Name: three-dimensional motor nerve organoid generation
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği (JSPS) Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibeleri 17H05661 ve 18K19903, Core-2-core programı ve Beyond AI enstitüsü tarafından desteklendi.

<ol>
	<li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding.">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933 (2010).</li><li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS.">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li><li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent.">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons.">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li><li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Src/c-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li><li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+axons+tell+each+other:+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly.">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li><li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li><li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons.">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421 (2018).</li><li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips.">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250 (2019).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors.">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li><li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions.">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids.">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li><li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output.">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li><li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li><li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1.">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449 (2014).</li><li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions.">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor.">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li></ol>

Bu protokolün bir parçası olarak, Jiro Kawada tarafından kurulan Jiksak Bioengineering, Inc.'e bir patent lisanslanmıştır.

Bu protokol, insan iPS hücrelerinden üretilen bir motor nöron küreselden uzatılmış bir akson demetine sahip bir motor sinir organoidinin (MNO) oluşumunu açıklar. Oluşan akson demeti kalın, esnek ve tek yönlü yapılarda iyi organize edilmiş. Akson demetinin diseksiyonu ile biyokimyasal analizler için yüksek saflıkta aksonal protein ve RNA elde edilebilir. Nöronal aktivite kalsiyum görüntüleme ile akson demetleri ve sferoidlerde ölçülebilir. Aksonal lisattaki nükleer ve dendritik proteinlerin kirlenmesi batı şişkinliği ile tespit edilmedi ve yöntemimizin aksonları hücre gövdelerinden ve dendritlerden verimli bir şekilde ayırdığını gösterdi.
Bu protokolün avantajlarından biri, tüm işlemlerin 3D protokol ile 4 haftada ve 2D protokol kullanılarak 5-6 haftada yapılabileceği bir akson demeti ile donatılmış MNO'nun hızlı farklılaşması ve üretilmesidir. Bu, embriyonik kök hücrelerden ve iPS hücrelerinden 17'ye MN'ye ayırt edilmesi tipik olarak3-4 hafta süren diğer protokollere kıyasla kısadır ve aksonal uzama elde etmek 2-4 hafta daha sürer. 3D protokolü, 2D protokolüne kıyasla ayrışma adımı olmadan daha kısa farklılaşma süresi, daha az adım ve azaltılmış teknik riskler nedeniyle genellikle 2D protokole göre tercih edilir. Mikroakışkan tabanlı doku kültürü çipi, MNS'nin aksonlarının mikrokanal aracılığıyla diğer bölmeye doğru uzaması için tasarlanmıştır, bu da aksonlar arasında akson etkileşimleri ve benzeşimi teşvik ederek bir akson demetinin oluşumunu kolaylaştırır. Basit deneysel kurulum nedeniyle, burada açıklanan tüm protokoller sadece bir doku kültürü çipinin manipülasyonuna aşina olan biyomühendisler tarafından değil, aynı zamanda mikroakışkanlara ve mikrofabrikasyon tekniklerine aşina olmayan biyologlar ve sinirbilimciler tarafından da gerçekleştirilebilir. Adım 1 ve 2'nin harici bir imalat hizmeti kullanılarak da gerçekleştirilebileceği unutulmamalıdır.
Protokolü gerçekleştirmek için kritik adımlardan biri, kültür ortamının sıralı bir değişimidir. Harcanan ortamdaki faktörlerin MN farklılaşmasını bozmaması için farklılaşma sırasında her adımda kültür ortamının tamamen değiştirilmesi önerilir. Bu protokolün bir diğer kritik noktası, farklılaşmamış iPS hücrelerini iyi kalitede tutmaktır. İlk iPS hücre kültürünün kalitesi, motor nöronlar ve MNO elde etme verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Başka bir nokta, MNS çapının talaşın deliğinin boyutundan (1,5 mm) daha küçük olması gerektiğidir. Daha büyük küreseller odaya giremez ve potansiyel olarak orta kısımda şiddetli hipoksik nekroz yaşarlar. MNS'lerin boyutu, iPS hücrelerinin (3D protokolde) veya motor nöronların (2D protokolde) ilk tohumlama sayısı değiştirilerek kontrol edilebilir. Hücrelerin tohumlama yoğunluğu her iPS hücre hattı için optimize edilmelidir.
Mikrogroovlar ve küçük gözenek filtreleri ile bölmeli mikroakışkan cihazlar, aksonları hücre gövdelerinden ve dendritlerden ayırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu teknik ayrıca aksonları hücre gövdelerinden ve dendritten ayırabilir, demetlenmiş dokularda üstün akson bolluğu ile. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntemin önemli bir sınırlaması, doku kültürü çipinin mevcut tasarımında iki farklı kültür medyasını ayıramamasıdır, bu da iki farklı ortam gerektiren iki farklı hücrenin ortak kültür yeteneğini engeller. Diğer bir sınırlama, PDMS çipinin dokunun boyutuna önceden belirlenmiş bir kısıtlama koymasıdır. Delikten daha büyük bir küresel odaya giremez ve akson demeti mikroakışkan kanalın genişliğinden daha kalın büyüyemez.
Bu yöntem diğer nöron türlerine de uygulanabilir. Grubumuz serebral organoid teknikleri ile birlikte modifiye bir yöntem kullanarak serebral sistemi modelleme yeteneği göstermiştir18. Kortikal sferoidler her iki bölmeye de sokuldu ve aksonlar her bir küreseloide doğru karşılıklı olarak kendiliğinden uzadı ve daha sonra kendiliğinden bir akson demeti oluştu. Sonuç olarak, iki kortikal sferoid bir akson demeti ile bağlanabilir ve doku tek parça olarak elde edilebilir. Bu, nöronal hücre türlerinden bağımsız olarak akson demet dokuları oluşturmak için yaklaşımın çok yönlü olduğunu göstermektedir. Bu protokolde insan iPS hücreleri kullanılmıştır, ancak sunulan protokolde yapılan değişikliklerle insan ES hücreleri ve insan sinir kök hücreleri de dahil olmak üzere diğer kök hücreler kullanılabilir. Nöronların 3D sferoidleri çeşitli protokoller19,20ile üretilebilir. Bir akson demeti ile doku yapma bu yöntem potansiyel olarak gelecekte 3D MN sferoid yapmak için diğer farklılaşma protokolleri ile kombine edilebilir. Ek olarak, akson demetinin kalınlığı ve uzunluğu, gelecekteki gelişmeler için doku kültürü çipinin mikrokanellerinin genişliği ve yüksekliği değiştirilerek kontrol edilebilir.
Bu protokolün ilaç testi ve taraması için kullanılabileceğine ve akson fasiküllerinin gelişiminin ve hastalıklarının altında kalan mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunabileceğine inanıyoruz.

