Name: mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

L’élaboration de protocoles et les études présentées dans le présent document ont été appuyées par le financement R01 des NIH (NBIB) (# EB023921) à la FI et au SJS, et par le financement R01 des NIH (NHLBI) (# HL137762) à if et RJL.

Tous les échantillons humains pour cette expérience ont été obtenus conformément à la CISR du Children’s Hospital de Philadelphie. Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées sur approbation de l’IACUC du Children’s Hospital de Philadelphie.
1. Revêtement des surfaces métalliques nues avec PEI-PDT
<ol><li>Laver les coupons en papier d’aluminium inoxydable (1 cm x 1 cm ou 0,65 cm x 1 cm) ou les disques en maille en acier inoxydable avec 2 iso...

<ol>
	<li>Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+managing+in-stent+restenosis:+a+review+of+clinical+data,+from+pathogenesis+to+treatment.">Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment.</a> Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica. 2013, 392584 (2013).</li><li>Mitra, A. K., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+stent+restenosis:+bane+of+the+stent+era.">In stent restenosis: bane of the stent era.</a> Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).</li><li>Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stents:+historical+development,+current+status+and+future+directions.">Coronary stents: historical development, current status and future directions.</a> British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).</li><li>Hoffmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+mechanisms+of+in-stent+restenosis.+A+serial+intravascular+ultrasound+study.">Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).</li><li>Stefanini, G. G., Windecker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent+thrombosis:+no+longer+an+issue+with+newer-generation+drug-eluting+stents.">Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents.</a> Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).</li><li>Palmerini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+with+bioabsorbable+polymer-+versus+durable+polymer-based+drug-eluting+and+bare-metal+stents:+evidence+from+a+comprehensive+network+meta-analysis.">Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).</li><li>Omar, W. A., Kumbhani, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Current+Literature+on+Bioabsorbable+Stents:+a+Review.">The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review.</a> Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).</li><li>Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+Inflammatory+Response+to+Clinically+Relevant+Polymers+by+Manipulating+the+Host+Response+Using+ITIM+Domain-Containing+Receptors.">Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors.</a> Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).</li><li>Oldenborg, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells.">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li><li>vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+'self'+recognition:+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+CD47-modified+biomaterials+to+mitigate+the+immune+response.">The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response.</a> Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).</li><li>Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+inhibition+of+phagocytosis:+the+affinity+of+'marker+of+self'+CD47+for+SIRPalpha+dictates+potency+of+inhibition+but+only+at+low+expression+levels.">Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).</li><li>Slee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+biocompatibility+of+CD47-functionalized+vascular+stents.">Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents.</a> Biomaterials. 87, 82-92 (2016).</li><li>Finley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).</li><li>Inamdar, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+bioactivity+of+pepCD47+attachment+on+stainless+steel+surfaces.">Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces.</a> Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries.">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).</li><li>Moser, K. V., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+monocytes+migrate+through+a+BCEC-monolayer+and+express+microglia-markers+at+the+basolateral+side.">Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side.</a> Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).</li><li>vander Giessen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+inflammatory+sequelae+to+implantation+of+biodegradable+and+nonbiodegradable+polymers+in+porcine+coronary+arteries.">Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries.</a> Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents.">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).</li><li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47.">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li><li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits.">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).</li></ol>

Nous démontrons et décrivons une stratégie chimique relativement nouvelle pour annexer les moieties thérapeutiques de peptide à une surface en acier inoxydable avec l’objectif global de réduire la réactivité de la surface avec les cellules inflammatoires trouvées dans le sang. La chimie du bisphosphonate décrite dans le ci-après implique la formation de liaisons coordonnées entre les oxydes métalliques et les groupes de bisphosphonate de PABT. L’épaisseur du monomère polybisphosphonate formé sur la su...

