Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
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Este estudo foi apoiado pela Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 e 18K19903, Core-2-core e Beyond AI institute.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

Em parte deste protocolo, uma patente foi licenciada para jiksak bioengenharia, Inc. que foi fundada por Jiro Kawada.

Este protocolo descreve a formação de um organoide nervoso motor (MNO) que tem um feixe de axônio estendido a partir de um esferoide de neurônio motor gerado a partir de células iPS humanas. O pacote de axônio formado é espesso, flexível e bem organizado em estruturas unidirecionais. Ao dissecar o feixe de axônio, a proteína axonal de alta pureza e o RNA podem ser obtidos suficientemente para análises bioquímicas. A atividade neuronal pode ser medida em feixes de axônio e esferoides com imagem de cálcio. A contaminação de proteínas nucleares e dendríticas no liseto axonal não foi detectada pela mancha ocidental, demonstrando que nosso método separou eficientemente os axônios dos corpos celulares e dendritos.
Uma das vantagens deste protocolo é a rápida diferenciação e geração de MNO equipado com um pacote de axônio, no qual todos os processos podem ser feitos em 4 semanas com o protocolo 3D e 5-6 semanas usando o protocolo 2D. Isso é curto em comparação com outros protocolos que normalmente levam de 3 a 4 semanas para simplesmente se diferenciar em MN de células-tronco embrionárias e células iPS17 e leva mais 2-4 semanas para obter alongamento axonal. O protocolo 3D é geralmente preferido em relação ao protocolo 2D devido ao menor tempo de diferenciação, menos etapas e riscos técnicos reduzidos sem a etapa de dissociação em comparação com o protocolo 2D. O chip de cultura tecidual baseado em microfluidic foi projetado de forma que os axônios de MNS possam alongar em direção ao outro compartimento através do microcanal, o que facilita a formação de um feixe de axônios induzindo interações axo-axonanas e afinidade entre axônios. Por causa da simples configuração experimental, todos os protocolos descritos aqui podem não apenas ser realizados por bioengenheiros, que estão familiarizados com a manipulação de um chip de cultura tecidual, mas também biólogos e neurocientistas que não estão familiarizados com microfluidos e técnicas de microfabúcia. Deve-se notar que as etapas 1 e 2 também podem ser realizadas utilizando um serviço de fabricação externa.
Um dos passos críticos para a realização do protocolo é uma mudança sequencial do meio cultural. Aconselhável mudar completamente o meio de cultura a cada etapa durante a diferenciação para que fatores no meio gasto não perturbem a diferenciação de MN. Outro ponto crítico deste protocolo é manter células iPS indiferenciadas em boa qualidade. A qualidade da cultura celular iPS inicial afeta significativamente a eficiência para a obtenção de neurônios motores e MNO. Outro ponto é que o diâmetro do MNS deve ser menor do que o tamanho do orifício do chip (1,5 mm). Esferoides maiores não podem entrar na câmara, e potencialmente experimentam necrose hipóxica grave na parte central. O tamanho dos MNSs pode ser controlado alterando um número inicial de semeadura de células iPS (em protocolo 3D) ou neurônios motores (em protocolo 2D). A densidade de semeadura das células deve ser otimizada para cada linha celular iPS.
Dispositivos microfluidos compartimentados com microgrooves e pequenos filtros de poros têm sido amplamente utilizados para separar axônios de corpos celulares e dendritos. Esta técnica também pode separar axônios de corpos celulares e dendrite, com abundância superior de axônios em tecidos empacotados. Em comparação com os outros métodos, uma das principais limitações deste método é que ele não pode separar duas mídias culturais diferentes no desenho atual do chip de cultura tecidual, o que dificulta a capacidade de co-cultura de duas células diferentes que requerem duas mídias distintas. Outra limitação é que o chip PDMS colocou restrição predeterminada no tamanho do tecido. Um esferoide maior que o orifício não pode entrar na câmara, e o feixe de axônio não pode crescer mais grosso do que a largura do canal microfluido.
