Name: mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

פיתוח פרוטוקולים מחקרים שהוצגו בנייר זה נתמכו על ידי מימון NIH (NBIB) R01 (# EB023921) ל- IF ו- SJS, ומימון NIH (NHLBI) R01 (# HL137762) ל- IF ו- RJL.

כל הדגימות האנושיות לניסוי זה הושגו בהתאם ל-IRB של בית החולים לילדים של פילדלפיה. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור IACUC של בית החולים לילדים של פילדלפיה.
1. ציפוי משטחי מתכת חשופים עם PEI-PDT
<ol><li>לשטוף את קופוני רדיד פלדת אל-חלד (1 ס"מ x 1 ס"מ או 0.65 ס"מ x 1 ס"מ) או דיסקים רשת נ?...

<ol>
	<li>Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+managing+in-stent+restenosis:+a+review+of+clinical+data,+from+pathogenesis+to+treatment.">Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment.</a> Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).</li><li>van Oeveren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstacles+in+haemocompatibility+testing.">Obstacles in haemocompatibility testing.</a> Scientifica. 2013, 392584 (2013).</li><li>Mitra, A. K., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+stent+restenosis:+bane+of+the+stent+era.">In stent restenosis: bane of the stent era.</a> Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).</li><li>Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+stents:+historical+development,+current+status+and+future+directions.">Coronary stents: historical development, current status and future directions.</a> British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).</li><li>Hoffmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+and+mechanisms+of+in-stent+restenosis.+A+serial+intravascular+ultrasound+study.">Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).</li><li>Stefanini, G. G., Windecker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stent+thrombosis:+no+longer+an+issue+with+newer-generation+drug-eluting+stents.">Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents.</a> Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).</li><li>Palmerini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcomes+with+bioabsorbable+polymer-+versus+durable+polymer-based+drug-eluting+and+bare-metal+stents:+evidence+from+a+comprehensive+network+meta-analysis.">Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).</li><li>Omar, W. A., Kumbhani, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Current+Literature+on+Bioabsorbable+Stents:+a+Review.">The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review.</a> Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).</li><li>Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+the+Inflammatory+Response+to+Clinically+Relevant+Polymers+by+Manipulating+the+Host+Response+Using+ITIM+Domain-Containing+Receptors.">Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors.</a> Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).</li><li>Oldenborg, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells.">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li><li>vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+'self'+recognition:+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+CD47-modified+biomaterials+to+mitigate+the+immune+response.">The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response.</a> Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).</li><li>Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self+inhibition+of+phagocytosis:+the+affinity+of+'marker+of+self'+CD47+for+SIRPalpha+dictates+potency+of+inhibition+but+only+at+low+expression+levels.">Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).</li><li>Slee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+biocompatibility+of+CD47-functionalized+vascular+stents.">Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents.</a> Biomaterials. 87, 82-92 (2016).</li><li>Finley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).</li><li>Inamdar, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+bioactivity+of+pepCD47+attachment+on+stainless+steel+surfaces.">Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces.</a> Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+delivery+of+gene+vectors+from+bare-metal+stents+by+use+of+a+biodegradable+synthetic+complex+inhibits+in-stent+restenosis+in+rat+carotid+arteries.">Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries.</a> Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).</li><li>Moser, K. V., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+monocytes+migrate+through+a+BCEC-monolayer+and+express+microglia-markers+at+the+basolateral+side.">Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side.</a> Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).</li><li>vander Giessen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+inflammatory+sequelae+to+implantation+of+biodegradable+and+nonbiodegradable+polymers+in+porcine+coronary+arteries.">Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries.</a> Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).</li><li>Fishbein, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonate-mediated+gene+vector+delivery+from+the+metal+surfaces+of+stents.">Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).</li><li>Mouro-Chanteloup, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+red+cell+skeleton+protein+4.2+interacts+with+the+Rh+membrane+complex+member+CD47.">Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47.</a> Blood. 101 (1), 338-344 (2003).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).</li><li>Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+ex+vivo+Chandler+Loop+Apparatus+to+assess+the+biocompatibility+of+modified+polymeric+blood+conduits.">The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).</li></ol>

