruppe har vist evne til å modellere en cerebral kanal ved hjelp av en modifisert metode kombinert med cerebral organoidteknikker 18. Kortikale sfæroider ble introdusert i begge rom og aksonene spontant langstrakte gjensidig mot hver sfæroid, og deretter en akson bunt dannet spontant. Som et resultat kan to kortikale sfæroider kobles til gjennom en aksonbunt, og vevet kan oppnås som ett stykke. Dette viser at tilnærmingen er svært allsidig for å danne axon bunt vev uavhengig av nevronale celletyper. I denne protokollen ble humane iPS-celler brukt, men andre stamceller, inkludert menneskelige ES-celler og humane nevrale stamceller, kan brukes med endringer i den presenterte protokollen. 3D-sfæroider av nevroner kan genereres av ulike protokoller19,20. Denne metoden for å lage vev med en axon bunt kan potensielt kombineres i fremtiden med de andre differensieringsprotokoller for å lage 3D MN sfæroid. I tillegg kan tykkelsen og lengden på axonbunten styres ved ganske enkelt å endre bredden og høyden på mikrokanaler av vevskulturbrikken for fremtidige utviklinger.
Vi tror at denne protokollen kan brukes til narkotikatesting og screening og kan bidra til forståelsen av mekanismer som ligger til grunn for utvikling og sykdommer i akson fascicles.

Spinalmotornevroner (MN) utvider aksoner til skjelettmuskler for å kontrollere kroppsbevegelse. Deres aksonære baner er svært organisert og regulert i utviklingsprosessen. Til tross for mange studier på axon forlengelse ogveiledning 1, mekanismer for organisert axon bunt formasjon er fortsatt under etterforskning. Aksoner av motoriske nevroner blir ofte skadet av nevrodegenerative sykdommer som amyotrofisk lateral sklerose (ALS)2, men patofysiologiske mekanismer for skaden på aksonfascikaler er dårlig forstått. Dermed er det nødvendig med en fysiologisk og patologisk modell for å rekapulere aksonbuntdannelse og regresjon i feltet.
En menneskelig stamcelleavledet motor neuron er en lovende plattform for å forstå utvikling og sykdommer som ALS3. Humane induserte pluripotente stamceller (iPS-celler) kan brukes til å modellere sykdommer ved hjelp av pasientavledede celler. Til dags dato har ulike differensieringsmetoder fra pluripotente stamceller til MN blittrapportert 4,5,6. Imidlertid er aksoner av nevroner i todimensjonal kultur tilfeldig orientert og ikke rekafulere in vivo mikromiljø i å utvikle nerver der aksoner er enveis montert gjennom tette axo-aksonale interaksjoner7. For å overvinne dette problemet har vi utviklet en teknikk for å generere et tredimensjonalt vev som ligner motornerve fra humane iPS-celler8, og kalt vevet som motornerveorganoid (MNO). MNO består av cellelegemer som ligger i en motor neuron spheroid (MNS) og en aksonal fascicle utvidet ut fra sfæroid. Aksonene i fascicleen er enveisorienterte, som ligner aksoner i utviklingen av motornerver. Derfor gir MNOer unikt et fysiologisk aksonalt mikromiljø, som ikke ble gjort av noen andre tidligere utviklede nevronale kulturmetoder.
I denne protokollen beskriver vi metoder for vevkulturchipsfabrikasjon, rask motor neuron differensiering og motornerve organoid dannelse i utviklede chips. Vår vev kultur chip er veldig enkel, og den inneholder bare et rom for å akseptere en sfæroid, en mikrokanal for å danne en axon bunt, og et rom for bolig axon terminaler. Enheten inneholder ikke komplekse strukturer, inkludert mikrogropoer eller mikroporefiltre som ofte brukes til å skille aksoner og cellelegemer etterstørrelse 9,10. Derfor kan våre enheter enkelt fremstilles ved å følge trinnene som er beskrevet i denne protokollen hvis et fotolitografioppsett er tilgjengelig.
Rask differensiering av humane iPS-celler oppnås med en optimalisert kombinasjon av induserende og mønsterfaktorer (SB431542, LDN-193189, retinsyre (RA) og glattet agonist (SAG)) og akselerasjonsfaktorer (SU5402 og DAPT). Det har blitt rapportert at kombinasjonen av SU5402 og DAPT akselererer differensieringen av perifere nevroner og nevrale crest celler11. I denne protokollen tilbyr vi tre forskjellige metoder for å generere MNOer, slik at leserne kan bestemme en metode som passer best til deres behov. Vi anbefaler at du utfører differensiering av humane iPS-celler etter å ha dannet en sfæroid (3D-metoden), siden differensierte MNS kan overføres direkte til en vevskulturbrikke. Alternativt kan menneskelige iPS-celler differensieres til motoriske nevroner i monolayer (2D) kultur, og deretter opprettet i tredimensjonale motor neuron sfæroider som vi tidligere rapporterte8. Vi har oppdatert protokollen, og med den tredimensjonale differensieringsmetoden som er beskrevet i denne protokollen, kan overgangen fra 2D til 3D unngås og MNOer kan oppnås med kortere differensieringstid, færre trinn og redusert teknisk risiko uten dissosiasjonstrinnet. Kommersielt tilgjengelige nevroner kan også brukes til å generere MNS for å redusere tiden for differensiering.
For å generere en MNO, dyrket vi en MNS i vevskulturbrikken. Aksonene strekker seg fra spheroiden og strekker seg inn i mikrokanal der aksoner samler og justerer seg enveis. Dette forenkler axo-aksonær interaksjon og spontan dannelse av et tett montert enveis buntvev av aksoner i mikrokanal, som er unikt oppnådd ved denne protokollen, mens enten spontan buntdannelse eller veiledet aksonær orientering alene kan oppnås ved andreprotokoller 12,13,14. I et typisk eksperiment migrerer få celler ut fra sfæroider til mikrokanal, og de fleste celler forblir nærliggende sfæroider. Denne metoden gjør at aksoner spontant skilles ut fra sfæroidene uten å bruke størrelsesavhengige fysiske barrierer (f.eks. mikrogropor eller mikroporefiltre) for å skille aksoner fra cellelegemer.
Den resulterende MNO kan bli utsatt for ulike undersøkelser, inkludert morfologiske, biokjemiske og fysiske analyser. Cellekroppen og utvidet aksonbunt kan isoleres fysisk ved å kutte og kan analyseres separat for nedstrøms eksperimenter, for eksempel biokjemiske analyser. Biologiske materialer, inkludert RNA og protein, kan isoleres fra bare noen få axonbunter for vanlige biokjemiske analyser, inkludert RT-PCR og vestlig blotting. Her beskriver vi en protokoll for generering av motornerveorganoid fra iPS-celler, som tilbyr en attraktiv fysiologisk og patologisk modell for å studere mekanismen underliggende utvikling og sykdom av aksonfascicles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

