Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Denna studie stöddes av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 och 18K19903, Core-2-core program och Beyond AI institute.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

I en del av detta protokoll har ett patent licensierats till Jiksak Bioengineering, Inc. som grundades av Jiro Kawada.

Detta protokoll beskriver bildandet av en motorisk nerv organoid (MNO) som har en axon bunt utvidgas från en motor neuron sfäroid genereras från mänskliga iPS celler. Det bildade axonpaketet är tjockt, flexibelt och välorganiserat i enkelriktade strukturer. Genom att dissekera axonbunten kan axonalt protein med hög renhet och RNA erhållas tillräckligt för biokemiska analyser. Neuronal aktivitet kan mätas i axon buntar och sfäroider med kalcium imaging. Förorening av nukleära och dendritiska proteiner i axonal lysat upptäcktes inte av västra blotting, vilket visar att vår metod effektivt separerade axoner från cellkroppar och dendriter.
En av fördelarna med detta protokoll är den snabba differentiering och generering av MNO utrustad med ett axon-paket, där alla processer kan göras på 4 veckor med 3D-protokollet och 5-6 veckor med 2D-protokollet. Detta är kort jämfört med andra protokoll som vanligtvis tar 3-4 veckor att helt enkelt skilja i MN från embryonala stamceller och iPS-celler17 och det tar ytterligare 2-4 veckor att få axonal förlängning. 3D-protokollet föredras i allmänhet framför 2D-protokollet på grund av kortare differentieringstid, färre steg och minskade tekniska risker utan dissociationssteget jämfört med 2D-protokollet. Det mikrofluidiska vävnadskulturchipet utformades på ett sätt så att MNS axoner kan förlängas mot det andra facket genom mikrokanal, vilket underlättar bildandet av en bunt axoner genom att inducera axo-axonal interaktioner och affinitet mellan axoner. På grund av den enkla experimentella uppsättningen kan alla protokoll som beskrivs här inte bara utföras av bioengineers, som är bekanta med manipulering av ett vävnadskulturchip, utan också biologer och neuroforskare som inte är bekanta med mikrofluidik och mikrotillverkningstekniker. Det bör noteras att steg 1 och 2 också kan utföras med hjälp av en extern tillverkningstjänst.
Ett av de kritiska stegen för att utföra protokollet är en sekventiell förändring av kulturmediet. Det rekommenderas att helt ändra kulturmediet vid varje steg under differentiering så att faktorer i det använda mediet inte stör MN-differentiering. En annan kritisk punkt i detta protokoll är att upprätthålla odifferentierade iPS-celler i god kvalitet. Kvaliteten på den ursprungliga iPS-cellkulturen påverkar avsevärt effektiviteten för att erhålla motoriska nervceller och MNO. En annan punkt är att diametern på MNS ska vara mindre än storleken på chipets hål (1,5 mm). Större sfäroider kan inte komma in i kammaren, och potentiellt uppleva allvarlig hypoxisk nekros i mitten delen. Storleken på MNSs kan styras genom att ändra ett initialt såddnummer av iPS-celler (i 3D-protokoll) eller motoriska nervceller (i 2D-protokoll). Cellernas såddtäthet bör optimeras för varje iPS-cellinje.
Compartmentalized mikrofluidic enheter med mikrogrooves och små por filter har använts i stor utsträckning för att separera axoner från cellkroppar och dendriter. Denna teknik kan också skilja axoner från cellkroppar och dendrit, med överlägsen överflöd av axoner i buntade vävnader. Jämfört med de andra metoderna är en viktig begränsning av denna metod att den inte kan separera två olika odlingsmedier i den nuvarande utformningen av vävnadskulturchipet, vilket hindrar förmågan att samkultur av två olika celler som kräver två distinkta medier. En annan begränsning är att PDMS-chippet satte förutbestämda begränsningar för vävnadens storlek. En sfäroid som är större än hålet kan inte komma in i kammaren, och axon-bunten kan inte bli tjockare än bredden på mikrofluidkanalen.
Denna metod kan tillämpas på andra typer av nervceller. Vår grupp har visat förmåga att modellera ett cerebralt område med hjälp av en modifierad metod i kombination med cerebrala organoid tekniker18. När sfäroider infördes i båda facken och axons spontant långsträckta ömsesidigt mot varje sfäroid, och därefter en axon bunt bildas spontant. Som ett resultat kan två när sfäroider anslutas genom en axon bunt, och vävnaden kan erhållas som en bit. Detta visar att tillvägagångssättet är mycket mångsidigt för att bilda axon bunt vävnader oavsett neuronala celltyper. I detta protokoll användes mänskliga iPS-celler, men andra stamceller inklusive mänskliga ES-celler och mänskliga neurala stamceller kan användas med modifieringar av det presenterade protokollet. 3D-sfäroider av nervceller kan genereras av olika protokoll19,20. Denna metod för att göra vävnader med ett axon-paket kan potentiellt kombineras i framtiden med de andra differentieringsprotokollen för att göra 3D MN-sfäroid. Dessutom kan axonpaketets tjocklek och längd styras genom att helt enkelt ändra bredden och höjden på mikrokanalerna i vävnadskulturchipet för framtida utveckling.
Vi tror att detta protokoll kan användas för drogtester och screening och kan bidra till förståelsen av mekanismer som ligger till grund för utvecklingen och sjukdomarna hos axonfascicles.

