Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Это исследование было поддержано Японское общество содействия науке (JSPS) Гранты в помощь научным исследованиям 17H05661 и 18K19903, Core-2-основной программы, и за пределами института ИИ.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

В рамках этого протокола патент был лицензирован компании Jiksak Bioengineering, Inc., которая была основана Джиро Кавадой.

Этот протокол описывает образование органоида моторного нерва (MNO), который имеет аксон расслоение, вытянутое из сфероида моторных нейронов, генерируемых из клеток iPS человека. Сформированный аксоновый пучок толстый, гибкий и хорошо организованный в однонаправленных структурах. Путем вскрытия аксонового пучка, высокой чистоты аксонового белка и РНК можно получить достаточно для биохимического анализа. Нейронная активность может быть измерена в аксоновых пучках и сфероидах с помощью изображений кальция. Загрязнение ядерных и дендритных белков в аксональный лисат не было обнаружено западным blotting, демонстрируя, что наш метод эффективно отделил аксоны от клеточных тел и дендритов.
Одним из преимуществ этого протокола является быстрая дифференциация и генерация MNO, оснащенного аксоновой связкой, в которой все процессы можно сделать за 4 недели с помощью 3D-протокола и 5-6 недель с использованием 2D-протокола. Это короткий по сравнению с другими протоколами, которые обычно принимают 3-4 недель, чтобы просто дифференцировать в MN от эмбриональных стволовых клеток иiPS-клеток 17, и это занимает дополнительные 2-4 недели, чтобы получить аксональной удлинения. 3D-протокол, как правило, предпочтительнее 2D-протокола из-за более короткого времени дифференциации, меньшего количества шагов и снижения технических рисков без этапа диссоциации по сравнению с 2D-протоколом. Микрофлюидные ткани культуры чип был разработан таким образом, что аксоны MNS может удлиниться к другому отсеку через микроканал, который облегчает формирование пучка аксонов, вызывая аксо-аксональные взаимодействия и близость между аксонами. Из-за простой экспериментальной настройки, все описанные здесь протоколы могут быть выполнены не только биоинженерами, которые знакомы с манипуляцией чипом культуры тканей, но и биологами и нейробиологами, которые не знакомы с методами микрофлюиды и микрофабрики. Следует отметить, что шаги 1 и 2 также могут быть выполнены с помощью внешнего сервиса изготовления.
Одним из важнейших шагов для достижения протокола является последовательное изменение среды культуры. Рекомендуется полностью менять культурную среду на каждом шагу во время дифференциации, чтобы факторы в оттраченной среде не мешали дифференциации МН. Другим критическим моментом этого протокола является поддержание недифференцированных ячеек iPS в хорошем качестве. Качество начальной культуры клеток iPS значительно влияет на эффективность получения моторных нейронов и MNO. Другое дело, что диаметр МНБ должен быть меньше размера отверстия чипа (1,5 мм). Большие сфероиды не могут войти в камеру, и потенциально испытывают тяжелый гипоксический некроз в центральной части. Размер MNS можно контролировать путем изменения первоначального числа посева клеток iPS (в 3D-протоколе) или моторных нейронов (в 2D-протоколе). Плотность посева ячеек должна быть оптимизирована для каждой линии ячеек iPS.
Разрозненные микрофлюидные устройства с микрогров и небольшими порными фильтрами широко используются для отделения аксонов от клеточных тел и дендритов. Этот метод может также отделить аксоны от клеточных тел и дендрита, с превосходным обилием аксонов в комплекте тканей. По сравнению с другими методами, одним из основных ограничений этого метода является то, что он не может отделить два различных культурных средства массовой информации в текущем дизайне чипа культуры тканей, что препятствует возможности совместной культуры двух разных клеток, которые требуют двух различных средств массовой информации. Другим ограничением является то, что чип PDMS положить предопределенное ограничение на размер ткани. Сфероид размером с отверстие не может войти в камеру, а аксоновский пучок не может расти толще, чем ширина микрофлюидного канала.
Этот метод может быть применен к другим типам нейронов. Наша группа показала способность моделировать мозговой тракт с помощью модифицированного метода в сочетании с церебральными органоидными методами18. Кортикальные сфероиды были введены в обоих отсеках и аксонов спонтанно удлиненные взаимно к каждому сфероиду, а затем аксон расслоение формируется спонтанно. В результате, два корковых сфероида могут быть соединены через аксон расслоение, и ткань может быть получена как один кусок. Это свидетельствует о том, что подход является весьма универсальным для формирования ткани аксон расслоения независимо от типов нейрональных клеток. В этом протоколе, человеческие клетки iPS были использованы, однако, другие стволовые клетки включая людские клетки ES и людские нервные стволовые клетки могут быть использованы с изменениями к представленного протокола. 3D сфероиды нейронов могут быть сгенерированы различными протоколами19,20. Этот метод изготовления тканей с аксоновым пучком потенциально может быть объединен в будущем с другими протоколами дифференциации для создания сфероида 3D MN. Кроме того, толщину и длину аксонового пучка можно контролировать, просто изменив ширину и высоту микроканалов чипа культуры тканей для будущих разработок.
Мы считаем, что этот протокол может быть использован для тестирования и скрининга на наркотики и может способствовать пониманию механизмов, лежащих в основе развития и заболеваний аксоновых фасциклов.