Este método pode ser aplicado a outros tipos de neurônios. Nosso grupo mostrou capacidade para modelar um trato cerebral usando um método modificado combinado com técnicas organoides cerebrais18. Esferoides corticais foram introduzidos em ambos os compartimentos e os axônios espontaneamente alongados reciprocamente em direção a cada esferoide, e posteriormente um feixe de axônio formado espontaneamente. Como resultado, dois esferoides cortical podem ser conectados através de um feixe de axônio, e o tecido poderia ser obtido como uma peça. Isso demonstra que a abordagem é altamente versátil para formar tecidos de feixe de axônio, independentemente dos tipos de células neuronais. Neste protocolo, foram utilizadas células iPS humanas, no entanto, outras células-tronco, incluindo células-tronco humanas e células-tronco neurais humanas, podem ser usadas com modificações no protocolo apresentado. Esferoides 3D de neurônios podem ser gerados por diversos protocolos19,20. Este método de fabricação de tecidos com um feixe de axônio pode potencialmente ser combinado no futuro com os outros protocolos de diferenciação para fazer esferoide 3D MN. Além disso, a espessura e o comprimento do feixe de axônio podem ser controlados simplesmente alterando a largura e a altura dos microcanais do chip de cultura tecidual para desenvolvimentos futuros.
Acreditamos que este protocolo pode ser usado para testes e rastreamento de drogas e pode contribuir para a compreensão dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e doenças dos fascicles de axônio.

Os neurônios motores espinhais (MN) estendem os axônios aos músculos esqueléticos para controlar o movimento corporal. Suas trajetórias axonal são altamente organizadas e reguladas no processo de desenvolvimento. Apesar de muitos estudos sobre extensão de axônio e orientação1,os mecanismos de formação organizada de axônio ainda estão sendo investigados. Axônios de neurônios motores são frequentemente danificados por doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA)2, mas mecanismos fisiopatológicos dos danos nos fascicles de axônio são mal compreendidos. Assim, é necessário um modelo fisiológico e patológico para recapitular a formação e regressão do feixe de axônio no campo.
Um neurônio motor derivado de células-tronco humanas é uma plataforma promissora para entender o desenvolvimento e doenças como a ALS3. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (células iPS) podem ser usadas para modelar doenças usando células derivadas do paciente. Até o momento, vários métodos de diferenciação de células-tronco pluripotentes em MN foram relatados4,5,6. No entanto, os axônios dos neurônios na cultura bidimensional são orientados aleatoriamente e não recapitulam o microambiente in vivo dentro dos nervos em desenvolvimento nos quais os axônios são montados unidiretamente através de densas interações axo-axonanas7. Para superar essa questão, desenvolvemos uma técnica para gerar um tecido tridimensional semelhante ao nervo motor a partir das células iPS humanas8, e nomeamos o tecido como organoide do nervo motor (MNO). O MNO consiste em corpos celulares localizados em um esferoide de neurônio motor (MNS) e um fascicle axonal estendido do esferoide. Os axônios no fascicle são unidiretamente orientados, que se assemelha a axônios no desenvolvimento de nervos motores. Assim, os MNOs fornecem exclusivamente um microambiente axonal fisiológico, o que não foi feito por nenhum outro método de cultura neuronal previamente desenvolvido.
Neste protocolo, descrevemos métodos para fabricação de chips de cultura tecidual, rápida diferenciação de neurônios motores e formação organoide do nervo motor em chips desenvolvidos. Nosso chip de cultura tecidual é muito simples, e contém apenas um compartimento para aceitar um esferoide, um microcanal para formar um feixe de axônio, e um compartimento para abrigar terminais de axônio. O dispositivo não contém estruturas complexas, incluindo microvalhões ou filtros de microporos que muitas vezes são usados para separar axônios e corpos celulares pelo tamanho9,10. Assim, nossos dispositivos podem ser facilmente fabricados seguindo as etapas descritas neste protocolo se uma configuração de fotolitografia estiver disponível.
A rápida diferenciação das células iPS humanas é alcançada com uma combinação otimizada de fatores de indução e padronização (SB431542, LDN-193189, ácido retinóico (RA) e agonista suavizada (SAG)) e fatores de aceleração (SU5402 e DAPT). Foi relatado que a combinação de SU5402 e DAPT acelera a diferenciação de neurônios periféricos e células de crista neural11. Neste protocolo, oferecemos três métodos diferentes para gerar MNOs, para que os leitores possam decidir sobre um método mais adequado às suas necessidades. Recomendamos a realização da diferenciação das células iPS humanas após a formação de um esferoide (o método 3D), uma vez que o MNS diferenciado pode ser transferido diretamente para um chip de cultura tecidual. Alternativamente, as células iPS humanas podem ser diferenciadas em neurônios motores na cultura monocamada (2D) e, em seguida, criadas em esferoides de neurônio motor tridimensional, como relatamos anteriormente8. Atualizamos o protocolo, e com o método de diferenciação tridimensional descrito neste protocolo, a transição do 2D para o 3D pode ser evitada e os MNOs podem ser obtidos com menor tempo de diferenciação, menos etapas e riscos técnicos reduzidos sem a etapa de dissociação. Neurônios disponíveis comercialmente também podem ser usados para gerar MNS para reduzir o tempo de diferenciação.
