Name: mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

Die in diesem Dokument vorgestellten Studien zur Entwicklung von Protokollen und Studien wurden durch die NIH(NBIB) R01-Förderung (EB023921) an IF und SJS und die NIH (NHLBI) R01-Finanzierung (HL137762) an IF und RJL unterstützt.

Alle menschlichen Proben für dieses Experiment wurden in Übereinstimmung mit dem IRB des Children es Hospital of Philadelphia gewonnen. Alle Tierversuche wurden nach Genehmigung der IACUC des Children es Hospital of Philadelphia durchgeführt.
1. Beschichten von Blankmetalloberflächen mit PEI-PDT
<ol><li>Waschen Sie die Edelstahlfolien-Coupons (1 cm x 1 cm oder 0,65 cm x 1 cm) oder Edelstahl-Mesh-Scheiben mit 2-Isopropanol in einem Shaker (60 °C, Geschwindigkeit 200 Rpm)...

<ol>
	<li>Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+managing+in-stent+restenosis:+a+review+of+clinical+data,+from+pathogenesis+to+treatment.">Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment.</a> Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica. 2013, 392584 (2013).</li><li>Mitra, A. K., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+stent+restenosis:+bane+of+the+stent+era.">In stent restenosis: bane of the stent era.</a> Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).</li><li>Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stents:+historical+development,+current+status+and+future+directions.">Coronary stents: historical development, current status and future directions.</a> British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).</li><li>Hoffmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+mechanisms+of+in-stent+restenosis.+A+serial+intravascular+ultrasound+study.">Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).</li><li>Stefanini, G. G., Windecker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent+thrombosis:+no+longer+an+issue+with+newer-generation+drug-eluting+stents.">Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents.</a> Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).</li><li>Palmerini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+with+bioabsorbable+polymer-+versus+durable+polymer-based+drug-eluting+and+bare-metal+stents:+evidence+from+a+comprehensive+network+meta-analysis.">Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).</li><li>Omar, W. A., Kumbhani, D. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells.">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li><li>vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+'self'+recognition:+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+CD47-modified+biomaterials+to+mitigate+the+immune+response.">The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response.</a> Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).</li><li>Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+inhibition+of+phagocytosis:+the+affinity+of+'marker+of+self'+CD47+for+SIRPalpha+dictates+potency+of+inhibition+but+only+at+low+expression+levels.">Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).</li><li>Slee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+biocompatibility+of+CD47-functionalized+vascular+stents.">Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents.</a> Biomaterials. 87, 82-92 (2016).</li><li>Finley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).</li><li>Inamdar, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+bioactivity+of+pepCD47+attachment+on+stainless+steel+surfaces.">Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces.</a> Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries.">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).</li><li>Moser, K. V., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+monocytes+migrate+through+a+BCEC-monolayer+and+express+microglia-markers+at+the+basolateral+side.">Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side.</a> Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).</li><li>vander Giessen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+inflammatory+sequelae+to+implantation+of+biodegradable+and+nonbiodegradable+polymers+in+porcine+coronary+arteries.">Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries.</a> Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents.">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).</li><li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47.">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li><li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits.">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).</li></ol>

Wir zeigen und beschreiben eine relativ neuartige chemische Strategie, um therapeutische Peptidmoieties an eine Edelstahloberfläche anzuhängen, mit dem übergeordneten Ziel, die Reaktivität der Oberfläche mit entzündlichen Zellen im Blut zu reduzieren. Die hier beschriebene Bisphosphonatchemie beinhaltet die Koordinatenbildung zwischen den Metalloxiden und Bisphosphonatgruppen von PABT. Die Dicke der auf der Metalloberfläche gebildeten Polybisphosphonat-Monoschicht überschreitet 5 nm18nicht...