Спинномозговые моторные нейроны (MN) расширяют аксоны на скелетные мышцы, чтобы контролировать движение тела. Их аксональные траектории хорошо организованы и регулируются в процессе развития. Несмотря на множество исследований по расширению аксона ируководство 1, механизмы для организованного образования аксон расслоения все еще находятся под следствием. Аксоны моторных нейронов часто повреждаются нейродегенеративными заболеваниями, такими как боковой амиотрофический склероз (ALS)2, но патофизиологические механизмы повреждения аксоновых фасциклов плохо изучены. Таким образом, физиологическая и патологическая модель для повторения образования и регрессии аксонового пучка требуется в полевых условиях.
Двигательный нейрон, полученный из стволовых клеток человека, является перспективной платформой для понимания развития и таких заболеваний, как ALS3. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (клетки iPS) могут быть использованы для моделирования заболеваний с использованием клеток, полученных пациентом. На сегодняшний день, различные методы дифференциации от плюрипотентных стволовых клеток вMN были зарегистрированы 4,5,6. Тем не менее, аксоны нейронов в двумерной культуре случайным образом ориентированы и не подыгрывляют микрооквидеону in vivo внутри развивающихся нервов, в которых аксоны однонаправленно собраны через плотные аксо-аксональныевзаимодействия 7. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали методику создания трехмерной ткани, напоминающей моторный нерв из клеток iPS 8 человека, иназвали тканьорганоидом моторного нерва (MNO). MNO состоит из клеточных тел, расположенных в сфероиде моторных нейронов (MNS) и аксонального фасцикула, вытянутого из сфероида. Аксоны в фасцикуле однонаправленно ориентированы, что напоминает аксоны в развитии моторных нервов. Таким образом, МНО однозначно обеспечивают физиологическую аксональное микрооквидение, которое не было сделано никакими другими ранее разработанными методами нейрональной культуры.
В этом протоколе мы описываем методы изготовления чипов культуры тканей, быстрой дифференциации моторных нейронов и формирования органоидов моторного нерва в разработанных чипах. Наш чип культуры тканей очень прост, и он содержит только отсек для принятия сфероида, микроканал для формирования аксонового пучка и отсек для корпусных аксоновых терминалов. Устройство не содержит сложных структур, включая микрогров или микропорные фильтры, которые часто используются для разделения аксонов и клеточных телпо размеру 9,10. Таким образом, наши устройства могут быть легко изготовлены, следуя шагам, описанным в этом протоколе, если доступна настройка фотолитографии.
Быстрая дифференциация клеток iPS человека достигается с помощью оптимизированного сочетания факторов индуцирования и узоров (SB431542, LDN-193189, ретинойной кислоты (РА) и сглаженной агонистки (SAG)) и факторов ускорения (SU5402 и DAPT). Сообщалось, что сочетание SU5402 и DAPT ускоряет дифференциацию периферических нейронов и нейронных клеток гребня11. В этом протоколе мы предлагаем три различных метода для создания MNOs, так что читатели могут принять решение о методе, наиболее подходящий для их потребностей. Мы рекомендуем проводить дифференциацию клеток iPS человека после формирования сфероида (3D-метода), так как дифференцированный MNS может быть передан непосредственно в чип культуры тканей. Кроме того, человеческие клетки iPS могут быть дифференцированы в моторные нейроны в монослойной (2D) культуры, а затем создан в трехмерных моторных нейронов сфероидов, как мы ранеесообщали 8. Мы обновили протокол, и с помощью трехмерного метода дифференциации, описанного в этом протоколе, можно избежать перехода с 2D на 3D и получить MNOs с более коротким временем дифференциации, меньшим количеством шагов и уменьшенными техническими рисками без этапа диссоциации. Коммерчески доступные нейроны могут быть также использованы для создания MNS, чтобы уменьшить время для дифференциации.