Para gerar um MNO, nós cultuamos um MNS no chip de cultura de tecidos. Os axônios alongam-se do esferoide e estendem-se para o microcanal no qual os axônios se reúnem e se alinham unidiretamente. Isso facilita a interação axonal e a formação espontânea de um tecido de axônio unidirecional bem montado no microcanal, que é alcançado exclusivamente por este protocolo, enquanto a formação espontânea do feixe ou a orientação axonal guiada por si só pode ser alcançada por outros protocolos12,13,14. Em um experimento típico, poucas células migram de esferoides para o microcanal e a maioria das células permanece nas proximidades. Este método permite que os axônios sejam espontaneamente separados dos esferoides sem o uso de barreiras físicas dependentes de tamanho (por exemplo, microgrooves ou filtros de microporos) para separar axônios dos corpos celulares.
O MNO resultante pode ser submetido a diversos exames, incluindo análises morfológicas, bioquímicas e físicas. O corpo celular e o feixe de axônio estendido podem ser fisicamente isolados pelo corte e podem ser analisados separadamente para experimentos a jusante, por exemplo, ensaios bioquímicos. Materiais biológicos, incluindo RNA e proteína, podem ser isolados de apenas alguns feixes de axônio para ensaios bioquímicos regulares, incluindo RT-PCR e manchas ocidentais. Aqui, descrevemos um protocolo para a geração de organoide nervoso motor a partir de células iPS, que oferece um modelo fisiológico e patológico atraente para estudar o mecanismo de desenvolvimento subjacente e doença dos fascicles de axônio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Um fascicle de axônios é um dos principais motivos estruturais observados no sistema nervoso. A interrupção dos fascicles de axônio pode causar doenças desenvolvitórias e neurodegenerativas. Embora inúmeros estudos de axônios tenham sido conduzidos, nosso entendimento da formação e disfunção de fascicles de axônio ainda é limitado devido à falta de modelos in vitro tridimensionais robustos. Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para a rápida geração de um organoide nervoso motor (MNO) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPS) em um chip de cultura de tecido baseado em microfluidic. Em primeiro lugar, descreve-se a fabricação de chips usados para o método. A partir de células iPS humanas, forma-se um esferoide de neurônio motor (MNS). Em seguida, o MNS diferenciado é transferido para o chip. A partir daí, os axônios crescem espontaneamente do esferoide e se reúnem em um fascículo dentro de um microcanal equipado no chip, o que gera um tecido MNO carregando um feixe de axônios estendidos do esferoide. Para a análise a jusante, os MNOs podem ser retirados do chip para serem fixados para análises morfológicas ou dissecados para análises bioquímicas, bem como imagens de cálcio e gravações de matriz de vários eletrodos. Os MNOs gerados com este protocolo podem facilitar o teste e rastreamento de medicamentos e podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento subjacente e doenças dos fascicles de axônio.

Os neurônios motores foram diferenciados dentro de 12-14 dias em procedimentos de diferenciação 3D(Figura 4 e Figura 5). É importante ressaltar que mais de 60% das células expressaram o marcador de neurônio motor HB9 durante a diferenciação. A imunohistoquímica revelou que aproximadamente 80% das células no MNS eram neurônios motores SMI32 positivos. HB9 e SMI32 são os marcadores de neurônio motor em estágio inicial estabelecidos15,16. A expressão de HB9 e SMI32 são os parâmetros-chave que precisam ser confirmados para garantir a identidade celular dos neurônios motores. Após a introdução de um MNS no chip de cultura, os axônios se estendem para o canal e um pacote de axônio se forma. Devido aos microcanais que servem como guias físicos, os axônios alongam-se do MNS e formam um pacote por interação axo-axonal(Figura 6A). É essencial confirmar a formação do feixe de axônio por observação microscópica para confirmar a geração de um MNO. Um MNO bem sucedido carrega um pacote de axônio maior que 50 μm e poucos axônios isolados fora do feixe no canal. O alongamento inicial dos axônios pode ser observado 24 horas após a introdução do esferoide. Nos próximos 3-4 dias, os axônios chegaram ao centro do microcanal e, em seguida, chegam à outra extremidade dentro de mais 10 dias(Figura 6A). Consequentemente, os axônios montaram e formaram um feixe reto e unidirecional em 2-3 semanas em um chip, e atividades neuronais foram observadas posteriormente.