Spinal motor nervceller (MN) utvidgar axlar till skelettmuskler för att kontrollera kroppens rörelse. Deras axonalbanor är mycket organiserade och reglerade i utvecklingsprocessen. Trots många studier om axon förlängning och vägledning1, mekanismer för organiserad axon bunt bildas är fortfarande under utredning. Axons av motoriska nervceller skadas ofta av neurodegenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS)2, men patofysiologiska mekanismer för skador på axon fascicles är dåligt förstådda. Således krävs en fysiologisk och patologisk modell för att rekapitulera axon bunt bildas och regression i fältet.
En mänsklig stamcellsbaserad motorisk neuron är en lovande plattform för att förstå utveckling och sjukdomar som ALS3. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) kan användas för att modellera sjukdomar med hjälp av patientbaserade celler. Hittills har olika differentieringsmetoder från pluripotenta stamceller till MN rapporterats4,5,6. Axons av nervceller i tvådimensionell kultur är dock slumpmässigt orienterade och rekapitulerar inte in vivo mikromiljö inom utveckla nerver där axoner är enkelriktade monterade genom täta axo-axonal interaktioner7. För att övervinna denna fråga har vi utvecklat en teknik för att generera en tredimensionell vävnad som liknar motornerv från mänskliga iPS-celler8, och namngav vävnaden som motorisk nervorganoid (MNO). MNO består av cellkroppar belägna i en motorisk neuronsfäroid (MNS) och en axonal fascicle utsträckt från sfäroiden. Axonerna i fascicle är enkelriktade orienterade, vilket liknar axoner i att utveckla motoriska nerver. Därför ger MNOs unikt en fysiologisk axonal mikromiljö, vilket inte gjordes av några andra tidigare utvecklade neuronal kulturmetoder.
I detta protokoll beskriver vi metoder för vävnad kultur chips tillverkning, snabb motor neuron differentiering och motor nerv organoid bildas i utvecklade chips. Vårt mjukpapperskulturchip är mycket enkelt, och det innehåller bara ett fack för att acceptera en sfäroid, en mikrokanal för att bilda ett axonpaket och ett fack för att inhysa axonterminaler. Enheten innehåller inte komplexa strukturer inklusive mikrogroover eller mikroporfilter som ofta används för att separera axoner och cellkroppar efter storlek9,10. Därför kan våra enheter enkelt tillverkas genom att följa stegen som beskrivs i detta protokoll om en fotolitografiinställning är tillgänglig.
Snabb differentiering av mänskliga iPS-celler uppnås med en optimerad kombination av inducerande och mönstringsfaktorer (SB431542, LDN-193189, retinsyra (RA) och utjämnade agonist (SAG)) och accelerationsfaktorer (SU5402 och DAPT). Det har rapporterats att kombinationen av SU5402 och DAPT påskyndar differentiering av perifera nervceller och neurala vapenceller11. I det här protokollet erbjuder vi tre olika metoder för att generera MNOs, så att läsarna kan bestämma en metod som är mest anpassad till deras behov. Vi rekommenderar att du utför differentiering av mänskliga iPS-celler efter att ha bildat en sfäroid (3D-metoden), eftersom den differentierade MNS kan överföras direkt till ett vävnadskulturchip. Alternativt kan mänskliga iPS-celler differentieras till motoriska nervceller i monolayer (2D) kultur, och sedan skapas till tredimensionella motoriska neuron sfäroider som vi tidigare rapporterat8. Vi har uppdaterat protokollet, och med den tredimensionella differentieringsmetod som beskrivs i detta protokoll kan övergången från 2D till 3D undvikas och MNOs kan erhållas med kortare differentieringstid, färre steg och minskade tekniska risker utan dissociationssteget. Kommersiellt tillgängliga nervceller kan också användas för att generera MNS för att minska tiden för differentiering.
För att generera en MNO odlade vi en MNS i vävnadskulturchipet. Axonerna sträcker sig från sfäroiden och sträcker sig in i mikrokanal där axoner samlas och justerar enkelriktat. Detta underlättar axo-axonal interaktion och spontan bildning av en tätt sammansatt enkelriktad bunt vävnad av axoner i mikrokanal, vilket uppnås unikt genom detta protokoll, medan antingen spontan buntbildning eller guidad axonal orientering ensam kan uppnås genom andra protokoll12,13,14. I ett typiskt experiment migrerar få celler ut från sfäroider till mikrokanal och de flesta celler stannar i närheten av sfäroider. Denna metod gör det möjligt att spontant separera axoner från sfäroiderna utan att använda storleksberoende fysiska barriärer (t.ex. mikrogroover eller mikroporfilter) för att separera axoner från cellkroppar.
Den resulterande MNO kan genomgå olika undersökningar, inklusive morfologiska, biokemiska och fysiska analyser. Cellkroppen och den förlängda axonbunten kan isoleras fysiskt genom skärning och kan analyseras separat för nedströmsexperiment, t.ex. biokemiska analyser. Biologiska material inklusive RNA och protein kan isoleras från bara några axon buntar för regelbundna biokemiska analyser inklusive RT-PCR och western blotting. Här beskriver vi ett protokoll för att generera motorisk nervorganoid från iPS-celler, som erbjuder en attraktiv fysiologisk och patologisk modell för att studera den mekanism som ligger till grund för utveckling och sjukdom hos axonfascicles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