L’intervention coronaire percutanée est la première ligne de thérapie pour traiter des maladies coronaires (CAO) et implique principalement enfiler les artères maladie. Cependant, la restenose en stent (ISR) et la thrombose stent sont des complications communes liées au déploiement de stent1. L’interaction sanguine à l’interface sang-stent se caractérise par une adsorption presque immédiate des protéines plasmatiques à la surface métallique, suivie de l’attachement et de l’activation des cellules plaquettaire et inflammatoire2. La libération des cytokines inflammatoires et des chimiokines des cellules inflammatoires activées conduit à la modification phénotypique des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) dans le média tunica et déclenche leur migration centripète vers le compartiment intimal. La prolifération du VSMC activé dans l’intima a comme résultat l’épaississement intimal de couche, le rétrécissement de lumen et la restenosis in-stent3. Des endossés d’échappement de drogue (DES) ont été développés pour empêcher la prolifération de VSMC ; cependant, ces médicaments ont un effet cytotoxique hors cible sur les cellules endothéliales4,5. Par conséquent, la thrombose stent tardive est une complication commune liée au DES6,7. Les endoprothènes faits de polymères biodégradables, tels que le poly-L-lactide, se sont montrés très prometteurs dans les expériences animales et les premiers essais cliniques, mais ont finalement été rappelés lorsque l’utilisation clinique « réelle » a démontré leur infériorité par rapport à la3e génération des DES8. Par conséquent, il est nécessaire d’améliorer la biocompatibilité des enfiles métalliques nues pour de meilleurs résultats pour les patients.
CD47 est une protéine transmembrane omniprésente qui inhibe la réponse immunitaire innée lorsqu’elle est liée à son récepteur cognate Signal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9. Le récepteur SIRPα a un domaine de motif inhibiteur de la tyrosine des cellules immunitaires (ITIM) et les événements de signalisation sur SIRPα - interaction CD47 aboutit finalement à la downregulation de l’activation des cellulesinflammatoires 10,11,12,13. La recherche dans notre laboratoire a prouvé que le CD47 recombinant ou son dérivé de peptide, correspondant au domaine ig d’acide aminé 22 de la région extracellulaire de CD47 (pepCD47), peut réduire la réponse immunisée d’hôte à une gamme de biomatériauxmédicalement pertinents 14,,15,,16. Récemment, nous avons démontré que le pepCD47 peut être immobilisé sur des surfaces en acier inoxydable et réduire considérablement la réponse pathophysiologique associée à la restenose. Il convient de noter que les surfaces modifiées pepCD47 sont favorables à des conditions d’utilisation pertinentes telles que le stockage à long terme et la stérilisation à l’oxyded’éthylène 17. À cette fin, pepCD47 peut être une cible thérapeutique utile pour répondre aux limitations cliniques des enfilents endovasculaires.
La stratégie pour l’attachement covalent du pepCD47 à une surface métallique implique une série de nouvelles modifications chimiques de la surface métallique. Les surfaces métalliques sont d’abord recouvertes de bisphosphonate de polyallylamine avec des groupes de thiol latents (PABT), suivies de la dépprotection des thiols et de l’attachement de la polyéthylèneeimine (Î.-P.-É.) aux groupes pyridyldithio installés (PDT). Les groupes PDT de l’Î.-P.-É. non consommés dans la réaction avec des thiols pabt déprotégés sont alors réagis avec pepCD47 incorporant des thiols dans les résidus terminals de cystéine, ayant pour résultat le pepCD47 liant à la surface de métal par l’intermédiaire d’un lien de disulfide14,,17,18. Nous avons utilisé un pepCD47 conjugué au fluorophore (TAMRA-pepCD47) pour déterminer la concentration d’intrants du peptide qui entraîne l’immobilisation maximale du peptide à la surface. Enfin, nous avons évalué la capacité anti-inflammatoire aiguë et chronique des surfaces métalliques enduites pepCD47, ex vivo, à l’aide de l’appareil de boucle Chandler, et de l’essai d’expansion de l’attachement monocyte/macrophage, respectivement.
Cet article fournit un protocole systématique pour l’attachement des peptides thiolated à la surface en métal ; déterminer la densité maximale d’immobilisation du peptide; et évaluer les propriétés anti-inflammatoires des surfaces métalliques enduites pepCD47 exposées au sang entier et aux monocytes isolés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1 M Tris-HCL</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">15567-027</td>
			<td style="width:239px;">pH - 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">4% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">16539-07</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">4% Sodium Citrate</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">S5770</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:184px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">118-156-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">202301</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">203501</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">550979</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:129px;">MCA341</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">201701</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Dimethyl Formammide (DMF)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">39117</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Embra stainless steel grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">E200-SS</td>
			<td>stainless steel mesh mesh disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ficoll Hypaque</td>
			<td style="width:184px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:184px;">ACROS organic</td>
			<td style="width:129px;">148930025</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">goat anti-mouse IgG Alexa Fluor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:129px;">A11030</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:184px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:129px;">402-01</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human pepCD47</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4099101</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">A426P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Metal adapters</td>
			<td style="width:184px;">Leur Fitting</td>
			<td style="width:129px;">6515IND</td>
			<td style="width:239px;">1 way adapter 316 ss 1/4&#34;-5/16&#34; hoes end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Methanol</td>
			<td style="width:184px;">RICCA chemical company</td>
			<td style="width:129px;">4829-32</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Microscope</td>
			<td style="width:184px;">Nikon Eclipse</td>
			<td style="width:129px;">TE300</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pottasium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">P184-500</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">PVC tubes</td>
			<td style="width:184px;">Terumo-CVS</td>
			<td style="width:129px;">60050</td>
			<td style="width:239px;">1/4&#34; X 1/16 8&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">11653</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">161-0302</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodum actetate (C2H3NaO2)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">A13184</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Src peptide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4092599</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen</td>
			<td>Microgroup, Medway, MA</td>
			<td style="width:129px;">20097328</td>
			<td>1 cm X 6 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel foils (AISI 316L)</td>
			<td style="width:184px;">Goodfellow, Coraopolis, PA</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:239px;">100 mm X 100 mm X 0.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4100277</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:282px;">TMB (3,3&#8217; ,5,5&#8217; -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82089</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Tween-20</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">170-6531</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">V12883</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization

Les complications clés associées aux endos métalliques nus et aux endosseurs d’échappement de drogue sont la restenose en stent et la thrombose en stent tardive, respectivement. Ainsi, l’amélioration de la biocompatibilité des enprothents métalliques reste un défi de taille. Le but de ce protocole est de décrire une technique robuste de modification de surface métallique par peptides biologiquement actifs pour augmenter la biocompatibilité des implants médicaux de contact avec le sang, y compris les enprotes endovasculaires. CD47 est un marqueur immunologique spécifique aux espèces de soi et a des propriétés anti-inflammatoires. Des études ont montré qu’un peptide de 22 acides aminés correspondant au domaine Ig de CD47 dans la région extracellulaire (pepCD47), a des propriétés anti-inflammatoires comme la protéine pleine longueur. Les études in vivo chez les rats, et les études ex vivo dans les systèmes expérimentaux de lapin et de sang humain de notre laboratoire ont démontré que l’immobilisation pepCD47 sur les métaux améliore leur biocompatibilité en empêchant l’attachement et l’activation inflammatoires de cellules. Cet article décrit le protocole étape par étape pour la fonctionnalisation des surfaces métalliques et de l’attachement peptidique. Les surfaces métalliques sont modifiées à l’aide de bisphosphate de polyallylamine avec des groupes de thiol latents (PABT) suivis de la dépprotection des thiols et de l’amplification des sites thiol-réactifs par réaction avec la polyéthylènemine installée avec des groupes pyridyldithio (PEI-PDT). Enfin, pepCD47, incorporant des résidus terminals de cystéine reliés à la séquence du peptide central par un double espaceur 8-amino-3,6-dioxa-octanoyl, sont fixés à la surface métallique par des liaisons de disulfide. Cette méthodologie d’attachement peptidique à la surface métallique est efficace et relativement peu coûteuse et peut donc être appliquée pour améliorer la biocompatibilité de plusieurs biomatériaux métalliques.

Les surfaces métalliques sont rendues thiol-réactives pour l’attachement au peptide par une série de modifications chimiques, comme l’illustre la figure 1. L’incubation pabt suivie d’un traitement PEI-PDT rend la surface métallique utilisable pour l’attachement au peptide. Peptide CD47 (pepCD47) contenant des résidus de cystéine à C-terminus joints à la séquence pepCD47 de base par un pont AEEAc double flexible est covalently attaché aux surfaces thiol-réactives par des ...