Spinal motor nöronlar (MN), vücut hareketini kontrol etmek için aksonları iskelet kaslarına uzatır. Aksonal yörüngeleri gelişim sürecinde son derece organize ve düzenlenmiştir. Axon uzatma ve rehberlik1ile ilgili birçok çalışmaya rağmen, organize akson demeti oluşumu için mekanizmalar hala incelenmektedir. Motor nöronların aksonları genellikle amyotrofik lateral skleroz (ALS)2gibi nörodejeneratif hastalıklardan zarar görür, ancak akson fasiküllerindeki hasarın patofizyolojik mekanizmaları iyi anlaşılmaz. Bu nedenle, alanda akson demeti oluşumunu ve gerilemesini rekapitüle etmek için fizyolojik ve patolojik bir model gereklidir.
İnsan kök hücre türevi motor nöron, ALS3gibi gelişimi ve hastalıkları anlamak için umut verici bir platformdur. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPS hücreleri) hasta kaynaklı hücreler kullanılarak hastalıkları modellemek için kullanılabilir. Bugüne kadar pluripotent kök hücrelerden MN'ye çeşitli farklılaşma yöntemleribildirilmiştir 4,5,6. Bununla birlikte, iki boyutlu kültürdeki nöronların aksonları rastgele yönlendirilir ve aksonların yoğun axo-aksonal etkileşimler yoluyla tek yönlü olarak bir araya getirildiği gelişen sinirler içinde in vivo mikroçevriciliği rekapitüle etmez7. Bu sorunun üstesinden gelmek için, insan iPS hücrelerinden motor sinire benzeyen üç boyutlu bir doku oluşturmak için bir teknik geliştirdik8ve dokuyu motor sinir organoidi (MNO) olarak adlandırdık. MNO, bir motor nöron sferoidinde (MNS) bulunan hücre gövdelerinden ve sferoidden uzatılmış bir aksonal fasikülden oluşur. Fasiküldeki aksonlar, motor sinirlerin gelişimindeki aksonlara benzeyen tek yönlüdür. Bu nedenle, MNO'lar benzersiz olarak, daha önce geliştirilen diğer nöronal kültür yöntemleri tarafından yapılmayan fizyolojik bir aksonal mikroçevronment sağlar.
Bu protokolde, geliştirilen çiplerde doku kültürü yongaları imalatı, hızlı motor nöron farklılaşması ve motor sinir organoid oluşumu için yöntemler açıklanmaktadır. Doku kültürü çipimiz çok basittir ve sadece bir küresel kabul etmek için bir bölme, bir akson demeti oluşturmak için bir mikro kanal ve axon terminallerini muhafaza etmek için bir bölme içerir. Cihaz, genellikle aksonları ve hücre gövdelerini9,10boyutuna göre ayırmak için kullanılan mikrogroovlar veya mikropor filtreleri de dahil olmak üzere karmaşık yapılar içermez. Bu nedenle, bir fotolithografi kurulumu mevcutsa, cihazlarımız bu protokolde açıklanan adımları izleyerek kolayca üretilebilir.
İnsan iPS hücrelerinin hızlı farklılaşması, indükleme ve desenleme faktörlerinin (SB431542, LDN-193189, retinoik asit (RA) ve yumuşatılmış agonist (SAG)) ve ivme faktörlerinin (SU5402 ve DAPT) optimize edilmiş bir kombinasyonu ile elde edilir. SU5402 ve DAPT kombinasyonunun periferik nöronların ve nöral kret hücrelerinin farklılaşmasını hızlandırdığı bildirilmiştir11. Bu protokolde, okuyucuların ihtiyaçlarına en uygun bir yönteme karar verebilmeleri için MNO'lar oluşturmak için üç farklı yöntem sunuyoruz. Farklılaştırılmış MNS doğrudan bir doku kültürü çipine aktarılabildiğinden, bir küresel (3D yöntem) oluşturduktan sonra insan iPS hücrelerinin farklılaştırılmasını öneririz. Alternatif olarak, insan iPS hücreleri monolayer (2D) kültüründe motor nöronlara ayırt edilebilir ve daha önce bildirdiğimiz gibi üç boyutlu motor nöron küresellere oluşturulabilir8. Protokolü güncelledik ve bu protokolde açıklanan üç boyutlu farklılaşma yöntemi ile 2D'den 3D'ye geçiş önlenebilir ve MNO'lar ayrışma adımı olmadan daha kısa farklılaşma süresi, daha az adım ve azaltılmış teknik risklerle elde edilebilir. Piyasada bulunan nöronlar, farklılaşma süresini azaltmak için MNS üretmek için de kullanılabilir.