En fascicle av axlar är ett av de viktigaste strukturella motiven som observeras i nervsystemet. Störningar av axon fascicles kan orsaka utvecklingsmässiga och neurodegenerativa sjukdomar. Även om många studier av axoner har utförts, är vår förståelse av bildandet och dysfunktionen av axon fascicles fortfarande begränsad på grund av bristen på robusta tredimensionella in vitro-modeller. Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för snabbgenerering av en motorisk nervorganoid (MNO) från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPS) i ett mikrofluidiskt baserat vävnadskulturchip. För det första beskrivs tillverkning av chips som används för metoden. Från mänskliga iPS-celler bildas en motorisk neuronsfäroid (MNS). Därefter överförs den differentierade MNS till chippet. Därefter växer axoner spontant ut ur sfäroiden och monteras i en fascicle inom en mikrokanal utrustad i chipet, vilket genererar en MNO-vävnad som bär en bunt axoner som förlängs från sfäroiden. För nedströmsanalysen kan MNOs tas ut ur chipet som ska fixeras för morfologiska analyser eller dissekeras för biokemiska analyser, liksom kalciumavbildning och multielektrodmatrisinspelningar. MNOs som genereras med detta protokoll kan underlätta drogtester och screening och kan bidra till förståelse för mekanismer som ligger till grund för utveckling och sjukdomar hos axonfascicles.