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Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Présenté ici est un protocole pour l’appending peptide CD47 (pepCD47) aux endonts métalliques utilisant la chimie de polybisphosphonate. La fonctionnalisation des enprothents métalliques à l’aide de pepCD47 empêche l’attachement et l’activation des cellules inflammatoires améliorant ainsi leur biocompatibilité.

Atténuation de l’attachement cellulaire transmissible par le sang aux implants métalliques grâce à l’immobilisation du peptide dérivé du CD47

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Ce protocole comprend une nouvelle stratégie chimique visant à annexer les peptides thérapeutiques aux surfaces métalliques et a le potentiel d’améliorer la biocompatibilité d’un large éventail de biomatériaux métalliques. Il s’agit d’une technique universelle et robuste pour annexer les peptides et les protéines thérapeutiques aux surfaces métalliques nues des bioimplants. Nous avons utilisé cette technologie pour améliorer la biocompatibilité des endoprothents métalliques en appending peptides CD47 afin de prévenir les réponses inflammation qui sont déclenchées par stenting.Commencez par laver les coupons en papier d’aluminium inoxydable ou les disques en maille avec 2-isopropanol dans un shaker pendant cinq minutes. Effectuez ce lavage deux fois, puis lavez les échantillons deux fois avec du chloroforme pendant 10 minutes par lavage. Placer les échantillons d’acier inoxydable nettoyés dans un four à 220 degrés Celsius pendant 30 minutes.Immerger les feuilles cuites au four ou les disques en maille dans la solution 0,5% aqueuse de PABT et les incuber dans un shaker pendant une heure. Lavez les échantillons modifiés par pabt avec de l’eau distillée déionisée cinq fois. Transférer les spécimens dans un nouveau flacon et répéter les lavages.Traiter les échantillons avec tcep pendant 15 minutes à température ambiante sur un shaker. Degas a déionisé l’eau distillée dans un flacon de fond rond avec un dispositif générateur de vide, comme un lyophilisateur, et laver les feuilles ou les disques de maille avec l’eau dégazée cinq fois. Transférer les échantillons sur un nouveau flacon et répéter les lavages.Préparez cinq millilitres de solution PEI-PDT à 1 % en diluant 212,5 microlitres du stock PEI-PDT et 125 microlitres d’acétate de sodium molaire de 0,4 molaire dans l’eau dégazée. Incuber les spécimens en acier inoxydable lavés avec 1 % de PEI-PDT. Remplacer l’air par du gaz argon, sceller les flacons hermétiques et les mélanger sur un shaker pendant une heure.Procéder immédiatement à la conjugaison peptidique ou conserver les échantillons à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Préparez une milligramme par millilitre de solution de stock de peptide humain CD47 en dissolvant la poudre humaine de PEPTide CD47 dans de l’acide acétique dégazé à 50 %, puis préparez la solution de travail en dissolvant 500 microlitres du stock en 4,5 millilitres de PBS dégazé. Incuber les échantillons recouverts de PEI-PDT lavés avec la solution de travail du peptide CD47 à température ambiante avec des secousses pendant une heure.Une fois terminé, lavez les échantillons recouverts de peptide CD47 tels que décrits dans le manuscrit du texte. Après avoir enduit les feuilles métalliques de peptide CD47 ou de peptide brouillé, couper les tubes en PVC d’un quart de pouce en trois morceaux de 38 centimètres de long et insérer jusqu’à huit peptides brouillés non modifiés ou des feuilles de métal modifiées par le peptide CD47 dans trois tubes différents. Recueillir 30 millilitres de sang auprès de donneurs humains en bonne santé exempts de tout médicament anti-plaquettaires, précharger la seringue avec un millilitre de citrate de sodium de 4% pour prévenir la coagulation du sang recueilli.Mettez 10 millilitres de sang dans chaque tube à l’aide d’une seringue de 10 millilitres et connectez les extrémités avec des adaptateurs métalliques. Placez les tubes remplis de sang sur les roues de l’appareil de boucle Chandler et passez le sang le long des feuilles métalliques par rotation des roues à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Égoutter le sang des tubes et l’éliminer selon les exigences de la CISR, puis couper les tubes avec un scalpel pour récupérer les feuilles.Préparez une solution de glutaraldehyde de 2 % en