אנו מדגימים ומתארים אסטרטגיה כימית חדשנית יחסית לצרף moieties פפטיד טיפולית על משטח נירוסטה במטרה overarching של הפחתת תגובתיות פני השטח עם תאים דלקתיים נמצאו בדם. הכימיה ביספוספונט המתואר בזאת כרוך תיאום היווצרות קשר בין תחמוצות מתכת וקבוצות ביספוספונט של PABT. העובי של מונושכבה פוליביספונט נוצר ?...

התערבות כלילית מרדנית היא הקו הראשון של טיפול לטיפול במחלות עורקים כליליים (CAD) וכרוכה בעיקר בסטינג העורקים החולים. עם זאת, restenosis in-סטנט (ISR) ופקקת סטנט הם סיבוכים נפוצים הקשורים פריסת סטנט1. אינטראקציית דם בממשק סטנט הדם מאופיינת בהספיגה כמעט מיידית של חלבוני פלזמה על פני המתכת, ואחריו טסיות דם וחיבור תאי דלקתיותוהפעלה 2. שחרורו של ציטוקינות דלקתיות ו chemokines מתאי דלקתיים מופעלים מוביל לשינוי פנוטיפי של תאי שריר חלק כלי דם (VSMCs) בתקשורת tunica ומפעיל הנדידה הצנטריפטלית שלהם לתא אינטימי. התפשטות VSMC מופעל בתוצאות intima עיבוי שכבה אינטימית, לומן צמצום ו restenosis in-סטנט3. סטנטים לתרופה (DES) פותחו כדי למנוע התפשטות VSMC; עם זאת, תרופות אלה יש השפעה ציטוקסית מחוץ ליעד על תאי אנדותל4,,5. לכן, פקקת סטנט מאוחר הוא סיבוך נפוץ המשויך DES6,7. סטנטים עשויים פולימרים מתכלים, כגון poly-L-lactide הראו הבטחה רבה בניסויים בבעלי חיים וניסויים קליניים ראשוניים, אבל נזכרו בסופו של דבר כאשר השימוש הקליני "בחיים האמיתיים" הפגין נחיתותם 3rd דור DES8. לכן, יש צורך לשפר את התוואת הביולוגית של סטנטים מתכת חשופים לתוצאות טובות יותר של המטופל.
CD47 הוא חלבון transmembrane מבוטא בכל מקום המעכב את התגובה החיסונית המולדת כאשר קשור קולטן הקוניט שלה אות רגולציה חלבון אלפא (SIRPα)9. קולטן SIRPα יש תא חיסוני מעכב טירוסין מוטיב (ITIM) תחום ואת אירועי איתות על SIRPα - אינטראקציה CD47 בסופו של דבר לגרום ל downregulation של הפעלת תאים דלקתיים10,,11,,12,,13. מחקרים במעבדה שלנו הראו כי CD47 רקומביננטי או נגזרת פפטיד שלה, המקביל 22 חומצת אמינו איג תחום של האזור החוץ תאי של CD47 (pepCD47), יכול להפחית את התגובה החיסונית המארח למגוון של חומרים ביולוגייםרלוונטיים קלינית 14,15,,16. לאחרונה, הוכחנו כי pepCD47 יכול להיות משותק למשטחי סטנט נירוסטה ולהפחית באופן משמעותי את התגובה הפתופיזיולוגית הקשורים restenosis. שים לב, pepCD47 משטחים שונה הם מותאים לתנאי שימוש רלוונטיים כגון אחסון לטווח ארוך ועיקור תחמוצת אתילן17. כתוצאה מכך, pepCD47 עשוי להיות יעד טיפולי שימושי כדי לטפל במגבלות הקליניות של סטנטים אנדווסקולריים.
האסטרטגיה עבור ההחזקה הקוולנטית של pepCD47 למשטח מתכת כרוכה בסדרה של שינויים כימיים חדשניים של פני המתכת. משטחי מתכת מצופים תחילה ביספוספונט פוליאלילמין עם קבוצות thiol סמוי (PABT) ואחריו פירוק של thiols וחיבור של פוליאתילן (PEI) עם קבוצות פיריילדיתיו מותקן (PDT). קבוצות PDT של PEI לא קוסם בתגובה עם thiols PABT לא מוגן לאחר מכן מגיבים עם pepCD47 שילוב תיול במסוף שאריות ציסטאין, וכתוצאה מכך pepCD47 מחייב על פני משטח המתכת באמצעות אג"ח disulfide14,17,18. השתמשנו pepCD47 פלואורופור התואם (TAMRA-pepCD47) כדי לקבוע את ריכוז הקלט של פפטיד שתוצאות אי-תנועה המרבית של פני השטח של פפטיד. לבסוף, הערכנו את הקיבולת האנטי דלקתית חריפה וכרונית של משטחי מתכת מצופים pepCD47, ex vivo, באמצעות חלונית לולאה צ'נדלר, וחיבור מונוציט / התרחבות מקרופאג', בהתאמה.
נייר זה מספק פרוטוקול שיטתי לחיבור פפטידים thiolated על פני משטח המתכת; קביעת צפיפות ההשתקה המרבית של הפפטיד; והערכת המאפיינים האנטי דלקתיים של משטחי מתכת מצופים pepCD47 חשופים לדם שלם ומונוציטים מבודדים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="833">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1 M Tris-HCL</td>
			<td style="width:184px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">15567-027</td>
			<td style="width:239px;">pH - 7.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">4% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">16539-07</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">4% Sodium Citrate</td>
			<td style="width:184px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">S5770</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:184px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">118-156-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">202301</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">203501</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)</td>