En fascicle av aksoner er et av de store strukturelle motivene observert i nervesystemet. Forstyrrelse av akson fascicles kan forårsake utviklings- og nevrodegenerative sykdommer. Selv om mange studier av aksoner er utført, er vår forståelse av dannelse og dysfunksjon av akson fascicles fortsatt begrenset på grunn av mangel på robuste tredimensjonale in vitro-modeller. Her beskriver vi en trinnvis protokoll for rask generering av en motornerve organoid (MNO) fra humane induserte pluripotente stamceller (iPS) i en mikrofluidisk-basert vevskulturbrikke. Først er fabrikasjon av chips som brukes til metoden beskrevet. Fra menneskelige iPS-celler dannes en motorneuronspæroid (MNS). Deretter overføres den differensierte MNS til brikken. Deretter vokser aksoner spontant ut av spheroiden og monteres i en fascicle i et mikrokanals utstyrt i brikken, noe som genererer et MNO-vev som bærer en bunt av aksoner som strekker seg fra sfæroidet. For nedstrømsanalysen kan MNOer tas ut av brikken som skal fikses for morfologiske analyser eller dissekeres for biokjemiske analyser, samt kalsiumavbildning og multielektrodearrayopptak. MNOer generert med denne protokollen kan lette narkotikatesting og screening og kan bidra til forståelse av mekanismer underliggende utvikling og sykdommer i akson fascicles.