Для создания MNO мы обуучили MNS в чипе культуры тканей. Аксоны удлиняются от сфероида и простираются в микроканал, в котором топоры собираются и выравниваются однонаправленно. Это облегчает аксо-аксональное взаимодействие и спонтанное образование плотно собранной однонаправленной ткани пучка аксонов в микроканале, что однозначно достигается этим протоколом, в то время как либо спонтанное образование пучка, либо управляемая аксональная ориентация в одиночку могут бытьдостигнуты другими протоколами 12,13,14. В типичном эксперименте, немногие клетки мигрируют из сфероидов в микроканал, и большинство клеток остаются рядом сфероидов. Этот метод позволяет спонтанно отделять аксоны от сфероидов без использования зависящих от размера физических барьеров (например, микрогров или микропорных фильтров) для отделять аксоны от клеточных тел.
В результате MNO может быть подвергнут различным обследованиям, включая морфологический, биохимический и физический анализ. Клеточное тело и расширенный аксоновый пучок могут быть физически изолированы путем резки и могут быть отдельно проанализированы для экспериментов ниже по течению, например, биохимических анализов. Биологические материалы, включая РНК и белок, могут быть выделены из нескольких аксоновых пучков для регулярных биохимических анализов, включая RT-PCR и западный blotting. Здесь мы описываем протокол для генерации органоидов моторного нерва из клеток iPS, который предлагает привлекательную физиологическую и патологическую модель для изучения механизма, лежащего в основе развития и заболевания аксоновых фасциклов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Фасцикл аксонов является одним из основных структурных мотивов, наблюдаемых в нервной системе. Нарушение аксон фасциклов может вызвать развитие и нейродегенеративных заболеваний. Хотя были проведены многочисленные исследования аксонов, наше понимание образования и дисфункции аксонов по-прежнему ограничено из-за отсутствия надежных трехмерных моделей in vitro. Здесь мы описываем пошаговый протокол для быстрого генерации органоида моторного нерва (MNO) из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPS) в микрофлюидной основе чипа культуры тканей. Во-первых, описано изготовление чипов, используемых для метода. Из клеток iPS человека образуется сфероид моторных нейронов (MNS). Далее дифференцированная MNS передается в чип. После этого аксоны спонтанно вырастают из сфероида и собираются в фасцикулу в микроканале, оборудованном чипом, который генерирует ткань MNO, несущую пучок аксонов, вытянутый из сфероида. Для анализа ниже по течению, MNOs могут быть взяты из чипа, которые будут установлены для морфологического анализа или вскрыты для биохимического анализа, а также кальция изображений и многоэ электродных записей массива. МНО, созданные с помощью этого протокола, могут способствовать тестированию и скринингу на наркотики и могут способствовать пониманию механизмов, лежащих в основе развития и заболеваний аксоновых фасциклов.