			<td style="width:184px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">550979</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)</td>
			<td style="width:184px;">BioRad</td>
			<td style="width:129px;">MCA341</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)</td>
			<td style="width:184px;">Biolegend</td>
			<td style="width:129px;">201701</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform Certified ACS</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Dimethyl Formammide (DMF)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">39117</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Embra stainless steel grid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">E200-SS</td>
			<td>stainless steel mesh mesh disks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ficoll Hypaque</td>
			<td style="width:184px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:129px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:184px;">ACROS organic</td>
			<td style="width:129px;">148930025</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">goat anti-mouse IgG Alexa Fluor</td>
			<td style="width:184px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:129px;">A11030</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:184px;">Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:129px;">402-01</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human pepCD47</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4099101</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">A426P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Metal adapters</td>
			<td style="width:184px;">Leur Fitting</td>
			<td style="width:129px;">6515IND</td>
			<td style="width:239px;">1 way adapter 316 ss 1/4&#34;-5/16&#34; hoes end</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Methanol</td>
			<td style="width:184px;">RICCA chemical company</td>
			<td style="width:129px;">4829-32</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Microscope</td>
			<td style="width:184px;">Nikon Eclipse</td>
			<td style="width:129px;">TE300</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pottasium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td style="width:129px;">P184-500</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">PVC tubes</td>
			<td style="width:184px;">Terumo-CVS</td>
			<td style="width:129px;">60050</td>
			<td style="width:239px;">1/4&#34; X 1/16 8&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chloride</td>
			<td style="width:184px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:129px;">11653</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">161-0302</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Sodum actetate (C2H3NaO2)</td>
			<td style="width:184px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:129px;">A13184</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Src peptide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4092599</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumen</td>
			<td>Microgroup, Medway, MA</td>
			<td style="width:129px;">20097328</td>
			<td>1 cm X 6 mm OD</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Stainless steel foils (AISI 316L)</td>
			<td style="width:184px;">Goodfellow, Coraopolis, PA</td>
			<td style="width:129px;"></td>
			<td style="width:239px;">100 mm X 100 mm X 0.05 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:282px;">Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)</td>
			<td>Bachem</td>
			<td style="width:129px;">4100277</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:282px;">TMB (3,3&#8217; ,5,5&#8217; -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82089</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Tween-20</td>
			<td style="width:184px;">Bio-Rad laboratories</td>
			<td style="width:129px;">170-6531</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">V12883</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitigation of blood borne cell attachment to metal implants through cd47-derived peptide immobilization