diluant la solution de 70 % dans le tampon cacodylate de sodium avec du chlorure de sodium molaire de 0,1 molaire. Incuber les feuilles dans la solution de glutaraldehyde à 2 % pendant 15 minutes et les conserver à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Avant d’analyser les feuilles métalliques, lavez-les trois fois avec du PBS.Chauffer huit millilitres de PBS dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Préparez une solution de stock de colorant CFDA de 10 millimolaires en ajoutant 90 microlitres de DMSO à un flacon CFDA, puis préparez la solution de travail en ajoutant 75 microlitres du stock CFDA au PBS chaud. Inverser le tube à quelques reprises pour le mélanger et le couvrir de papier d’aluminium.Placer chaque feuille dans un millilitre de colorant CFDA dans une assiette de 24 puits. Couvrir la plaque de papier d’aluminium et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis laver les feuilles trois fois dans PBS et les imager avec un microscope à fluorescence. La concentration de peptide conjugué TAMRA CD47 covalently lié a été quantifiée pour déterminer la densité maximale d’immobilisation du peptide sur la surface métallique.La rétention maximale de peptide était d’environ 180 nanogrammes par centimètre carré, ce qui a été réalisé avec une concentration d’entrée de 100 microgrammes par millilitre. L’immobilisation du peptide conjugué TAMRA CD47 sur les surfaces métalliques modifiées a été corroborée par une microscopie de fluorescence, qui a montré une fluorescence uniforme émise par la surface des disques de maille conjugués au peptide CD47 de TAMRA. Seule une fluorescence minimale a été détectée à la surface des mailles de contrôle qui n’avaient pas la modification, excluant ainsi un peptide cd47 conjugué TAMRA non spécifiquement lié comme principale source de fluorescence.Il a également été confirmé que les surfaces enduites de peptide CD47 montrent une réduction drastique de l’attachement cellulaire transmis par le sang par rapport aux commandes de peptide modifiées et non modifiées brouillées. Les monocytes isolés des cellules de manteau buffy de rat ont été cultivés sur le métal nu et les feuilles d’acier inoxydable CD47-modifiées de peptide. Une atténuation de 58% de l’attachement aigu de monocyte, de leur conversion aux macrophages, et de la prolifération de macrophage a été observée sur les surfaces fonctionnalisées.Tout en essayant ce protocole, il est très important d’effectuer les étapes impliquant de l’eau dégazée ou des reagents à effectuer aussi rapidement que possible et de minimiser l’exposition à l’oxygène. Notre technologie module sélectivement l’interaction cellulaire avec les surfaces métalliques et un essai typique d’identification de type cellulaire, tel que RT-PCR, cytométrie d’écoulement, et immunofluorescence, sont compatibles avec cette technique. Lorsqu’elle est développée pour une gamme de peptide bioactif, cette technologie peut jouer un rôle déterminant dans l’augmentation de la biocompatibilité à l’interface des matériaux tissulaires.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Développement des méthodes de transport des macrophages par le sang des Nanoformulated médicaments antirétroviraux

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Recherche

Bio-ingénierie

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of &#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Génération et récupération des cellules β-Sphéroïdes partir de l&#39;étape de croissance peptidiques hydrogels de PEG-

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Revêtements de graphène pour les implants biomédicaux

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l&#39;impression par microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Ferromagnétique Bare Metal Stent pour endothéliale capture de cellules et de la conservation

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Wet Chemistry and Peptide Immobilisation sur polytétrafluoroéthylène pour l&#39;amélioration de l&#39;adhérence cellulaire

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Immobilisation dirigée de protéine morphogénétique osseuse 2 aux Surfaces solides par Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Surface-immobilisation fonctionnelle des gènes à l’aide de la lithographie de déplacement multipas Strand

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...