Bir MNO oluşturmak için, doku kültürü çipinde bir MNS kültürü yaptık. Aksonlar küreselden uzaklaşır ve aksonların tek yönlü olarak toplandığı ve hizalandığı mikro kanala uzanır. Bu, mikrokanalde sıkıca monte edilmiş tek yönlü akson demet dokusunun axo-aksonal etkileşimini ve kendiliğinden oluşumunu kolaylaştırır, bu protokolle benzersiz bir şekilde elde edilirken, spontan demet oluşumu veya kılavuzlu aksonal yönelim tek başına diğer protokoller12 , 13,14ile elde edilebilir. Tipik bir deneyde, çok az hücre küresellerden mikro kanallara göç eder ve çoğu hücre sferoidlerin yakınında kalır. Bu yöntem, aksonları hücre gövdelerinden ayırmak için boyuta bağımlı fiziksel bariyerler (örneğin, mikrogroovlar veya mikropore filtreleri) kullanmadan aksonların sferoidlerden kendiliğinden ayrılmasını sağlar.
Ortaya çıkan MNO morfolojik, biyokimyasal ve fiziksel analizler de dahil olmak üzere çeşitli incelemelere tabi tutulabilir. Hücre gövdesi ve genişletilmiş akson demeti kesilerek fiziksel olarak izole edilebilir ve biyokimyasal tahliller gibi aşağı akış deneyleri için ayrı ayrı analiz edilebilir. RNA ve protein gibi biyolojik malzemeler, RT-PCR ve batı şişkinliği de dahil olmak üzere düzenli biyokimyasal tahliller için sadece birkaç akson demetinden izole edilebilir. Burada, akson fasiküllerinin gelişiminin ve hastalığının altında kalan mekanizmayı incelemek için çekici bir fizyolojik ve patolojik model sunan iPS hücrelerinden motor sinir organoidi üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#181;l Wide Bore Pipet Tips</td>
			<td>BMBio</td>
			<td>BMT-200WRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Violamo</td>
			<td>2-8588-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>ICT</td>
			<td>AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>020-12913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Dojindo Laboratories</td>
			<td>CS22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth factor reduced Matrigel (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB9 Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-22542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wako</td>
			<td>085-09355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell motor neuron (commercially available human iPS cell-derived motor neurons)</td>
			<td>Cellular Dynamics</td>
			<td>R1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (IPA)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA probe</td>
			<td>Alpha MED Scientific inc</td>
			<td>MED-P5004A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100x) (NEAA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>S9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR Plus</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Wako</td>
			<td>141-08941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 2100</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>#SU-8 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prime surface 96U</td>
			<td>Sumitomo Bakelite</td>
			<td>MS-9096U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReLeSR (passaging reagent)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>05872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>186-01114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Wako</td>
			<td>192-16541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>SUMCO</td>
			<td>PW-100-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td>Dow Toray</td>
			<td>Silpot 184 w/c kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smi32 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU5402</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 Developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>Y020100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Ab1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express liquid without phenol red (dissociation solution)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Wako</td>
			<td>030-24021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional motor nerve organoid generation