הסיבוכים העיקריים הקשורים סטנטים מתכת חשופים סטנטים מבריחים סמים הם restenosis ב סטנט ופקקת סטנט מאוחר, בהתאמה. לכן, שיפור התוואת הביולוגית של סטנטים מתכת נשאר אתגר משמעותי. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר טכניקה חזקה של שינוי פני משטח מתכת על ידי פפטידים פעילים ביולוגית כדי להגביר את תאימות ביולוגית של דם יצירת קשר עם שתלים רפואיים, כולל סטנטים אנדווסקולריים. CD47 הוא סמן אימונולוגי ספציפי למינים של עצמי ויש לו תכונות אנטי דלקתיות. מחקרים הראו כי פפטיד חומצת אמינו 22 המתאים לתחום Ig של CD47 באזור חוץ תאי (pepCD47), יש תכונות אנטי דלקתיות כמו חלבון באורך מלא. במחקרי vivo בחולדות, ובדיקות ויוו לשעבר במערכות ניסוי ארנב ודם אנושי מהמעבדה שלנו הראו כי pepCD47 immobilization על מתכות משפר את תאימות ביולוגית שלהם על ידי מניעת חיבור והפעלה של תאים דלקתיים. נייר זה מתאר את פרוטוקול שלב אחר שלב עבור פונקציונליזציה של משטחי מתכת וקובץ מצורף פפטיד. משטחי מתכת משתנים באמצעות ביספוספט פוליאלילמין עם קבוצות תיול סמוי (PABT) ואחריו פירוק של thiols והגדלה של אתרים תגובתיים תיול באמצעות תגובה עם פוליאתילן מותקן עם קבוצות pyridyldithio (PEI-PDT). לבסוף, pepCD47, שילוב שאריות ציסטאין מסוף המחוברים לרצף פפטיד הליבה באמצעות כפול 8-אמינו-3,6-dioxa-אוקטנויל spacer, מחוברים על פני המתכת באמצעות איגרות חוב disulfide. מתודולוגיה זו של חיבור פפטיד למשטח מתכת היא יעילה וזולת יחסית ולכן ניתן ליישם כדי לשפר את התואם הביולוגי של מספר חומרים ביולוגיים מתכתיים.

משטחי מתכת מעובדים thiol-תגובתי עבור חיבור פפטיד באמצעות סדרה של שינויים כימיים, כפי שמוצג איור 1. דגירה PABT ואחריו טיפול PEI-PDT עושה את פני המתכת ניתן לחיבור פפטיד. פפטיד CD47 (pepCD47) המכיל שאריות ציסטאין ב C-terminus הצטרף לרצף פפסיק47 הליבה באמצעות גשר AEEAc כפול גמיש מחובר באופן קוולנטי ל?...

Watch this Scientific Journal Video about Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization at JoVE.com

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

מוצג כאן פרוטוקול לציריפת פפטיד CD47 (pepCD47) סטנטים מתכת באמצעות כימיה פוליביספוספונט. פונקציונליזציה של סטנטים מתכת באמצעות pepCD47 מונע את ההחזקה וההפעלה של תאים דלקתיים ובכך לשפר את תאימות ביולוגית שלהם.