Motoriska nervceller differentierades inom 12-14 dagar i 3D-differentieringsförfaranden(figur 4 och figur 5). Viktigt, mer än 60% av cellerna uttryckte motor neuron markör HB9 under differentiering. Immunohistokemi visade att cirka 80% av cellerna i MNS var SMI32-positiva motoriska nervceller. HB9 och SMI32 är de etablerade tidiga motoriska neuronmarkörerna15,16. Uttrycket av HB9 och SMI32 är de viktigaste parametrarna som måste bekräftas för att säkerställa cellulär identitet hos motoriska nervceller. Efter införandet av en MNS i kulturchipet sträcker sig axoner in i kanalen och ett axonpaket bildas. På grund av mikrokanaler som fungerar som fysiska guider förtärs axoner från MNS och bildar ett paket med axo-axonal interaktion (Figur 6A). Det är viktigt att bekräfta bildandet av axon-bunten genom mikroskopisk observation för att bekräfta genereringen av en MNO. En framgångsrik MNO bär en axonbunt bredare än 50 μm och få isolerade axoner ur bunten i kanalen. Inledande förlängning av axoner kan observeras 24 timmar efter införandet av sfäroiden. Inom de närmaste 3-4 dagarna nådde axonerna till mitten av mikrokanal och når sedan till andra änden inom ytterligare 10 dagar (figur 6A). Följaktligen monterade axons och bildade en rak och enkelriktad bunt i 2-3 veckor i ett chip, och neuronal verksamhet observerades därefter.
Motoriska nervorganoider kan samlas in från chippet genom att pdms lossas från mikroskopglaset för biologisk analys (Figur 6B). Axon-buntar och cellkroppar kan dissekeras och isoleras genom att skära med en kirurgisk kniv eller pincett under ett mikroskop(figur 6B). Dessa biologiska material inklusive RNA och protein kan användas för regelbundna biokemiska analyser som RT-PCR och western blotting. I axonbuntar av MNOs detekteras inte nukleära eller dendritiska makerproteiner i västra blotting(figur 6C).
I kombination med en kalciumindikator (Fluo-4 AM) kan neuronal aktivitet fångas i vävnadskulturchipet. Spontan aktivitet av motoriska nervceller i sfäroiden och axon bunt observerades inom MNO. De neurala aktiviteterna observerades också med hjälp av ett multielektrodmatsystem.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Figur 1: Dimensionen av PDMS vävnadskulturchip. (A) Fotomask av vävnadskulturchipet. B)Mått på mikrokanal i vävnadskulturchipet. Baskammarens diameter för att hålla motorisk neuronsfäroid är 2 mm och hålet i PDMS ovanför kammaren är 1,5 mm. Bredden och höjden på en mikrokanal som överbryggar två kammare är båda 150 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Figur 2: Schematisk illustration av motorisk neuron differentiering. (A) Differentiering steg involverade neural induktion, mönstring i motor neuron härstamning och mognad av motoriska nervceller. (B) Två alternativ för att skapa motorisk neuron sfäroid (MNS) från iPS celler: 3D protokoll och ett 2D protokoll med dissociation steg av motoriska nervceller. Motorisk nervorganoid (MNO) kan erhållas genom båda protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Figur 3: Steg för steg protokoll för källaren membran matris beläggning och motor neuron sfäroid introduktion. (A)Källarmembranmatrisbeläggning i vävnadskulturchipets kanal. B)MNS förs in i chippets hål. C)Förändring av kulturmediet genom strävan efter uttömt medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Figur 4: 2D- och 3D-motorisk neurondistans. A)Tidskurs för representativ 3D MNS-differentiering (3D-protokoll). Storleken på MNS ökade gradvis med tiden. Skalstång: 500 μm. B) Tidskurs för 2D-differentiering på -D2, D0, D1, D6, D12 (2D-protokoll). Skalstång: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Figur 5: Karakterisering av motoriska nervceller. (A)(vänster) En cryosection av en MNS färgas med SMI-32 antikroppar och DAPI. - Jag har inte tid med det här. En fas-kontrast bild av replated MNS på en källare membran matrisbelagd yta. Axonal förlängning observerades. -Jag har inte tid med det här. Axons av replated MNS färgas med Synapsin I och Tuj1 antikroppar. Skalstång: 500 μm (vänster och mitten) och 50 μm (höger). (B) En representativ bild av 2D motor neuroner immunostained med Tuj och HB9 antikroppar. Skalstång: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Figur 6: Karakterisering av en motorisk nervorganoid (MNO) som genereras i ett odlingschip. A)Representativa bilder av axonförlängning och tjock axonbuntbildning på D32. Skalstång: 500 μm. B)Immunostaining av motorisk nervorganoid (MNO) med SMI-32 och DAPI. Axoner och cellkroppar kan isoleras genom fysisk skärning. Skalstång: 1 mm. ( C )Proteintsrenhet från axoner och cellkroppar kvantifierade genom western blotting. MAP2, en dendritisk markör, upptäcktes inte i axonal protein, medan axonal markör Tau1 berikas i axonal protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Detta protokoll ger ett omfattande förfarande för att fabricera mänskliga iPS cell-härledda motor nerv organoid genom spontan montering av en robust bunt axons utvidgas från en sfäroid i en vävnad kultur chip.

Tredimensionell motorisk nervorganoidgeneration

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motorisk nerv transection och Time-lapse avbildning av stödjeceller Beteenden Live Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Protokoll för Tredimensionell Confocal Morfometrisk Analys av Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Tredimensionell avbildning och analys av mitokondrier inom mänskliga Intraepidermal nervfibrer

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

Fiberanslutningar av det kompletterande motorområdet som reviderats: Metod för fiberdissektion, DTI och tredimensionell dokumentation

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generering och långvarigt underhåll av nervfria<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Singel-molekyl spårning i Drosophila presynaptiska Motor nerv terminalen

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Storskaliga tredimensionell avbildning av cellulära organisation i mus hjärnbarken

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Tredimensionell form modellering och analys av hjärnstrukturer

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analys för funktionell utvärdering i Rat Modell av Sciatic Nerve Crush Skada

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Rening av fibroblaster och schwannceller från sensoriska och motoriska nerver i Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...