Akson fasikülleri sinir sisteminde gözlenen başlıca yapısal motiflerden biridir. Akson fasiküllerinin bozulması gelişimsel ve nörodejeneratif hastalıklara neden olabilir. Her ne kadar çok sayıda akson çalışması yapılmış olsa da, sağlam üç boyutlu in vitro modellerin eksikliği nedeniyle akson fasiküllerinin oluşumu ve işlev bozukluğu anlayışımız hala sınırlıdır. Burada, mikroakışkan tabanlı bir doku kültürü çipinde insan kaynaklı pluripotent sap (iPS) hücrelerinden bir motor sinir organoidinin (MNO) hızlı üretimi için adım adım bir protokol açıklıyoruz. İlk olarak, yöntem için kullanılan çiplerin imalatı açıklanmaktadır. İnsan iPS hücrelerinden motor nöron sferoid (MNS) oluşur. Daha sonra, farklılaştırılmış MNS çipe aktarılır. Bundan sonra, aksonlar kendiliğinden küreselden büyür ve çipte bulunan bir mikrokanal içinde bir fasikül haline gelir ve bu da küreselden uzatılmış bir akson demeti taşıyan bir MNO dokusu oluşturur. Aşağı akış analizi için, MNO'lar morfolojik analizler için sabitlenecek çipten çıkarılabilir veya biyokimyasal analizlerin yanı sıra kalsiyum görüntüleme ve çoklu elektrot dizi kayıtları için incelenebilir. Bu protokol ile oluşturulan MNO'lar ilaç testini ve taramasını kolaylaştırabilir ve aksion fasiküllerinin gelişiminin ve hastalıklarının altında kalan mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Motor nöronlar 3D farklılaşma işlemlerinde 12-14 gün içinde farklılaştırılmıştır (Şekil 4 ve Şekil 5). Daha da önemlisi, hücrelerin% 60'ından fazlası farklılaşma sırasında motor nöron belirteci HB9'ı ifade etti. İmmünohistokimya, MNS'deki hücrelerin yaklaşık% 80'inin SMI32 pozitif motor nöronlar olduğunu ortaya koydu. HB9 ve SMI32, kurulan erken aşama motor nöron belirteçleridir15,16. HB9 ve SMI32 ifadesi, motor nöronların hücresel kimliğini sağlamak için onaylanması gereken temel parametrelerdir. Kültür yongasına bir MNS girdikten sonra, aksonlar kanala uzanır ve bir akson demeti oluşur. Fiziksel kılavuz olarak hizmet veren mikrokanaller nedeniyle, aksonlar MNS'den uzaktır ve axo-axonal etkileşim ile bir demet oluşturur (Şekil 6A). Bir MNO'nun oluşumunu doğrulamak için mikroskobik gözlemle akson demetinin oluşumunu onaylamak önemlidir. Başarılı bir MNO, kanaldaki demetin dışında 50 μm'den daha geniş bir akson demeti ve birkaç izole akson taşır. Aksonların ilk uzaması, sferoidin girişinden 24 saat sonra gözlemlenebilir. Sonraki 3-4 gün içinde, aksonlar mikrokananın merkezine ulaştı ve daha sonra ek 10 gün içinde diğer uca ulaşır (Şekil 6A). Sonuç olarak, aksonlar bir çipte 2-3 hafta içinde düz ve tek yönlü bir demet oluşturdular ve bundan sonra nöronal aktiviteler gözlendi.
Motor sinir organoidleri biyolojik analiz için PDMS'yi mikroskop camından ayırarak çipten toplanabilir (Şekil 6B). Akson demetleri ve hücre gövdeleri mikroskop altında cerrahi bıçak veya cımbız kullanılarak kesilerek izole edilebilir (Şekil 6B). RNA ve protein de dahil olmak üzere bu biyolojik malzemeler RT-PCR ve batı şişkinliği gibi düzenli biyokimyasal tahliller için kullanılabilir. MNO'ların akson demetlerinde, batı şişkinliğinde nükleer veya dendritik yapıcı proteinler tespit edilmemiştir (Şekil 6C).