Perkutane koronare Intervention ist die erste Therapielinie zur Behandlung von koronaren Herzkrankheiten (CAD) und beinhaltet in erster Linie das Stents der erkrankten Arterien. In-Stent-Restenose (ISR) und Stentthrombose sind jedoch häufige Komplikationen im Zusammenhang mit stent Deployment1. Die Blutinteraktion an der Blut-Stent-Schnittstelle ist durch eine fast sofortige Adsorption von Plasmaproteinen auf der Metalloberfläche gekennzeichnet, gefolgt von Thrombozyten- und Entzündungszellanhaftung und Aktivierung2. Die Freisetzung der entzündlichen Zytokine und Chemokine aus aktivierten Entzündungszellen führt zur phänotypischen Veränderung der vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in den Tunikamedien und löst deren zentripetale Migration in das Intimfach aus. Die Proliferation des aktivierten VSMC in der Intima führt zu Intimschichtverdickung, Lumenverengung und In-Stent-Restenose3. Drug Eluing Stents (DES) wurden entwickelt, um VSMC Proliferation zu verhindern; jedoch haben diese Medikamente eine off-target zytotoxische Wirkung auf die Endothelzellen4,5. Daher ist die späte Stentthrombose eine häufige Komplikation im Zusammenhang mit DES6,7. Stents aus biologisch abbaubaren Polymeren, wie Poly-L-Laktid, haben in den Tierversuchen und ersten klinischen Studien viel Versprechen gezeigt, wurden aber schließlich zurückgerufen, als die klinische Anwendung im "realen Leben" ihre Unterlegenheit gegenüber der3. Generation des8zeigte. Daher ist es notwendig, die Biokompatibilität von Bare-Metal-Stents für bessere Patientenergebnisse zu verbessern.
CD47 ist ein allgegenwärtig exprimiertes Transmembranprotein, das die angeborene Immunantwort hemmt, wenn es an seinen Kognanorezeptor Signal Regulatory Protein alpha (SIRP)9gebunden ist. Der SIRP-Rezeptor hat eine Immunzell-Tyrosin-Hemmende Motiv (ITIM) Domäne und die Signalereignisse auf SIRP - CD47 Interaktion führen letztlich in der Downregulation der entzündlichen Zellaktivierung10,11,12,13. Untersuchungen in unserem Labor haben gezeigt, dass rekombinantes CD47 oder sein Peptidderivat, das der 22-Aminosäure-Ig-Domäne der extrazellulären Region CD47 (pepCD47) entspricht, die Immunantwort des Wirts auf eine Reihe klinisch relevanter Biomaterialien14,15,16reduzieren kann. Kürzlich haben wir gezeigt, dass pepCD47 auf Edelstahl-Stentoberflächen immobilisiert werden kann und die pathophysiologische Reaktion im Zusammenhang mit Derenose deutlich reduzieren kann. Bemerkenswert ist, dass die pepCD47 modifizierten Oberflächen für relevante Einsatzbedingungen wie Langzeitlagerung und Ethylenoxidsterilisation17geeignet sind. Zu diesem Zweck kann pepCD47 ein nützliches therapeutisches Ziel sein, um die klinischen Einschränkungen von endovaskulären Stents anzugehen.
Die Strategie für die kovalente Befestigung von pepCD47 an einer Metalloberfläche beinhaltet eine Reihe neuartiger chemischer Modifikationen der Metalloberfläche. Die Metalloberflächen werden zunächst mit Polyallaminbisphosphonat mit latenten Thiolgruppen (PABT) beschichtet, gefolgt vom Deschutz der Thiole und der Befestigung von Polyethyleneimin (PEI) mit installierten Pyridyldithio-Gruppen (PDT). PDT-Gruppen von PEI, die in der Reaktion mit degeschützten PABT-Thiolen nicht verbraucht werden, werden dann mit PepCD47 reagiert, die Thiole in die terminalen Cysteinrückstände einbeziehen, was zu einer Bindung von pepCD47 an die Metalloberfläche über eine Disulfidbindung14,17,18führt. Wir verwendeten ein fluorophorkonjugiertes pepCD47 (TAMRA-pepCD47), um die Eingangskonzentration von Peptid zu bestimmen, die zu einer maximalen Oberflächenimmobilisierung des Peptids führt. Schließlich bewerteten wir die akute und chronische entzündungshemmende Kapazität der pepCD47 beschichteten Metalloberflächen ex vivo mit dem Chandler-Loop-Apparat bzw. Monozytenaufsatz/Makrophagen-Expansionstest.
Dieses Papier enthält ein systematisches Protokoll für die Befestigung von thiolierten Peptiden an der Metalloberfläche; Bestimmung der maximalen Immobilisierungsdichte des Peptids; und Bewertung der entzündungshemmenden Eigenschaften von pepCD47 beschichteten Metalloberflächen, die Vollblut und isolierten Monozyten ausgesetzt sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1 M Tris-HCL</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">15567-027</td>
			<td style="width:239px;">pH - 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">4% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">16539-07</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">4% Sodium Citrate</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">S5770</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:184px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">118-156-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">202301</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">203501</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">550979</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:129px;">MCA341</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">201701</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Dimethyl Formammide (DMF)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">39117</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Embra stainless steel grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">E200-SS</td>
			<td>stainless steel mesh mesh disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ficoll Hypaque</td>
			<td style="width:184px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:184px;">ACROS organic</td>
			<td style="width:129px;">148930025</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">goat anti-mouse IgG Alexa Fluor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:129px;">A11030</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:184px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:129px;">402-01</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human pepCD47</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4099101</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">A426P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Metal adapters</td>
			<td style="width:184px;">Leur Fitting</td>
			<td style="width:129px;">6515IND</td>
			<td style="width:239px;">1 way adapter 316 ss 1/4&#34;-5/16&#34; hoes end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Methanol</td>
			<td style="width:184px;">RICCA chemical company</td>
			<td style="width:129px;">4829-32</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Microscope</td>
			<td style="width:184px;">Nikon Eclipse</td>
			<td style="width:129px;">TE300</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pottasium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">P184-500</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">PVC tubes</td>
			<td style="width:184px;">Terumo-CVS</td>
			<td style="width:129px;">60050</td>
			<td style="width:239px;">1/4&#34; X 1/16 8&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">11653</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">161-0302</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodum actetate (C2H3NaO2)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">A13184</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Src peptide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4092599</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen</td>
			<td>Microgroup, Medway, MA</td>
			<td style="width:129px;">20097328</td>
			<td>1 cm X 6 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel foils (AISI 316L)</td>
			<td style="width:184px;">Goodfellow, Coraopolis, PA</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:239px;">100 mm X 100 mm X 0.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4100277</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:282px;">TMB (3,3&#8217; ,5,5&#8217; -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82089</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Tween-20</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">170-6531</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">V12883</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization

Die wichtigsten Komplikationen im Zusammenhang mit Bare-Metal-Stents und Drogen-Eluing-Stents sind In-Stent-Restenose bzw. späte Stentthrombose. Daher bleibt die Verbesserung der Biokompatibilität von Metallstents eine große Herausforderung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine robuste Technik der Metalloberflächenmodifikation durch biologisch aktive Peptide zu beschreiben, um die Biokompatibilität von Blutkontakten mit medizinischen Implantaten, einschließlich endovaskulärer Stents, zu erhöhen. CD47 ist ein immunologischer artenspezifischer Selbstmarker und hat entzündungshemmende Eigenschaften. Studien haben gezeigt, dass ein 22 Aminosäurepeptid, das der Ig-Domäne von CD47 im extrazellulären Bereich (pepCD47) entspricht, entzündungshemmende Eigenschaften wie das Volllängenprotein aufweist. In vivo-Studien an Ratten und Ex-vivo-Studien an Kaninchen- und humanen Blutversuchssystemen aus unserem Labor haben gezeigt, dass die Immobilisierung von PepCD47 auf Metallen ihre Biokompatibilität verbessert, indem sie die anhängliche Zellanhaftung und -aktivierung verhindert. In diesem Artikel wird das Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Funktionalisierung von Metalloberflächen und Peptidbefestigung beschrieben. Die Metalloberflächen werden mit Polyallamin-Bisphosphat mit latenten Thiolgruppen (PABT) modifiziert, gefolgt von Deprotection von Thiolen und Amplifikation von Thiol-reaktiven Stellen durch Reaktion mit Polyethylenimin, das mit Pyridyldithio-Gruppen (PEI-PDT) installiert ist. Schließlich wird pepCD47, das terminale Cysteinrückstände enthält, die über einen dualen 8-Amino-3,6-Dioxa-Octanoyl-Abstandser mit der Kernpeptidsequenz verbunden sind, über Disulfidbindungen an der Metalloberfläche befestigt. Diese Methode der Peptidbefestigung an der Metalloberfläche ist effizient und relativ kostengünstig und kann daher angewendet werden, um die Biokompatibilität mehrerer metallischer Biomaterialien zu verbessern.

Die Metalloberflächen werden thiol-reaktiv für die Peptidbefestigung durch eine Reihe chemischer Modifikationen gerendert, wie in Abbildung 1dargestellt. PaBT-Inkubation gefolgt von PEI-PDT-Behandlung macht die Metalloberfläche für Peptid-Befestigung zugänglich. Peptid CD47 (pepCD47) mit Cysteinrückstand am C-Terminus, der über eine flexible duale AEEAc-Brücke mit der Pepcd47-Sequenz verbunden ist, wird über Disulfidbindungen kovalent an den Thiol-reaktiven Oberflächen befestigt. M...