Motornevroner ble differensiert innen 12-14 dager i 3D differensieringsprosedyrer (figur 4 og figur 5). Viktigere, mer enn 60% av cellene uttryktmotor neuron markør HB9 under differensiering. Immunohistochemistry viste at ca 80% av cellene i MNS var SMI32-positive motornevroner. HB9 og SMI32 er de etablerte tidlig stadium motor neuron markører15,16. Uttrykket hb9 og SMI32 er de viktigste parametrene som må bekreftes for å sikre cellulær identitet av motornevroner. Etter innføringen av en MNS i kulturbrikken, strekker aksoner seg inn i kanalen og en axonbunt dannes. På grunn av mikrokanaler som fungerer som fysiske guider, forlenger aksoner fra MNS og danner en bunt ved axo-aksonær interaksjon (figur 6A). Det er viktig å bekrefte dannelsen av axonbunten ved mikroskopisk observasjon for å bekrefte genereringen av en MNO. En vellykket MNO bærer en akson bunt bredere enn 50 μm og få isolerte aksoner ut av bunten i kanalen. Første forlengelse av aksoner kan observeres 24 timer etter innføringen av sfæroid. I løpet av de neste 3-4 dagene nådde aksonene til midten av mikrokanal og når deretter til den andre enden innen ytterligere 10 dager (figur 6A). Følgelig samlet aksonene og dannet en rett og enveis bunt i 2-3 uker i en chip, og nevronale aktiviteter ble observert deretter.
Motor nerve organoider kan samles inn fra brikken ved å løsne PDMS fra mikroskopglasset for biologisk analyse (Figur 6B). Axon bunter og cellelegemer kan dissekeres og isoleres ved å kutte ved hjelp av en kirurgisk kniv eller pinsett under et mikroskop (Figur 6B). Disse biologiske materialene, inkludert RNA og protein, kan brukes til regelmessige biokjemiske analyser som RT-PCR og vestlig blotting. I axon bunter av MNOer, kjernefysiske eller dendrittiske maker proteiner er ikke påvist i vestlig blotting (Figur 6C).
I kombinasjon med en kalsiumindikator (Fluo-4 AM) kan nevronal aktivitet fanges i vevskulturbrikken. Spontan aktivitet av motorneuroner i sfæroidet og aksonbunten ble observert i MNO. Også nevrale aktiviteter ble observert ved hjelp av et multi-elektrode array system.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figur 1: Dimensjonen av PDMS vev kultur chip. (A) Fotomaske av vev kultur chip. (B)Dimensjoner av mikrokanal i vev kultur chip. Diameteren på basiskammeret for å holde motor neuron spheroid er 2 mm og hullet av PDMS over kammeret er 1, 5 mm. Bredden og høyden på en mikrokanal bro to kamre er begge 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figur 2: Skjematisk illustrasjon av motorneurondilatering. (A)Differensieringstrinnene involverte nevrale induksjon, mønster i motor neuron avstamning, og modning av motoriske nevroner. (B)To alternativer for å lage motor neuron sfæroid (MNS) fra iPS-celler: 3D-protokoll, og en 2D-protokoll med dissosiasjonstrinn av motornevroner. Motor nerve organoid (MNO) kan oppnås ved begge protokollene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figur 3: Trinnvis protokoll for kjellermembranmatrisebelegg og motorneuron sfæroid introduksjon. (A)Kjeller membran matrise belegg i kanalen av vev kultur chip. (B) MNS introduksjon i hullet på brikken. (C) Kultur medium endring ved aspirasjon av utmattet medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figur 4: 2D og 3D motor neuron differensiering. (A) Tidsforløpet for representativ 3D MNS differensiering (3D-protokoll). Størrelsen på MNS økte gradvis over tid. Vekt bar: 500 μm. (B) Tidsforløpet for 2D-differensiering på -D2, D0, D1, D6, D12 (2D-protokoll). Vekt bar: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figur 5: Karakterisering av motoriske nevroner. (A) (Venstre) En kryoseksjon av en MNS farget med SMI-32 antistoff og DAPI. (Midten) Et fasekontrastbilde av replated MNS på en kjellermembranmatrisebelagt overflate. Aksonal forlengelse ble observert. (Høyre) Axons av replated MNS farget med Synapsin I og Tuj1 antistoffer. Vektstangen: 500 μm (venstre og midten) og 50μm (høyre). (B)Et representativt bilde av 2D motorneuroner immunostained med Tuj og HB9 antistoffer. Vektstangen: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figur 6: Karakterisering av en motornerveorganoid (MNO) generert i en kulturbrikke. (A)Representative bilder av akson forlengelse og tykk axon bunt dannelse på D32. Vekt bar: 500 μm. (B)Immunstaining av motornerve organoid (MNO) ved SMI-32 og DAPI. Aksoner og cellelegemer kan isoleres ved fysisk skjæring. Vektstangen: 1 mm. (C) Renhet av proteinet fra aksoner og cellelegemer kvantifisert ved vestlig blotting. MAP2, en dendrittisk markør, ble ikke påvist i aksonalt protein, mens aksonalmarkør Tau1 er beriket i aksonalt protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Denne protokollen gir en omfattende prosedyre for å fremstille menneskelig iPS celle-avledet motor nerve organoid gjennom spontan montering av en robust bunt av aksoner utvidet fra en sfæroid i en vev kultur chip.

Tredimensjonal motor nerve organoid generasjon

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve transection og Time-lapse Imaging av Glial Cell atferd Live Sebrafisk

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll for Tredimensjonal Confocal Morfometrisk Analyse av Astrocytter

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Tredimensjonale Imaging og analyse av mitokondrier i menneskelig Intraepidermal Nerve Fibre

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

Fiberforbindelser av det kompletterende motorområdet revidert: Metodikk for fiberdisseksjon, DTI og tredimensjonal dokumentasjon

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generering og langvarig vedlikehold av nervefri<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

I Vivo Single-molekylet sporing på Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Store tredimensjonale Imaging mobilnettet organisasjon i musen Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Tredimensjonal form modellering og analyse av hjernens strukturer

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D kinematisk analyse for funksjonell evaluering i rottemodellen av siattisk nerveknuseskade

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Rensing av fibroblaster og Schwann-celler fra sensoriske og motornerver in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...