Bir kalsiyum göstergesi (Fluo-4 AM) ile birlikte, doku kültürü çipinde nöronal aktivite yakalanabilir. MNO içinde sferoid ve akson demetinde motor nöronların spontan aktivitesi gözlendi. Ayrıca, sinirsel aktiviteler çok elektrotlu bir dizi sistemi kullanılarak gözlendi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Şekil 1: PDMS doku kültürü çipinin boyutu. (A) Doku kültürü çipinin fotomask. (B) Doku kültürü çipinde mikrokanel boyutları. Motor nöron sferoidini tutmak için taban odasının çapı 2 mm ve odanın üzerindeki PDMS deliği 1,5 mm'dir. İki odacık arasında köprü kuran bir mikrokananın genişliği ve yüksekliği 150 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Şekil 2: Motor nöron farklılaşması şematik illüstrasyonu. (A) Farklılaşma adımları nöral indüksiyon, motor nöron soyuna desenleme ve motor nöronların olgunlaşmasını içeriyordu. (B) iPS hücrelerinden motor nöron küresel (MNS) oluşturmak için iki seçenek: 3D protokol ve motor nöronların ayrışma adımına sahip bir 2D protokol. Motor sinir organoidi (MNO) her iki protokolle de elde edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Şekil 3: Bodrum membran matrisi kaplaması ve motor nöron küresel tanıtımı için adım adım protokol. (A) Doku kültürü çipinin kanalında bodrum membran matrisi kaplaması. (B) Çipin deliğine MNS girişi. (C) Tükenmiş ortamın aspirasyonu ile kültür orta değişimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Şekil 4: 2D ve 3D motor nöron farklılaşması. (A) Temsili 3D MNS farklılaşma süresi (3D protokolü). MNS'nin boyutu zamanla kademeli olarak arttı. Ölçek çubuğu: 500 μm. (B) -D2, D0, D1, D6, D12 (2D protokolü) üzerinde 2D farklılaşma süresi. Ölçek çubuğu: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Şekil 5: Motor nöronların karakterizasyonu. (A) (Sol) SMI-32 antikor ve DAPI ile boyanmış bir MNS kriyoseksiyon. (Orta) Bodrum membran matrisi kaplı bir yüzeyde replated MNS faz kontrast görüntüsü. Aksonal uzama gözlendi. (Sağ) Sinapsin I ve Tuj1 antikorları ile boyanmış replated MNS aksonları. Ölçek çubuğu: 500 μm (Sol ve Orta) ve 50μm (Sağ). (B) Tuj ve HB9 antikorları ile bağışıklık sistemi baskılanmış 2D motor nöronların temsili bir görüntüsü. Ölçek çubuğu: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Şekil 6: Bir kültür çipinde üretilen bir motor sinir organoidinin (MNO) karakterizasyonu. (A) D32'de akson uzama ve kalın akson demeti oluşumunun temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu: 500 μm. (B) Motor sinir organoidinin (MNO) SMI-32 ve DAPI tarafından immünostainingi. Aksonlar ve hücre gövdeleri fiziksel olarak kesilerek izole edilebilir. Ölçek çubuğu: 1 mm. (C) Batı şişkinliği ile ölçülen aksonlardan ve hücre gövdelerinden proteinin saflığı. Bir dendritik belirteç olan MAP2, aksonal proteinde tespit edilmedi, aksional işaretleyici Tau1 ise aksonal proteinde zenginleştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation at JoVE.com

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Bu protokol, bir doku kültürü çipinde bir sferoidden uzatılan sağlam bir akson demetinin kendiliğinden montajı yoluyla insan iPS hücre türevi motor sinir organoidini imal etmek için kapsamlı bir prosedür sağlar.

Üç Boyutlu Motor Sinir Organoid Üretimi

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Fiber Connections of the Supplementary Motor Area Revisited: Methodology of Fiber Dissection, DTI, and Three Dimensional Documentation

Ek Motor Alanında Fiber Bağlantıları Gözden Geçirildi: Fiber Disseksiyonu Metodolojisi, DTI ve Üç Boyutlu Dokümantasyon

The purpose of this study is to show the methodology for the examination of the white matter connections of the supplementary motor area (SMA) complex ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Sinirsiz Kuşak ve Uzun Süreli Bakım<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Beyin Yapılarının Üç Boyutlu Şekil Modellemesi ve Analizi

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

Fibroblastların ve Schwann Hücrelerinin İn vitro duyusal ve motor sinirlerden arındırması

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...