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Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Hier wird ein Protokoll zum Anhängen von Peptid CD47 (pepCD47) an Metallstents mit Polybisphosphonatchemie vorgestellt. Die Funktionalisierung von Metallstents mit pepCD47 verhindert die Anhaftung und Aktivierung von Entzündungszellen und verbessert so deren Biokompatibilität.

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

Dieses Protokoll enthält eine neuartige chemische Strategie zur Anhängung von therapeutischen Peptiden an metallische Oberflächen und hat das Potenzial, die Biokompatibilität einer vielzahl von metallischen Biomaterialien zu verbessern. Dies ist eine universelle und robuste Technik, um Peptide und therapeutische Proteine an die nackten Metalloberflächen von Bioimplantaten anzuhängen. Wir haben diese Technologie verwendet, um die Biokompatibilität von metallischen Stents durch anhängen CD47 Peptide zu verbessern, um die Entzündungsreaktionen zu verhindern, die durch Stenting ausgelöst werden.Beginnen Sie mit dem Waschen der Edelstahlfolien-Coupons oder Mesh-Scheiben mit 2-Isopropanol in einem Shaker für fünf Minuten. Führen Sie diese Wäsche zweimal, dann waschen Sie die Proben zweimal mit Chloroform für 10 Minuten pro Wäsche. Die gereinigten Edelstahlproben 30 Minuten lang in einen Ofen bei 220 Grad Celsius stellen.Die gebackenen Folien oder Netzscheiben in 0,5% wässrige Lösung von PABT eintauchen und eine Stunde lang in einem Shaker bebrüten. Waschen Sie die PABT-modifizierten Proben fünfmal mit entionisiertem destilliertem Wasser. Die Proben in eine neue Durchstechflasche übertragen und die Wässer wiederholen.Behandeln Sie die Proben mit TCEP 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Shaker. Degas enstilliertes destilliertes Wasser in einem runden Bodenkolben mit einer Vakuumerzeugungsvorrichtung, wie z. B. einem Lyophilisator, und waschen Sie die Folien oder Netzscheiben fünfmal mit dem entgasten Wasser. Übertragen Sie die Proben in eine neue Durchstechflasche und wiederholen Sie die Wähdaten.Bereiten Sie fünf Milliliter 1%PEI-PDT-Lösung vor, indem Sie 212,5 Mikroliter des Lagers PEI-PDT und 125 Mikroliter 0,4 Molnatriumacetat im entgasten Wasser verdünnen. Inkubieren Sie die gewaschenen Edelstahlproben mit 1%PEI-PDT. Ersetzen Sie Luft durch Argongas, versiegeln Sie die Fläschchen luftdicht und mischen Sie sie eine Stunde lang auf einem Shaker.Gehen Sie sofort mit der Peptidkonjugation vor oder lagern Sie die Proben bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie ein Milligramm pro Milliliter humanes Peptid CD47 Vorrat Lösung durch Auflösen humanes Peptid CD47 Pulver in entgaste 50%essigsäure, dann bereiten Sie die Arbeitslösung durch Auflösen 500 Mikroliter des Bestands in 4,5 Milliliter entgasten PBS. Die gewaschenen PEI-PDT-beschichteten Proben mit der Arbeitslösung von Peptid CD47 bei Raumtemperatur mit Schütteln für eine Stunde inkubieren.Waschen Sie nach Fertigstellung die Peptid-CD47-beschichteten Proben, wie im Textmanuskript beschrieben. Nach der Beschichtung der Metallfolien mit Peptid CD47 oder Rührpeptid, Viertelzoll-PVC-Rohre in drei 38 Zentimeter lange Stücke schneiden und bis zu acht unveränderte, verglaste Peptid- oder Peptid-CD47-modifizierte Metallfolien in drei verschiedene Röhren einsetzen. Sammeln Sie 30 Milliliter Blut von gesunden menschlichen Spendern frei von Anti-Thrombozyten-Medikamente, Vorbelastung der Spritze mit einem Milliliter 4%Natriumcitrat, um die Gerinnung des gesammelten Blutes zu verhindern.Legen Sie 10 Milliliter Blut in jede Röhre mit einer 10-Milliliter-Spritze und verbinden Sie die Enden mit Metalladaptern. Legen Sie die blutgefüllten Schläuche auf die Räder des Chandler-Schlaufesgeräts und leiten Sie das Blut vier Stunden lang durch Raddrehung bei 37 Grad Celsius an den Metallfolien vorbei. Das Blut aus den Röhrchen abtropfen lassen und gemäß den