Organoides do nervo motor podem ser coletados do chip desvinculando o PDMS do vidro do microscópio para análise biológica(Figura 6B). Pacotes de axônio e corpos celulares podem ser dissecados e isolados cortando usando uma faca cirúrgica ou pinça sob um microscópio(Figura 6B). Esses materiais biológicos, incluindo RNA e proteína, podem ser usados para ensaios bioquímicos regulares, como RT-PCR e mancha ocidental. Em feixes de Axônio de MNOs, proteínas fabricantes nucleares ou dendríticas não são detectadas em manchas ocidentais(Figura 6C).
Em combinação com um indicador de cálcio (Fluo-4 AM), a atividade neuronal pode ser capturada no chip de cultura tecidual. A atividade espontânea dos neurônios motores no esferoide e no feixe de axônio foram observadas dentro do MNO. Além disso, as atividades neurais foram observadas utilizando-se um sistema de matriz multi-eletrodo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figura 1: A dimensão do chip de cultura tecidual PDMS. (A) Fotomask do chip de cultura tecidual. (B) Dimensões do microcanal no chip de cultura tecidual. O diâmetro da câmara base para segurar o esferoide do neurônio motor é de 2 mm e o orifício de PDMS acima da câmara é de 1,5 mm. A largura e a altura de um microcanal de duas câmaras são de 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figura 2: Ilustração esquemática da diferenciação do neurônio motor. (A) As etapas de diferenciação envolveram indução neural, padronização na linhagem de neurônios motores e maturação de neurônios motores. (B) Duas opções para criar esferoide de neurônio motor (MNS) a partir de células iPS: protocolo 3D, e um protocolo 2D com etapa de dissociação de neurônios motores. Organoide do nervo motor (MNO) pode ser obtido por ambos os protocolos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figura 3: Protocolo passo a passo para revestimento da matriz da membrana do porão e introdução de esferoides de neurônios motores. (A) Revestimento da matriz de membrana do porão no canal do chip de cultura tecidual. (B) Introdução MNS no orifício do chip. (C) Cultura média de mudança por aspiração de meio exausto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figura 4: Diferenciação de neurônio motor 2D e 3D. (A) Curso de tempo de diferenciação 3D MNS representativa (protocolo 3D). O tamanho do MNS aumentou gradualmente ao longo do tempo. Barra de escala: 500 μm. (B) Curso de tempo de diferenciação 2D em -D2, D0, D1, D6, D12 (protocolo 2D). Barra de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figura 5: Caracterização dos neurônios motores. (A) (Esquerda) Uma crioseção de um MNS manchado com anticorpo SMI-32 e DAPI. (Meio) Uma imagem de contraste de fase de MNS replalado em uma superfície revestida de matriz de membrana do porão. Observou-se alongamento axonal. (À direita) Axons de MNS repladados manchados com anticorpos Synapsin I e Tuj1. Barra de escala: 500 μm (Esquerda e Médio) e 50μm (Direita). (B) Uma imagem representativa de neurônios motores 2D imunossuou com anticorpos Tuj e HB9. Barra de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figura 6: Caracterização de um organoide nervoso motor (MNO) gerado em um chip de cultura. (A) Imagens representativas do alongamento do axônio e da formação de feixe de axônio espesso na D32. Barra de escala: 500 μm. (B) Imunostaining de organoide nervoso motor (MNO) por SMI-32 e DAPI. Axônios e corpos celulares podem ser isolados cortando fisicamente. Barra de escala: 1 mm. (C) Pureza da proteína de axônios e corpos celulares quantificado por mancha ocidental. MAP2, um marcador dendrático, não foi detectado em proteína axonal, enquanto o marcador axonal Tau1 é enriquecido na proteína axonal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Este protocolo fornece um procedimento abrangente para fabricar organoide nervoso motor derivado de células iPS humanas através da montagem espontânea de um robusto feixe de axônios estendidos de um esferoide em um chip de cultura tecidual.

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