הקלת הדם נישא תא מצורף שתלים מתכת באמצעות CD47 נגזר פפטיד אימוביליזציה

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

פרוטוקול זה כולל אסטרטגיה כימית חדשנית לצירוף פפטידים טיפוליים למשטחים מתכתיים, ויש לו פוטנציאל לשפר את התאם הביולוגי של מגוון רחב של ביו-חומרים מתכתיים. זוהי טכניקה אוניברסלית וחזקה לצרף פפטידים וחלבונים טיפוליים למשטחי המתכת החשופים של ביואימפלנטים. השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לשפר את תאימות הביולוגית של סטנטים מתכתיים על ידי צירוף פפטידים CD47 על מנת למנוע את התגובות דלקת המופעלות על ידי סטנטים.התחל על ידי שטיפת קופונים רדיד נירוסטה או דיסקים רשת עם 2-isopropanol בשייקר במשך חמש דקות. בצע שטיפה זו פעמיים, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות פעמיים עם כלורופורם במשך 10 דקות לכל לשטוף. מניחים את דגימות נירוסטה נקי בתנור ב 220 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.טובלים את רדידים אפויים או דיסקי רשת ב 0.5% פתרון מים של PABT ו דגירה אותם בשייקר במשך שעה אחת. שטפו את הדגימות שעברו שינוי PABT עם מים מזוקקים שעברו דה-יון חמש פעמים. מעבירים את הדגימות לבקבוקון חדש וחוזרים על השטיפה.לטפל בדגימות עם TCEP במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר. דגה deionized מים מזוקקים בבקבוקון תחתון עגול עם מכשיר יצירת ואקום, כגון ליופילייזר, ולשטוף את רדידים או דיסקים רשת עם מים degassed חמש פעמים. מעבירים את הדגימות לבקבוקון חדש וחוזרים על השטיפה.הכן חמישה מיליליטר של 1%PEI-PDT פתרון על ידי דילול 212.5 microliters של המניה PEI-PDT ו 125 microliters של 0.4 אצטט נתרן טוחנת במים degassed. הדגירה דגימות נירוסטה שטף עם 1%PEI-PDT. מחליפים את האוויר בגז ארגון, אוטמים את הבקבוקונים אטומים ומערבבים אותם על שייקר למשך שעה.המשך מיד עם ההטיה פפטיד או לאחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. הכינו מיליגרם אחד למיליליטר של פפטיד אנושי CD47 על ידי המסת אבקת פפטיד CD47 אנושית בחומצה אצטית 50%, ולאחר מכן הכינו את פתרון העבודה על ידי המסת 500 מיקרוליטרים של המניה ב-4.5 מיליליטר של PBS מפונק. הדגירה דגימות מצופות PEI-PDT שטף עם פתרון העבודה של CD47 פפטיד בטמפרטורת החדר עם רועד במשך שעה אחת.בסיום, שטפו את הדגימות מצופות הפפטיד CD47 כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר ציפוי רדידי המתכת עם פפטיד CD47 או פפטיד מקושקשות, חותכים צינורות PVC בגודל רבע אינץ' לשלוש חתיכות באורך 38 ס"מ ומכניסים עד שמונה פפטיד מקושקשות ללא שינוי או פפטיד CD47 שונה לשלושה צינורות שונים. לאסוף 30 מיליליטר של דם מתורמים אנושיים בריאים ללא תרופות נגד טסיות דם, מראש טעינת המזרק עם מיליליטר אחד של 4% נתרן ציטראט כדי למנוע קרישה של הדם שנאסף.שים 10 מיליליטר של דם לתוך כל צינור באמצעות מזרק 10 מיליליטר ולחבר את הקצוות עם מתאמי מתכת. מניחים את הצינורות המלאים בדם על גלגלי מנגנון לולאת צ'נדלר ומעבירים את הדם לאורך רדידים מתכת על ידי סיבוב גלגל ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. מסננים את הדם מהצינורות ולהיפטר ממנו על פי דרישות IRB, ואז לחתוך את הצינורות עם אזמל כדי לאחזר את רדידים.הכן 2%glutaraldehyde פתרון על ידי דילול 70% פתרון במאגר ק קוריקט נתרן עם 0.1 נתרן כלורי טוחן. הדגירה את רדידים בתסכום 2% glutaraldehyde במשך 15 דקות ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס לילה. לפני ניתוח רדידים מתכת, לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS.חם שמונה מיליליטר של PBS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הכן פתרון מלאי צבע CFDA 10 מילימולאר על ידי הוספת 90 microliters של DMSO לבקבוקון CFDA אחד, ולאחר מכן להכין את הפתרון עובד על ידי הוספת 75 microliters של CFDA המניה PBS חם. להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב ולכסות אותו עם רדיד אלומיניום.מניחים כל רדיד אלומיניום למיליליטר אחד של צבע CFDA בצלחת 24 באר. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדרגים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ואז שוטפים את הרדידים שלוש פעמים ב-PBS ומדמיין אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי. הריכוז של פפטיד פפטיד אצמוי טמרה כבול באופן קוולנטי CD47 היה מכומת כדי לקבוע צפיפות קיבוע מקסימלית של הפפטיד על פני המתכת.שימור פפטיד מקסימלי היה כ 180 ננוגרם לס"מ בריבוע, אשר הושג עם ריכוז קלט של 100 מיקרוגרם למיליליטר. קיבוע של פפטיד טמרה אציבה CD47 על משטחי מתכת שונה היה מאומת עוד יותר על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות, אשר הראה פלואורסצנטיות אחידה הנפלטת מפני השטח של תקליטורי רשת פפטיד אצטראד TAMRA הוסיף 47 מטופלים. רק פלואורסצנטיות מינימלית זוהתה על פני השטח של רשתות הבקרה שלא היו חסרות את השינוי, ובכך לא כולל פפטיד טמרה לא קשור במיוחד CD47 כמקור העיקרי של פלואורסצנטיות.זה גם אושר כי משטחים מצופים CD47 פפטיד להראות ירידה דרסטית בהחזקת תאים המועברים בדם לעומת פקדי פפטיד מקושקשות שונה ללא שינוי. מונוציטים מבודדים מתאים מעיל באפי חולדה היו מתורבתים על מתכת חשופה פפטיד CD47 שונה רדידים נירוסטה. נחיתה של 58% של התקשרות מונוציטים חריפה, המרתם למאקרופאגים והתפשטות מקרופאג נצפתה על המשטחים הפונקציונליים.בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב מאוד לבצע את השלבים הכרוכים במים מגזים או רייגנטים להתבצע מהר ככל האפשר כדי למזער את החשיפה לחמצן. הטכנולוגיה שלנו מווסתת באופן סלקטיבי את האינטראקציה התאית עם משטחי מתכת וראיה אופיינית לזיהוי סוגי תאים, כגון RT-PCR, ציטומטריית זרימה ושפעת חיסונית, תואמים לטכניקה זו. כאשר פותח עבור מגוון של פפטיד ביואקטיבי, טכנולוגיה זו יכולה להיות אינסטרומנטלית בהגדלת תאימות ביולוגית בממשק חומר הרקמה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

שיטות פיתוח תובלה דם ברנה macrophage של תרופות תרופתי Nanoformulated

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

דור ושחזור של spheroids β-תא מהידרוג שלב צמיחת PEG-פפטיד

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Graphene Coatings for Biomedical Implants

ציפוי גרפן עבור שתלים ביו

Atomically smooth graphene as a surface coating has potential to improve implant properties. This demonstrates a method for coating nitinol alloys with ...

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

Bare Metal פרומגנטי סטנט ללכיד תא האנדותל ושייר

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

כימיה רטובה פפטיד קיבוע על polytetrafluoroethylene עבור Cell-הדבקה משופרת

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

האתר מכוון הנייח של עצם Morphogenetic חלבון 2 משטחים מוצקים על ידי לחץ על כימיה

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...