IRB-Anforderungen entsorgen, dann die Schläuche mit einem Skalpell schneiden, um die Folien zu holen.Bereiten Sie 2%glutaraldehydlösung vor, indem Sie die 70%-Lösung im Natriumkakodilatpuffer mit 0,1 Mol-Natriumchlorid verdünnen. Die Folien in der 2%glutaraldehyd-Lösung 15 Minuten lang inkubieren und bei vier Grad Celsius über Nacht lagern. Bevor Sie die Metallfolien analysieren, waschen Sie sie dreimal mit PBS.Acht Milliliter PBS in einem 37 Grad Celsius Wasserbad erwärmen. Bereiten Sie 10 Millimolar CFDA Farbstoff-Stock-Lösung durch Hinzufügen von 90 Mikroliter DMSO zu einer CFDA-Flasche, dann bereiten Sie die Arbeitslösung durch Zugabe von 75 Mikroliter des Lagers CFDA zu den warmen PBS. Invertieren Sie das Rohr ein paar Mal, um es zu mischen und mit Aluminiumfolie zu bedecken.Legen Sie jede Folie in einen Milliliter CFDA-Farbstoff in eine 24-Well-Platte. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und bebrüten Sie die Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, waschen Sie die Folien dann dreimal in PBS und stellen Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop ab. Die Konzentration des kovalent gebundenen TAMRA-konjugierten Peptids CD47 wurde quantifiziert, um die maximale Immobilisierungsdichte des Peptids auf der Metalloberfläche zu bestimmen.Die maximale Peptidretention betrug ca. 180 Nanogramm pro Zentimeter im Quadrat, was mit einer Eingangskonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter erreicht wurde. Die Immobilisierung des tAMRA konjugierten Peptids CD47 auf den modifizierten Metalloberflächen wurde durch die Fluoreszenzmikroskopie weiter bestätigt, die eine gleichmäßige Fluoreszenz zeigte, die von der Oberfläche der mit TAMRA konjugierten Peptid-CD47-behandelten Netzscheiben emittiert wurde. Nur minimale Fluoreszenz wurde auf der Oberfläche der Kontrollnetze nachgewiesen, denen die Änderung fehlte, wodurch ein nicht spezifisch gebundenes TAMRA-konjugiertes Peptid CD47 als Hauptquelle der Fluoreszenz ausgeschlossen wurde.Es wurde auch bestätigt, dass die Peptid CD47-beschichteten Oberflächen eine drastische Verringerung der blutübertragenen Zellanhaftung im Vergleich zu den rührmodifizierten und unveränderten Peptidkontrollen aufweisen. Monozyten, die aus rattenbuffy Coat-Zellen isoliert wurden, wurden auf blankem Metall und Peptid CD47-modifizierten Edelstahlfolien kultiviert. Eine 58%ige Dämpfung der akuten Monozytenanhaftung, ihre Umwandlung in Makrophagen und die Proliferation von Makrophagen wurde auf den funktionalisierten Oberflächen beobachtet.Beim Versuch dieses Protokolls ist es sehr wichtig, die Schritte mit entgastem Wasser oder Reagenzien durchzuführen, die so schnell wie möglich durchgeführt werden müssen, und die Exposition gegenüber Sauerstoff zu minimieren. Unsere Technologie moduliert selektiv die zelluläre Interaktion mit Metalloberflächen und ein typischer Zelltyp-Identifikationstest, wie RT-PCR, Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz, sind mit dieser Technik kompatibel. Wenn diese Technologie für eine Reihe von bioaktiven Peptid entwickelt wurde, kann sie zur Erhöhung der Biokompatibilität an der Gewebematerialschnittstelle beitragen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Methodenentwicklung für Blood Borne Makrophagen Beförderung von Nanoformulated antiretroviralen Medikamenten

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Forschung

Biotechnik

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Ferromagnetische Bare Metal Stent für Endothelzellen-Abscheidung und Retention

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Nasschemie und Peptid Immobilisation auf Polytetrafluoroethylen für verbesserte Zellhaftung

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Site-verwiesene Immobilisierung von Knochen morphogenetische Protein 2 an feste Oberflächen durch Click-Chemie

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...