Моторные нейроны были дифференцированы в течение 12-14 дней в процедурах 3D дифференциации(рисунок 4 и рисунок 5). Важно отметить, что более 60% клеток выразили двигательный нейронный маркер HB9 во время дифференциации. Иммуногистохимия показала, что около 80% клеток в MNS были SMI32-положительных моторных нейронов. HB9 и SMI32 являются установленными маркерами моторных нейронов на раннейстадии 15,16. Выражение HB9 и SMI32 являются ключевыми параметрами, которые должны быть подтверждены для обеспечения клеточной идентичности моторных нейронов. После введения MNS в чип культуры, аксоны распространяются на канал и аксон формы пучка. Благодаря микроканалам, выступающей в качестве физических направляющих, аксоны удлиняются от MNS и образуют пучок аксо-аксонального взаимодействия(рисунок 6A). Важно подтвердить образование аксонового пучка микроскопическим наблюдением, чтобы подтвердить генерацию MNO. Успешный MNO несет аксон расслоение шире, чем 50 мкм и несколько изолированных аксонов из пучка в канале. Первоначальное удлинение аксонов можно наблюдать через 24 часа после введения сфероида. В течение следующих 3-4 дней аксоны достигли центра микроканал, а затем достигает другого конца в течение дополнительных 10 дней(рисунок 6A). Следовательно, аксоны собрались и сформировали прямой и однонаправленный пучок в 2-3 недели в чипе, и нейрональной деятельности наблюдались после этого.
Органоиды моторного нерва могут быть собраны из чипа путем отсоединения PDMS из микроскопического стекла для биологического анализа(рисунок 6B). Аксон расслоения и тела клеток могут быть вскрыты и изолированы путем резки с помощью хирургического ножа или пинцета подмикроскопом (рисунок 6B). Эти биологические материалы, включая РНК и белок, могут быть использованы для регулярных биохимических анализов, таких как RT-PCR и западные blotting. В аксоновых пучках МНО, ядерных или дендритных белков производителя не обнаруживаются в западных blotting(рисунок 6C).
В сочетании с индикатором кальция (Fluo-4 AM) нейронная активность может быть захвачена в чипе культуры тканей. Спонтанная активность моторных нейронов в сфероиде и аксоновом пучоке наблюдалась в пределах MNO. Кроме того, нейронная активность наблюдалась с помощью многотемоделной системы массива.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Рисунок 1: Измерение чипа культуры ткани PDMS. (A)Фотомаска чипа культуры тканей. (B)Размеры микроканал в чипе культуры тканей. Диаметр базовой камеры для хозяйки моторного нейрона сфероида составляет 2 мм, а отверстие PDMS над камерой составляет 1,5 мм. Ширина и высота микроканального канала, преодолевая две камеры, находятся на высоте 150 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Рисунок 2: Схематическая иллюстрация моторной дифференциации нейронов. (A)Этапы дифференциации связаны с нервной индукцией, узором в линию моторных нейронов и созреванием моторных нейронов. (B)Два варианта создания моторного нейрона сфероида (MNS) из iPS-клеток: 3D-протокол и 2D-протокол с диссоциациацией двигательных нейронов. Моторный нервный органоид (MNO) может быть получен по обоим протоколам. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Рисунок 3: Шаг за шагом протокол для покрытия мембранной мембраны подвала и введения сфероидов моторных нейронов. (A)Покрытие мембранной матрицы подвала в канале чипа культуры ткани. (B)введение MNS в отверстие чипа. (C)Культура среднего изменения стремлением исчерпаны среды. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Рисунок 4: 2D и 3D дифференциация моторных нейронов. (A)Курс времени репрезентативной дифференциации 3D MNS (3D-протокол). Размер МНБ постепенно увеличивался с течением времени. Шкала бар: 500 мкм. (B) Курс времени 2D дифференциации на -D2, D0, D1, D6, D12 (2D протокол). Шкала бар: 500 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Рисунок 5: Характеристика моторных нейронов. (A) (Слева) криозиция MNS окрашенных SMI-32 антитела и DAPI. (Средний) Фазово-контрастное изображение replated MNS на поверхности мембраны подвала матрицы-покрыть. Наблюдалось аксональное удлинение. (справа) Аксоны replated MNS запятнанные с антителами Synapsin iего и Tuj1. Шкала бар: 500 мкм (слева и средним) и 50 мкм (справа). (B)репрезентативное изображение 2D моторных нейронов, иммунолимуловых антителами Tuj и HB9. Шкала бар: 200 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Рисунок 6: Характеристика органоида моторного нерва (MNO), генерируемого в чипе культуры. (A)Репрезентативные изображения удлинения аксона и толстого образования аксонового пучка на D32. Шкала бар: 500 мкм. (B)Иммуностимулирование органоидов моторного нерва (MNO) SMI-32 и DAPI. Аксоны и клеточные тела могут быть изолированы путем физической резки. Шкала бар: 1 мм. (C) Чистота белка из аксонов и клеточных тел количественно западной blotting. MAP2, дендритный маркер, не был обнаружен в аксональный белок, в то время как аксональный маркер Tau1 обогащен аксональным белком. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Этот протокол обеспечивает всеобъемлющую процедуру для изготовления человека iPS клеток, полученных моторных нервных органоидов путем спонтанной сборки надежного пучка аксонов, вытянутых из сфероида в чипе культуры тканей.

Трехмерное моторное нервное органоидное поколение

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Мотор Перерезка нерва и Покадровый Визуализация глиальных клеточных поведений в Живом данио рерио

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Протокол трехмерной конфокальной морфометрического анализа астроцитов

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Трехмерных изображений и анализ митохондрии внутри человека Intraepidermal нервных волокон

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

Оптические соединения дополнительной моторной зоны: методология волоконного рассечения, DTI и трехмерной документации

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Поколение и долгосрочное содержание без нервов<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

В естественных условиях Одноместный молекула отслеживания на терминале Пресинаптический двигательного нерва дрозофилы

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Крупномасштабные трехмерных изображений клеточной организации коры головного мозга мыши

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Трехмерное моделирование формы и анализ структур мозга

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D кинематический анализ для функциональной оценки в Крыса Модель Сиатический нерв Давка травмы

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Очистка фибробластов и клеток Шванн от сенсорных и моторных нервов в vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...